广州市第一人民医院 骨科 510180
【摘 要】 目的 利用转录组测序及体外细胞实验检测吴茱萸碱对骨肉瘤HOS细胞株体外增殖能力的影响，探讨其可能的抗骨肉瘤机制。方法 通过利用0、3、6、12μmol/L浓度吴茱萸碱处理HOS细胞48h后，更换不含药物的完全培养基继续培养7d，然后染色固定，观察细胞形成的情况。用3μmol/L的吴茱萸碱处理HOS细48h后，提取并处理总RNA后得到目标mRNA，上机进行转录制测序，RT-PCR法检测HOS细胞中经转录组测序得到的差异表达基因，并检测未经药物处理的人骨肉瘤细胞株MG63、HOS、U2OS细胞中相应基因的表达量。结果 3、6、12μmol/L的吴茱萸碱可明显减少HOS细胞的集落形成能力，呈剂量依赖性抑制其体外增殖能力。通过RNA-seq技术总共检测到16，220个基因。对照组和处理组中独特表达的基因数分别为366和826。基于倍数变化（FC）> 2，P <0.05的标准，发现210个差异表达的基因。3μmol/L吴茱萸碱处理HOS细胞0、24、48、72h，对差异表达基因进行RT-PCR验证，结果发现ZMAT3、PLK-1、CDKN2C、CDKN2D、FAS均有不同程度的表达增高，差异有统计学意义（P<0.01）。
【关键词】 吴茱萸碱；转录组测序；人骨肉瘤HOS细胞；增殖
Transcriptome sequencing and cytology experiments reveal that evodiamine inhibits human osteosarcoma cell proliferation
XU Huihua，SU Wenzhou，CHEN Cunte，ZHU Jianwei，LIU Shihong，LUO Shiyong，HUANG Zhitong，GUO Qifeng
First-author's address：Guangzhou First People's Hospital，Guangzhou，510180，China
【Abstract】 Objective Using transcriptome sequencing and in vitro cell assay to detect the effect of evodiamine on proliferation in osteosarcoma HOS cell line，and to explore its possible anti-osteosarcoma mechanism. Methods HOS cells were treated with evodiamine at 0，3，6，and 12 μmol/L for 48 hours，and then cultured in complete medium without drug for seven days，and then stained and fixed to observe the formation of cells. HOS was treated with 3 μmol/L of evodiamine for 48 h，and the total RNA was extracted and treated to obtain the target mRNA，which was sequenced on the machine. After treatment with 3μmol/L evodiamine for 48h，the differentially expressed genes obtained by transcriptome sequencing in HOS cells were detected by RT-PCR，and the corresponding genes in human osteosarcoma cell lines MG63，HOS and U2OS without drug treatment were detected. The amount of expression. Results 3，6，12μmol/L evodiamine can significantly reduce the colony forming ability of HOS cells and inhibit its proliferation in vitro in a dose-dependent manner. A total of 16，220 genes were detected by RNA-seq technology. The number of genes uniquely expressed in the control and treatment groups were 366 and 826，respectively. Based on the criteria for fold change（FC）> 2，P < 0.05，210 differentially expressed genes were found.HOS cells were treated with 3μmol/L evodiamine for 0，24，48，72h.. The differentially expressed genes were verified by RT-PCR. The results showed that ZMAT3，PLK-1，CDKN2C，CDKN2D and FAS had different degrees of expression，and the difference was statistically significant（P<0.01）.
【Key words】Evodiamine；Transcriptome sequencing；Human osteosarcoma HOS cells； Proliferation；
骨肉瘤是儿童和青少年最常诊断的骨原发性恶性肿瘤。骨肉瘤病因尚未完全明确，遗传畸变可能是发生骨肉瘤的重要因素之一[1]。早期骨肉瘤的治疗主要取决于手术切除，导致5年生存率低于20％。新辅助化疗药物的引入及发展使得骨肉瘤患者的预后得到改善[2]，用于治疗骨肉瘤的标准化疗方案为多柔比星、甲氨蝶呤加上顺铂等新辅助化疗组合[3]。即使有了这些干预措施，骨肉瘤患者的临床治疗结果在近30年来没有得到显着改善[4]。有效的化疗药物是提高患者临床治疗效果的重要途径，因此，迫切需要开发更多的高效化疗药物。
吴茱萸碱是传统中药吴茱萸中主要的成分，在中医治疗中有广泛的药理作用[5]。吴茱萸碱具有广泛而强大的抗肿瘤活性，抗肿瘤谱包括胃癌、结肠癌、肝癌、肺癌等[5-7]。吴茱萸碱在骨肉瘤的作用机制目前尚未研究清楚，在本文中我们利用转录组测序和体外细胞实验来探讨吴茱萸碱对骨肉瘤HOS细胞增殖、周期的变化，为吴茱萸碱抗骨肉瘤提供新的证据。
1.材料与方法
1.1 实验材料
人骨肉瘤细胞株HOS细胞购自中科院上海细胞库；吴茱萸碱（MCM美国）；MEM培养基、青霉素-链霉素双抗溶液（美国GIBCO公司）；细胞周期检测试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司）；TRIzol Reagent（Ambion）；逆转录试剂盒、扩增试剂盒（美国Takara）；胰蛋白酶（Gibco 加拿大）；结晶紫溶液（碧云天生物科技公司）。
1.2 方法
1.2.1 人骨肉瘤HOS细胞培养 人骨肉瘤HOS细胞的培养条件为37℃、湿度95%、CO2含量5%的恒温培养箱环境。所用的完全培养基为含有10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素双抗溶液的MEM培养基。细胞培养隔天更换培养基，两天传代一次，传代比例为1：2。
1.2.2 集落形成实验 铺板当天取处于对数生长期的HOS细胞，按5x10^3个/孔的细胞数接种到六孔板中，过夜待细胞完全贴壁，更换含有3μM吴茱萸碱的完全培养基，药物处理48h后完全培养基继续培养7d，中间每两天更换一次不含药物的完全培养基。7天后用75%的乙醇固定后，结晶紫染色并拍照。
1.2.3 转录组测序 取处于对数生长期的HOS细胞，常规消化后计数，用10cm培养皿进行细胞培养，每皿加入2x10^7个细胞及足量完全培养基，置于恒温培养箱中进行培养过夜待细胞贴壁后更换含3μM的药物培养基继续培养。8h后终止培养，并加入适量TRIzol提取总RNA。利用mRNA富集法对处理已获得的总RNA，经过一系列处理得到单链环状DNA文库，最后进行上机测序。
1.2.4 RT-PCR验证转录组测序得到的差异表达基因 将提前调整好生长状态处于对数生长期的细胞，常规消化计数后，按2x10^6个/皿的细胞数接种于6cm皿中。待细胞贴壁后更换含3μM药物的完全培养基，药物处理48h后加入适量TRIzol提取总RNA。随后对得到的RNA进行逆转录和扩增。
2.统计分析
实验数据以均数±标准差（）表示。用SPSS 22.0或GraphPad Prism 5进行统计分析。多组之间的比较用单因素分析，P<0.05表示差异具有统计学意义。
3 结果
3.1 集落形成试验观察吴茱萸碱对HOS细胞体外增殖能力的影响 我们用吴茱萸碱的不同药物浓度（0、3、6、12μM）作用于人骨肉瘤HOS细胞48h，然后固定细胞并用结晶紫染色进行染色。结果显示：对照组肉眼可见大量紫色细胞集落，部分融合成片；与对照组相比较，各处理组形成的集落明显减少，分布稀疏；随着药物浓度增加，肉眼可见的细胞集落逐渐减（图1）。
图1. 吴茱萸碱处理48h，更换不含药物的完全培养基继续培养7d，固定并染色后各浓度组集落形成的变化情况。
3.2 转录组测序检测吴茱萸碱对HOS细胞株转录组基因的影响 基于上述集落形成试验的结果，我们选用3μM的药物浓度作用48h，收集处理组（3μM）及对照组（0μM）样品进行转录组测序。通过RNA-seq技术总共检测到16，220个基因，对照组和处理组中独特表达的基因数分别为366个和826个。基于倍数变化（FC）> 2，P <0.05的标准，发现210个差异表达的基因（图2）。对这些差异表达基因进行 GO富集显示，这些差异表达的基因参与细胞组分的组成，包括纺锤体，动粒体，浓染色体，染色体，着丝粒区域。分子功能主要涉及不同酶和蛋白质的结合，例如蛋白激酶结合，蛋白质结合，激酶结合，酶结合和生长因子结合。此外，这些差异表达的基因参与的生物过程包括：有丝分裂细胞周期，染色体分离和细胞分裂。KEGG途径富集表明这些基因的调节途径包括VEGF信号传导途径，P53信号传导途径，坏死性凋亡和细胞周期（图3）。
图3. 差异表达基因的GO富集和KEGG富集分析。
a. GO富集分析差异表达基因参与的生物学过程。b. GO富集分析差异表达基因参与的细胞组分分布。
c. KEGG富集分析差异表达基因参与的细胞通路。d. GO富集分析差异表达基因的分子功能。
3.3 RT-PCR验证差异表达基因 通过转录组测序得到了多个差异表达基因，这里选取了其中的CDC20、ZMAT3、PLK-1、IGFBP6、IGFBP5、TTK、CDKN2C、CDKN2D、FAS进行qPCR验证，结果发现ZMAT3、PLK-1、CDKN2C、CDKN2D、FAS均有不同程度的表达增高，差异有统计学意义（**P<0.01），其中以PLK-1表达增高最明显（图8a）。表明吴茱萸碱可以调节HOS细胞转录组基因的表达。随后在正常人成骨细胞hFOB1.19、未经吴茱萸碱处理的人骨肉瘤MG63、HOS、U2OS细胞株再次检测PLK-1、FAS、ZMAT3三个基因的表达情况（图8b）。结果发现，与hFOB1.19比较，PLK-1、FAS、ZMAT3基因在三株人骨肉瘤细胞中均为低表达，差异有统计学意义（P<0.05），表明吴茱萸碱可诱导PLK-1、FAS、ZMAT3基因在三株人骨肉瘤细胞中高表达。
图5. RT-PCR法验证转录组测序差异表达基因。
a. 吴茱萸碱处理骨肉瘤HOS细胞48小时后，验证转录组测序差异表达基因的表达变化。 b. 差异表达基因FAS、PLK-1、ZMAT3在正常人成骨细胞hFOB1.19、人骨肉瘤MG63、HOS、U2OS细胞中的表达情况。
*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001 VS Con。
4.讨论
抗肿瘤药物发挥抗肿瘤活性有很多种方式，可以通过细胞毒作用使细胞发生坏死，或者通过诱导细胞发生凋亡、阻滞细胞周期等方式发挥相应作用。吴茱萸碱是一种吲哚类生物碱，Liao等发现吴茱萸碱对人多重耐药性肿瘤异种移植物的抗肿瘤活性优于紫杉醇。研究发现吴茱萸碱可以增加化疗耐药的乳腺癌细胞对阿霉素敏感性，而且对正常人外周血细胞几乎没有毒性[8]。由此可见吴茱萸碱有发展成为抗肿瘤药物的潜力。
在我们的实验中，对差异表达基因进行GO富集分析发现吴茱萸碱主要影响细胞周期相关的基因表达，以及细胞周期和有丝分裂过程；而在KEGG途径富集分析中发现吴茱萸碱主要涉及的调节途径也是细胞周期相关，同时也与VEGF途径、P53途径相关。以上结果表明吴茱萸碱主要通过阻滞细胞周期于G2M期发挥其抗肿瘤作用。
Plk1是参与细胞分裂的保守蛋白激酶家族（Plk1-5）之一，是经典的致癌基因，特异性抑制Plk1的抑制剂是针对某些肿瘤类型的新的治疗策略[9-10]。Guillermo de Cárcer等发现Plk1过表达在体外和体内都起着肿瘤抑制剂的作用。PLK1过度表达与ER阴性和Her2阳性患者的预后更好相关[11]。
本实验结果显示，吴茱萸碱可以使HOS细胞内PLK-1基因高表达，而后续检测发现，与人正常成骨细胞hFOB1.19比较，PLK-1在未经吴茱萸碱处理的人骨肉瘤HOS、MG63、U2OS三株细胞中均为低表达，说明吴茱萸碱可以特异性过表达PLK-1，这可能与吴茱萸碱的抗肿瘤作用有直接的关系。
总而言之，我们发现吴茱萸碱可以抑制骨肉瘤细胞的增殖能力。首次运用转录组测序对吴茱萸碱处理后的HOS细胞转录组基因进行检测分析，并发现吴茱萸碱可以使PLK-1基因过表达。PLK-1可能扮演着抗肿瘤基因的作用，这与传统认为它是致癌基因的观点相反，PLK-1可能是吴茱萸碱抗骨肉瘤的新靶标，后续将作更深入的研究。
参考文献：
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论文作者:徐绘华1,苏文洲2,陈存特3,刘四红4,朱建伟5,
论文发表刊物:《中国蒙医药》2019年第5期
论文发表时间:2019/9/6
标签：吴茱萸论文; 细胞论文; 基因论文; 转录论文; 差异论文; 培养基论文; 骨肉瘤论文; 《中国蒙医药》2019年第5期论文;