杨梁[1]2002年在《辣椒再生体系的建立及其遗传转化的研究》文中研究指明辣椒再生体系的建立及其遗传转化的研究(摘要) 本文系统研究了影响辣椒组织培养的诸因素，建立了辣椒子叶的高频再生系统。以辣椒子叶为材料，通过与根癌农杆菌进行叶盘共培养建立了辣椒的遗传转化体系，并将反义磷脂酶D_γ基因转入辣椒。 1、辣椒再生体系的建立： (1)芽的诱导 根据前人的研究，我们以子叶为外植体，采用MS基本培养基，诱导辣椒芽分化。研究6-BA／IAA配比和GA_3、AgNO_3、苗龄、光暗处理、培养基pH、蔗糖浓度、叶片接种密度以及不同有机类型等因素对芽分化的影响。并对辣椒子叶培养中出现的褐化问题进行了探讨。结果表明，较高的6-BA／IAA配比有利于芽的分化。6-BA／IAA配比大于等于10并且6-BA浓度相对较高时，均可得到高于50％的出芽率。6-BA浓度对辣椒芽的分化影响很大。低浓度(3mg／L以下)的6-BA难以抑制根的分化。对辣椒的芽分化而言，加入一定量的IAA可促进芽的分化。在MS+6-BA5.5mg／L+IAA 0.5mg／L的培养基上，辣椒子叶芽分化率最高，达80％，由此确定该培养基为诱导芽分化的最适培养基。GA_3在芽分化中的作用较复杂。一方面，GA_3可缩短出芽的时间，使出芽时间提前3-5天，而且分化芽节间有明显的伸长。另一方面，GA_3降低了芽分化率(降至60％左右)，诱导出的不定芽长势较差，生长困难。实验发现，加入硝酸银可缩短芽诱导所需时间1-2天，芽最初生长加快。低浓度硝酸银对芽的诱导影响不大，较高浓度的硝酸银对芽的诱导不利。本实验中无需加入GA_3和硝酸银。实验结果表明苗龄介于11—15天，叶片接种密度为10片／皿，蔗糖浓度为30g／L，出芽率最高，达80％以上。芽分化对pH有较大的适应范围，一定范围内pH的变化不会影响芽的再生。PH值为5.8对辣椒子叶芽的分化是适宜的。暗处理不利于辣椒的再生。较弱光照对辣椒芽分化有利，较强的光照对芽再生有一定程度的阻碍。光强以1000lux为宜。组织培养中常发生褐化现象，添加抗氧化剂还是采用改进措施，都能一定程度上减轻褐化现象，但不能从根本上解决褐化问题。在辣椒的组织培养中，选用酚类氧化物含量较低的品种十分关键。采用MS有机、B5有机和ZH有机均可获得较高的芽分化率和芽分化数。 (2)芽的伸长 辣椒再生中，最大的困难在于芽的伸长。激素组合(6-BA5mg／L，IAA0.4mg／L)，芽生长旺盛的百分率最高，效果较理想，可基本满足芽正常生长对激素的需求。添加GA_3，浓度为4mg／L，芽伸长效果最好。最终确定(6-BA5.0mg／L，IAA0.4mg／L，GA_3 4mg／L)为芽伸长的最适激素组合。ZH有机是在MS有机基础上，烟酸用量加倍，并添加叶酸和生物素而成。辣椒的芽伸长阶段，ZH有机上芽伸长率远远高于MS有机，说明ZH有机的确可促进了芽的正常伸长。最终确定最适的芽伸长培养基为MS盐+ZH有机+6-BA 5.0mg／L+IAA 0.4mg／L+GA_34mg／L。芽伸长阶段，环境条件影响极大。环境条件主要包括培养基硬度和叁角瓶中的空气湿度。琼脂用量为4.5g／L，采用塑料薄膜封口，可基本达到芽迅速伸长所需的环境条件，伸长效果明 山东农业大学硕士学位论文3 显。 （3）伸长芽生根 在辣椒芽的生根上，l／ZMS培养基优于 MS培养基，IAA优于 NAA，低浓度的 IAA优于高浓度的！AA。l厘MS培养基＋mAO．ling／L上生根效果较好，最终确定该 培养基为最适的生根培养基。 2、辣椒遗传转化体系的建立。 门）各因素对辣椒遗传转化的影响 结果表明：400rug／L的头抱霉素可有效抑制农杆菌的生长，同时对子叶的分化 影响不大。卡那霉素浓度为 20mg／L，辣淑芽的分化被完全抑制，芽分化率为 0％， 此浓度可作为选择压。处于对数生长期的农杆菌稀稀释到原浓度的l／2，侵染子叶5 分钟可获得较理想的效果，抗性芽再生率达20％。预培养卜 天能有效提高抗性芽 分化率。随着延迟选择时间的增加，转化再生率呈现先升后降的趋势，7天为最佳 延迟选择时间。共培养时间是影响转化率的重要因素。在固体培养基上共培养一大 抗性芽分化率最高，延长共培养时间，分化率呈下降趋势。 （2）辣椒遗传转化体系建立 外植体首先在芽分化培养基上预培芽2天，然后感染含有反义磷脂酶DY基因 的根癌农杆菌，放回原培养基中于暗处共培养 18－20 ，J＼时，除菌后移入附加 400mg／L 头抱霉素的芽分化培养培养基中培养 7天，之后移入附加 400mg／L头抱霉素，20mg／Lg／L 卡那霉素的芽分化培养基中进行选择培养，转化芽在含有相同浓度的头抱霉素和卡 那霉素的伸长培养基中伸长至2－3cm时，移入含与上相同浓度的头抱霉素和卡那霉 素的生根培养基中生根。 3、转基因植株的检测。 对辣椒转化植株的检测主要采用PCR方法。以抗性植株的总DNA为模板，以 质粒DNA为阳性对照，以未转基因植株为阴性对照，
敬国兴[2]2007年在《抗真菌叁价载体转化辣椒的研究》文中进行了进一步梳理辣椒是一种重要的蔬菜作物和调料品，营养丰富经济价值高，深受人们的喜爱。但由于各种病害的危害，辣椒的产量和品质受到严重的影响。因此提高辣椒抗病性是十分重要的研究课题，通过常规育种手段选育高抗、优质、高产品种难度大、耗时长。植物基因工程技术的发展与完善，为作物的遗传改良提供了新的策略和强有力的工具。辣椒基因工程方面的研究已经取得了一些成就，但进展缓慢，离体再生困难和遗传转化率太低是限制其发展的两大因素。本研究以产量较高的常规品种(保加利亚尖椒和赤研6号)的子叶为主要实验材料，分别就各种影响其离体再生的因素进行了研究，建立了辣椒植株再生和农杆菌转化辣椒的技术体系。在此基础上，将由抗真菌蛋白的几丁质酶(Chitinase，Chi.)基因、葡聚糖酶(β-1，3-Glucanase，Glu.)基因和萝卜抗真菌蛋白(Rs-AFP2)基因构建的叁价表达载体转化辣椒，经Kan筛选、PCR分子检测、dot blotting和PCR-Southern blotting等分子检测，证实了外源基因已经整合到植株基因组DNA中。对辣椒离体子叶进行疫病病菌抗病性检测，证明转基因辣椒对辣椒疫病有很强的抗性。所获得的主要结果如下：1、辣椒高效离体再生体系a．保加利亚尖椒不定芽诱导分化培养基：MB+蔗糖30 gm+琼脂8g／L+LC 1.0 mg／L+IAA0.1 mg／L+ABA 0.3 mg／L+Spm 100μmol／L+AgNO_3 5 mg／L+PD 6 ml／L(pH5.8～6.0)，不定芽分化率达到100％，优胜芽率83.3％。不定芽伸长培养基：MB+蔗糖30g／L+琼脂8 g／L+LC 0.1 mg／L+IAA 0.2mg／L+GA_3 1.0 mg／L+Spm 100μmol／L+AgNO_3 5 mg／L+PD 6 ml／L(pH 5.8～6.0)，不定芽伸长率达到78.5％。再生苗生根培养基：1／2 MS+蔗糖30g／L+琼脂8g／L+IAA 1.0 mg／L+NAA 0.5 mg／L(pH 5.8～6.0)，再生苗生根率达到100％。b．赤研6号不定芽诱导分化培养基：MB+蔗糖30g／L+琼脂8g／L+LC 1.0 mg／L+IAA1.0 mg／L+ABA 0.3 mg／L+Spm 100μmol／L+AgNO_3 5 mg／L+PD 6 ml／L(pH5.8～6.0)，分化率达到100％，优胜芽率66.7％。不定芽伸长培养基：MB+蔗糖30g／L+琼脂8g／L+LC 0.2 mg／L+IAA 0.6mg／L+GA_3 2.0 mg／L+Spm 100μmol／L+AgNO_3 5 mg／L+PD 6 ml／L(pH 5.8～6.0)，伸长率达到58.5％。再生苗生根培养基：1／2 MS+蔗糖30g／L+琼脂8 g／L+IAA0.2 mg／L+NAA 0.1 mg／L(pH 5.8～6.0)，再生苗生根率达到100％。2、辣椒遗传转化体系在侵染液pH 5.2、预培养2 d、侵染时间7～8 min、无AS、共培养2 d的条件下为最优化的遗传转化体系。3、获得了辣椒转化植株将GCR叁价载体转化辣椒，转化后再生的植株经PCR、dot blotting和PCR-Southern blotting检测，证实叁个外源基因均已整合到辣椒基因组中。对辣椒离体叶片进行抗病性检测，结果证明转基因辣椒对辣椒疫病有很强的抗性。
汤银珠[3]2005年在《辣椒再生体系的建立及Bt与Ca-eIF4E基因转化辣椒》文中进行了进一步梳理辣椒(Capsicum annuum L. )是一种重要的蔬菜作物,在世界各地广泛栽培。然而,随着辣椒产业的发展,其病虫害也逐年加重,并造成重大的经济损失。植物基因工程的快速发展为辣椒遗传改良提供了一条崭新而有效的方法。通过抗病虫目的基因的导入,获得转基因抗病虫植株,从中选育出抗病虫、高产、优质的辣椒新品种。近年来,国内外这方面的研究很多,但成功例子很少。 辣椒抗病虫基因工程发展的最大障碍是辣椒离体再生困难,以致转化率太低。本研究以7个辣(甜)椒品种为试材,分别就基因型、外植体类型、苗龄、培养基成分等对辣椒离体再生的影响进行了较为系统而深入的探讨,建立辣椒的再生体系。在此和前人研究的基础上,通过对外源基因转化辣椒的转化培养条件的摸索,建立辣椒的遗传转化体系。 cryIA(c)来源于苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt),其蛋白质产物对鳞翅目昆虫具有特异的毒杀作用而对高等动物和人无害。通过调控真核翻译起始因子4E(eIF4E)可以增强植物对病毒的抗性。本研究通过农杆菌介导的方法将cryIA(c)与辣椒eIF4E编码基因Ca-eIF4E导入辣(甜)椒,通过PCR检测,初步证实两个基因已分别整合到辣椒基因组中。 本研究的主要结果摘要如下: 1.对于辣椒不定芽的诱导,外植体宜选用子叶而非下胚轴;不同苗龄的子叶再生能力差异大,刚充分展开时的子叶再生能力最强,为剪取外植体的最佳时期;不同基因型其子叶再生能力不同,7个供试辣(甜)椒品种中,以楚风再生能力最强;不同的激素组合及配比对子叶诱导不定芽有不同的影响。6-BA+IAA效果最好,6-BA+PAA次之,Zt最差。其中6-BA5.0mg/L+IAA0.2mg/L的激素配比可使楚风、苏椒五号、湘椒21号与茄门甜椒四个辣(甜)椒品种的不定芽诱导频率达到100%;Ag~+的添加改变子叶分化的极性;随着Ag~+浓度的增加极性作用增强;AgNO_3的极性作用强于螯合银离子(silver thiosulfate, STS);AgNO_3对不定芽的诱导产生抑制作用;STS则因其浓度、辣椒品种而异会促进或抑制不定芽的诱导,。 2.不定芽诱导时间对不定芽的伸长有一定的影响,诱导21 d的不定芽,其伸长频率明显的高于诱导14 d的不定芽;GA_3的添加有利于不定芽的伸长。不定芽的伸长百分率随着GA_3浓度的增加而增加,但当GA_3浓度增加到3.0mg/L时反而抑制不定芽的伸长,GA_3的适合浓度为1.0～2.0 mg/L:不定芽诱导期与伸长期的基本激素组合相同与否对不定芽的伸长有一定的影响,但总的来说Zt+GA_3效果最好,6-BA+IAA+GA_3次之,6-BA+PAA+GA_3最
王岩[4]2006年在《辣椒素合成酶（Capsaicinoid Biosynthetase）基因的序列分析及对甜椒的遗传转化与功能验证》文中研究表明辣椒(Capsicum annuum L．)是非常重要的蔬菜作物，具有很高的营养价值和经济价值。辣椒的主要辣味成分辣椒素(Capsaicin)具有多种药理与生理学活性，其含量是辣椒品质鉴定的重要指标之一。辣椒素合成酶(Capsaicinoid Synthetase)是辣椒素合成过程中的最后一个酶，也是关键性的限速酶。本研究通过农杆菌介导的遗传转化将编码该酶的C基因(即辣椒素合成酶基因)导入甜椒和辣椒品种，通过转化植株的表型分析探讨其是否具有使甜椒合成辣椒素的功能，以期为高含量辣椒素的品种选育提供新的育种途径。通过对该基因表达的调控必将大大提高辣椒辣味程度的人为可调控性并有效改变辣椒食用品质，从而推动辣椒育种工作的发展。 本研究获得的主要成果如下： 1．以4个甜(辣)椒品种为试材，分别就无菌苗苗龄，不同辣椒基因型和外植体类型、培养基成分等对子叶离体再生的影响进行了较为系统深入的探讨，建立起辣椒子叶高效植株再生体系。 (1) 芽的诱导分化：以子叶为外植体，MS为基本培养基，研究辣椒不定芽的诱导分化。结果：16d苗龄的中椒5号和湘椒八号的子叶外植体的再生率最高；分化培养基中添加10mg／LAgNO_3可有效避免外植体分化时期的褐化现象；分化培养基中生长素IAA对诱导芽分化的作用远高于NAA；筛选出子叶不定芽高效分化培养基：MB+6-BA 5.0mg／L+IAA 1.0mg／L+AgNO_3 10.0mg／L+蔗糖 20g／L+卡拉胶 8g／L，分化率达80％以上。 (2) 芽的伸长：辣椒再生中存在再生芽的茎伸长障碍。激素组合为6-BA2.0mg／L，IAA 0.3mg／L时不定芽生长最为旺盛，可基本满足芽正常生长对激素的需求。添加GA_3 2.0mg／L时芽伸长效果最好。芽伸长阶段，培养基硬度和叁角瓶中的空气湿度等环境条件的影响也很大，卡拉胶用量为6g／L，采用塑料薄膜封口，可基本达到芽迅速伸长所需的环境条件，伸长效果明显。最终确定最佳不定芽伸长培养基为：MS+6-BA 2.0mg／L+IAA 0.3mg／L+蔗糖20g／C+GA_3 2.0mg／L。
罗红萍[5]2010年在《辣椒离体再生体系的建立及抗病转录因子Pti4基因遗传转化》文中进行了进一步梳理辣椒(Capsicumu ruuuun L.)是一种重要的蔬菜作物,并因其具有特殊风味而广受青睐,目前在世界上许多国家和地区被广泛栽培。但由于各种病害的危害,辣椒的产量和品质受到严重的影响。因此提高其抗病性一直是十分重要的研究课题。常规育种方法常常受到种质资源匮乏和育种周期长的限制,而植物基因工程技术可在一定程度上辅助克服这些问题。在系统获得抗性中,许多PR(病程相关)基因协同表达,可以有效地提高植物的广谱抗病性。因此导入控制抗病基因表达的转录因子基因,从而使PR基因协同表达成为应用基因工程技术提高植物抗病性的一种更加有效的方法。番茄抗病转录因子Pti4基因蛋白质产物超表达时,启动子区域含有GCC-box或类似GCC-box序列的PR基因会显着表达。即通过转入外源Pti4基因激活大量的PR基因的表达,使转基因植物的综合抗病能力提高。本试验旨在通过建立的辣椒离体再生体系,利用农杆菌介导法将番茄抗病转录因子Pti4基因导入到辣椒中,并对转基因植株进行PCR检测。主要研究结果如下：1.辣椒离体再生体系的建立1)通过‘二金条’和‘川农泡椒1号’不定芽诱导能力的比较,发现基因型对不定芽的诱导有较大的影响；2)不定芽分化率以及每外植体平均分化芽数随着苗龄的增加先升高后降低,12-16d是辣椒外植体离体再生的最佳苗龄；3)Flamingo-bill外植体优于带柄子叶,带柄子叶优于子叶；4)‘二金条’的最优分化培养基是MS+0.2mg/LIAA+5.0mg/L6-BA+10.0mg/L AgNO3+6.5g/L琼脂+30.0g/L蔗糖；‘川农泡椒1号’的最优分化培养基是MS+0.5mg/LIAA+5.0mg/L6-BA+6.0mg/LAgNO3+6.5g/L琼脂+30.0g/L蔗糖；5)2.0mg/L GA3为不定芽伸长的最适浓度；6)最优生根培养基配方是MS+0.2mg/LIAA+0.1mg/LNAA+6.5g/L琼脂+30.0g/L蔗糖。2.辣椒的遗传转化通过农杆菌介导法将外源目的基因Pti4转入辣椒中,共获得52株辣椒Km抗性植株。用NPTⅡ引物对这52株抗性植株进行PCR检测(空白作为阴性对照,携带目的基因Pti4的农杆菌菌液作为阳性对照),其中45株抗性植株扩增出预期基因片段,转化率约为86.5%。
胡伟[6]2009年在《辣椒再生体系的建立及FaNES1基因转化辣椒》文中研究表明辣椒抗虫基因工程发展的最大障碍是辣椒离体再生困难,以致转化率太低。本研究以6个辣(甜)椒品种为试材,分别就基因型、外植体类型、苗龄、培养基成分等对辣椒离体再生的影响进行了较为系统的探讨,建立了辣椒的再生体系。在前人研究的基础上,通过对外源基因转化辣椒的转化培养条件的摸索,建立辣椒的遗传转化体系。通过农杆菌介导的方法将FaNES1导入辣(甜)椒,经过PCR检测,初步证实目的基因已整合到辣椒基因组中。主要结果摘要如下:1不同的辣(甜)椒品种在不同的培养基中其分化频率有较大差别。其中IAA0.5mg/L+6-BA 5mg/L对苏椒五号和Shakira的诱导频率最高,分别达到89.34%和82.37%;IAA 0.5mg/L+6-BA 6mg/L对Dallas的诱导频率最高,达74.16%;IAA 0.8mg/L+6-BA 5mg/L对Fiesta的诱导频率最高,达73.06%;IAA 0.8mg/L+6-BA 4mg/L对Polara的诱导频率最高,达70.06%;IAA1.0mg/L+6-BA 5mg/L对Olympus的诱导频率最高,达65.98%。。2培养基中添加AgNO_3对辣(甜)椒外植体不定芽的诱导与伸长都没有影响;但是能有效地抑制外植体培养过程中的褐化现象。3 GA_3的添加有利于不定芽的伸长,但是抑制不定芽的分化。不定芽的伸长频率随着GA_3浓度的增加而增加,但当GA_3浓度增加到3.0 mg/L时反而抑制不定芽的伸长,GA_3的适合浓度为1.0～2.0 mg/L,能有效的促进不定芽的伸长。4在培养基中添加6-BA(0.5、1.0、2.0、3.0 mg/L)与IAA(0、0.2、0.5 mg/L),或ZT(0.5、1.0 mg/L)与GA_3(0、0.5、1、1.5、2.0、3.0 mg/L)进行配组,结果表明Zt1.0mg/L+GA_32.0mg/L对不定芽伸长效果最好。5设置卡那霉素(km)浓度为0mg/L、70～110mg/L,结果表明110mg/L的Km可完全抑制苏椒五号不定芽分化。6农杆菌感染前辣椒转化外植体进行预培养,感染后共培养及共培养后的延迟培养有利于子叶遗传转化效率的提高,在预培养阶段设置1d,2d,3d,4d,延迟培养设置0～4d,结果显示共培养最佳时间分别为2d,延迟培养的时间也为2 d。7在转化苗的生根阶段,Km明显的抑制根系的生长,选择不使用Km进行筛选为宜。8将橙花叔醇合酶基因FaNES1转化辣椒,得到转化植株。对部分转化植株提取DNA,经PCR检测,初步证明目的基因已整合到辣椒基因组中。
曹艳玲[7]2009年在《辣椒高效遗传转化体系的建立及其在NAC,CDPK,CIPK等候选基因遗传转化中的应用》文中认为辣椒(Capsicum annuum L)是一种重要的蔬菜和工业原料作物,遗传转化是其基因工程遗传改良和功能基因组学研究的重要基础。但是,目前辣椒的遗传转化体系还不完善,主要缺陷是:辣椒再生周期长,分化频率低,不定芽的伸长能力差,遗传转化频率低等,限制了基因工程在辣椒遗传改良上的有效应用和辣椒功能基因组学研究的进展,亟待建立高效的遗传转化体系。本研究采用L120,L63(朝天椒), L3(本地种),L5(天鹰小椒)等九种辣椒资源,对辣椒再生的芽诱导,芽伸长和生根的激素配比,培养基的选择,基因型,外植体类型进行了比较分析,建立起了辣椒再生体系,并在再生体系的基础上对辣椒遗传转化的预培养,共培养和侵染的时间,Kan筛选浓度进行了反复实验,建立了高效的遗传转化体系,通过农杆菌介导的叶盘法和Flamingo-bill外植体遗传转化法,并应用该体系对NAC1、CDPK和CIPK等候选基因的超表达和RNAi载体进行遗传转化,一方面验证该遗传转化体系应用效率,另一方面为进一步开展所选用的候选基因的功能鉴定奠定基础。试验的主要结论如下:1、离体再生体系的建立在辣椒再生过程中,不同外植体的芽诱导差别较大,其中带柄子叶>子叶>下胚轴。苗龄为12-16d的外植体最适宜再生诱导,辣椒基因型直接着影响芽诱导率。经过筛选激素配比,得出以下各阶段培养基配方:子叶芽分化培养基:MB+ 5mg/ L 6-BA+ 0.1mg/ L IAA+ 4mg/ L AgNO_3+ 30g/ L蔗糖+7g/ L琼脂粉;下胚轴芽分化培养基:MB+ 3mg/ L 6-BA+ 1mg/ L IAA+ 4mg/ L AgNO_3+ 30g/ L蔗糖+7g/ L琼脂粉;芽伸长培养基:MB+ 3 mg/ L 6-BA+1 mg/ L IAA+ 1.5 mg/ L GA_3+ 4mg/ L AgNO_3+ 30g/ L蔗糖+7g/ L琼脂粉;生根培养基1/2MB+0.2mg/L IAA+ 0.1mg/ LNAA+ 30g/ L蔗糖+7g/ L琼脂粉;6-BA+ IAA+ GA_3配方的伸长效果优于ZT+ GA_3的配方。GA_3与ABA的相比较,GA_3更利于芽的伸长。诱导芽经过18-22d左右的分化培养最适宜后期的伸长生长。2、遗传转化体系的建立与优化遗传转化过程中,不同生长阶段的选择压有区别,芽分化阶段采用75 mg/ L的Kan,芽伸长阶段,子叶和下胚轴分别用50 mg/ L和75mg/ L Kan进行选择,分化和伸长阶段均使用500mg/ L羧苄青霉素能有效抑制农杆菌的生长。生根阶段的Kan浓度为40 mg/ L,并以200 mg/ L的头孢霉素代替羧苄青霉素,有利于根的形成。预培养最佳时间3d,共培养2d。OD600=0.6的农杆菌侵染适宜时间为6~8min。Flamingo—bill外植体法,带柄子叶,子叶块的遗传转化率分别是6.8%,12.1%,4.3%,阳性转化率分别是33%,23.6%,21.1%。3、遗传转化体系的应用与候选基因转化植株的获得应用遗传转化体系和L120辣椒基因型对超表达载体和RNAi载体的NAC1基因以及候选基因CDPK和CIPK进行了遗传转化,其中超表达载体NAC1获得25植株,阳性转化率为24% ,PCR阳性植株6株;RNAi载体NAC1获得20植株,阳性转化率为25%, PCR阳性植株5株。转化CDPK和CIPK基因获得5株阳性植株。
王兴娥[8]2009年在《冷诱导基因CBF4在辣椒中的遗传转化及抗寒性分析》文中研究指明辣椒(Capsicum annuum L.)属茄科辣椒属,在我国各地普遍栽培。辣椒生长最适温度为24-28℃,15℃时生长就完全停止,低于12℃容易发生冷害。低温是制约辣椒跨季节栽培、提前或延后栽培的主要限制因子,所以抗寒性成为选育寒冷地区辣椒品种的一个重要指标,提高辣椒的抗寒性有重要的意义。随着分子生物学的不断深入,辣椒育种工作的方式方法也逐渐变得更加多样和成熟。利用抗冷基因工程获得抗冷品种有可能成为辣椒抗冷改良的一种新的有效途径。CBF转录因子是近年来在拟南芥中发现的,基本功能是使植物细胞耐低温和脱水相关基因表达。CBF基因本身是冷诱导的,拟南芥植株被转移到低温下一定时间后,CRT/DRE元件调控的COR基因的转录物才开始积累。CBF转录激活因子的超表达导致编码产生LEA蛋白或亲水多肽,脯氨酸和多种可溶性糖类的合成积累,从而提高植物的抗逆性。CBF基因在拟南芥和油菜中超表达后,转基因植株对低温、干旱、高盐胁迫的耐性显着增强。本研究以11个辣椒品种为材料,对辣椒高频再生体系进行了优化。选取其中2个再生能力好的辣椒品种为受体材料,得出了两个品种B12和AA5的最优再生体系。并通过对辣椒品种B12的预培养时间、农杆菌浸染时间、共培养时间以及延迟培养时间等条件的优化,建立并完善了一套高效的转化体系(再生图片见附录),从而提高了辣椒品种B12的遗传转化效率。在此基础上,以辣椒品种B12带柄子叶为外植体,将抗寒基因CBF4通过农杆菌介导的方法导入辣椒,旨在获得具有一定抗寒性的转基因辣椒,分析其相关的酶活性与形态性状,为深入研究外源基因在辣椒基因组中表达,以及抗寒分子育种提供科学依据。其主要结果如下:1不同辣椒品种的再生能力差别较大,其中以品种B12和AA5的分化能力最强;辣椒植株离体再生体系中,较高的6-BA/IAA值有利于辣椒外植体的分化再生,而6-BA/IAA值较低则适合于再生芽的伸长;辣椒子叶和带柄子叶的再生能力比下胚轴强;不同苗龄的带柄子叶再生能力也有差异,以12-16d苗龄的外植体为好。2辣椒品种AA5的再生体系:最优芽分化培养基为:MB(MS无机盐成分+B5有机成分)+0.6 mg/L IAA+5.0 mg/L 6-BA +3%蔗糖+0.7%琼脂;最优芽伸长培养基为:MB+0.8 mg/L IAA+2.0 mg/L 6-BA+2.0 mg/L GA3 +3%蔗糖+0.7%琼脂;最优生根培养基为:1/2MS+0.5 mg/L IAA+3%蔗糖+0.7%琼脂。3辣椒品种B12的最优芽分化培养基为:MB +0.5 mg/L IAA+5.0 mg/L 6-BA+3%蔗糖+0.75%琼脂;最优芽伸长培养基为:MB+0.5 mg/L IAA+1.5 mg/L 6-BA+2.0 mg/L GA3 +250 mg/L Cef+50 mg/L Km+3%蔗糖+0.75%琼脂;最优化生根培养基为:MB+0.2mg/L IAA+0.1 mg/L NAA +250 mg/L Cef+50 mg/L Km +3%蔗糖+0.75%琼脂。4通过对谭洁建立的农杆菌介导辣椒遗传转化体系的优化和完善,得到辣椒品种B 12的最优化遗传转化体系:预培养基(共培养基):MB (MS无机盐成分+B5有机成分)+0.5 mg/L IAA+5.0 mg/L 6-BA+3%蔗糖+0.75%琼脂;延迟培养基:MB+0.5 mg/L IAA+5.0 mg/L 6-BA+250 mg/L Cef+3%蔗糖+0.75%琼脂;筛选培养基:MB+0.5 mg/L IAA+5.0 mg/L 6-BA+250mg/L Cef+50 mg/L Km+3%蔗糖+0.75%琼脂。5农杆菌介导辣椒遗传转化的适宜条件是:切取14 d苗龄带柄子叶外植体经过2 d预培养,在OD600=0.8的工程菌液中侵染5-6 min后,再经共培养2 d,延迟筛选10 d能获得较高的转化率。获得了经PCR和RT-PCR检测的46株转基因植株。6经过15℃低温处理后,对阳性植株的抗寒性生化指标、形态指标分析发现,转基因植株的SOD和POD活性都明显高于未转基因植株,转基因植株比未转基因植株的株型紧凑,叶片肥厚、平直,叶色浓绿,叶面积大。
臧顺[9]2014年在《辣椒再生体系建立及器官发生的细胞组织学观察》文中认为辣椒(Capsicum.annuum L.)是亚热带和温带国家辣椒属栽培最广泛的一个种,是一种重要的蔬菜作物,其在中国的种植面积居蔬菜作物第2位,有着重要的社会意义和经济意义。但辣椒对各种生物和非生物胁迫敏感,其产量和品质受威胁严重。要获得具有较强适应性的辣椒新品种,仅依靠传统的育种方法周期较长,而且辣椒的遗传背景相对狭窄,难以通过传统的育种方法获得目标性状改良的新品种。利用植物离体培养和遗传转化技术进行辣椒植株性状改良,培育新品种,可以克服物种间基因交流障碍,并且性状改良针对性强、目的明确,具有较高的研究价值和应用价值。通过离体培养实现植株再生,建立稳定、高效的离体再生体系则是遗传转化的先决条件。辣椒属于再生顽拗型植物,同烟草、番茄、马铃薯等其他茄科植物相比,植株再生率低,实现其离体再生相对较困难。辣椒离体再生有器官发生和体胚发生两种途径,器官发生是辣椒离体再生的常规途径。辣椒的离体再生受多种因素的影响,特别是添加物质的种类和浓度对辣椒离体再生的影响很大,但关于它们的影响作用及其相互作用大小的研究较少。而正交设计可以减少试验次数、缩短试验周期、迅速找到优化方案。本研究以辣味型辣椒黔椒五号和甜味型辣椒洛椒九号为试材,经初步试验筛选出最适外植体后引入正交试验设计,研究BA、IAA、AgNO3、GA3等添加物质对不定芽分化和伸长的影响大小及其之间的相互作用,找出最适宜外植体分化和伸长的添加物质组合,再经过生根试验,建立稳定的离体再生体系。然后在最适添加物质组合的培养条件下从细胞组织学上观察辣味型和甜味型器官发生过程,比较了辣味型和甜味型辣椒器官发生的异同。主要研究结果如下：1.带柄子叶为辣椒离体再生的最优外植体类型。2.黔椒五号带柄子叶外植体分化时,添加物质最优组合为BA6.0mg/L+IAA1.0mg/L+AgNO35.0mg/L,分化率81.18%。各因素对于黔椒五号带柄子叶外植体分化的影响大小为BA×IAA>BA> IAA×AgNO3> BA×AgNO3> IAA> AgNO3。3.洛椒九号带柄子叶外植体分化时,添加物质最优组合为BA5.0mg/L+IAA0.5mg/L+AgNO35.0mg/L,分化率为94.74%。各因素对于洛椒九号带柄子叶外植体分化的影响大小为AgNO3>BA>BA×IAA>IAA×AgNO3>BA×AgNO3>IAA。4.黔椒五号不定芽伸长时,添加物质最优组合为BA3.0mg/L+IAA0.5mg/L+GA31.0mg/L+AgNO30mg/L,不定芽伸长力为47.52%。各因素对于黔椒五号不定芽伸长的影响大小为AgNO3> IAA×GA3> BA×IAA> IAA>BA×GA3> GA3>BA。5.洛椒九号不定芽伸长时,添加物质最优组合为BA3mg/L+IAA1.Omg/L+GA32.0mg/L+AgNO30mg/L,不定芽伸长力为19.35%。各因素对于洛椒九号不定芽分化的影响大小为BA×IAA> IAA>BA>AgNO3>GA3>IAA×GA3>BA×GA3。6.黔椒五号和洛椒九号两个辣椒品种的不定芽生根采用MS基本培养基+蔗糖30.0g/L最为合适。7.黔椒五号和洛椒九号器官发生是外起源。8.黔椒五号在培养6天维管束启动分裂,而洛椒九号维管束在培养3天启动分裂,较早。9.黔椒五号和洛椒九号外植体器官发生过程相近,先是维管束启动分裂,然后薄壁组织启动分裂,之后形成微管组织结节和分生组织结节。10.洛椒九号器官发生有细胞大小接近、近圆形、排列紧密的非胚性愈伤组织大量增殖过程,而黔椒五号未发现此过程。
刘文菊[10]2009年在《高效辣椒遗传转化体系构建及其在辣椒功能基因组研究中的运用》文中指出试验首先建立辣椒的遗传转化体系,再用农杆菌介导法将从辣椒中分离获得的CaWRKY2, CaWRKY3, CaWRKY4, CaWRKY5, CaDREB, CaNAC, CaI1基因所构建的干扰载体对辣椒普通栽培种P009,P020,P120,P121辣椒品种进行了遗传转化,获得了抗性再生植株,并对所获得的转基因苗进行了初步的RT-PCR分子鉴定及抗病性分析,目的是为进一步进行CaWRKY家族基因以及其他基因功能分析以及抗病机制研究提供研究材料,并为辣椒建立了一个高效稳定的遗传转化体系,为进一步开展辣椒基因工程遗传改良和辣椒功能基因组学研究奠定了基础。试验主要结果如下:(1)选取辣椒品种P009, P020, P120, P121进行辣椒离体再生体系优化。试验得出最适小苗苗龄为8-15d,最佳外植体为去顶芽茎尖生长点,最佳培养基为MS+5.0mg/L 6-BA +0.5 mg/L IAA+4.0 mg/L AgNO_3 +蔗糖30g,pH5.8。(2)P009, P020, P120, P121去顶芽茎尖生长点,带柄子叶经过预培养,与农杆菌的共培养,筛选培养,伸长培养,生根培养获得离体再生转基因苗。预培养与共培养培养基为MS+5.0mg/L 6-BA +0.5 mg/L IAA+4.0 mg/L AgNO_3+100 mg/L AS+蔗糖30g, pH5.8;诱导筛选培养基MS+5.0mg/L 6-BA +0.5 mg/L IAA+4.0 mg/L AgNO_3+70 mg/L Kan+500 mg/L Cb+蔗糖30g, pH5.8;伸长培养基MS+2.0mg/L 6-BA +0.2 mg/L IAA+1.0 mg/L GA_3+4.0 mg/L AgNO_3+70 mg/L Kan+500 mg/L Cb+蔗糖30g, pH5.8;生根培养基1/2 MS+200 mg/LCef+蔗糖30g, pH5.8。(3)EHA105根癌农杆菌介导的辣椒遗传转化的最佳条件是:外植体在诱导培养基上预培养1-3d,农杆菌共培养前在含50mg/L Rif, Spec和100mg/L AS两次活化,侵染OD600值为0.3-0.6,侵染10 min,25℃、黑暗条件下共培养2-3 d。(4)获得了17株P009转iCaDREB转化植株; 5株P020转iCaWRKY4转化植株; 21株P120转iCaWRKY2转化植株; 2株P120转iCaWRKY3转化植株; 15株P120转iCaWRKY4转化植株; 12株P120转iCaWRKY5转化植株;9株P120转iCaI1转化植株; 9株P120转iCaNAC转化植株株;6株P121转iCaNAC转化植株;以上植株经PCR分子检测均显阳性。(5)初步选用转化植株较多的P120转化iCaWRKY4,iCaWRKY5转化植株做抗辣椒疫霉病害分析。基因沉默的转基因植株其抗辣椒疫霉病害能力明显增强,用基因特异性CaWRKY4, CaWRKY5引物对疫霉处理的转基因苗进行RT-PCR检测,研究结果表明,相比于对照,CaWRKY4, CaWRKY5基因已完全沉默。
参考文献：
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[2]. 抗真菌叁价载体转化辣椒的研究[D]. 敬国兴. 湖南农业大学. 2007
[3]. 辣椒再生体系的建立及Bt与Ca-eIF4E基因转化辣椒[D]. 汤银珠. 华中农业大学. 2005
[4]. 辣椒素合成酶（Capsaicinoid Biosynthetase）基因的序列分析及对甜椒的遗传转化与功能验证[D]. 王岩. 华中农业大学. 2006
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[6]. 辣椒再生体系的建立及FaNES1基因转化辣椒[D]. 胡伟. 华中农业大学. 2009
[7]. 辣椒高效遗传转化体系的建立及其在NAC,CDPK,CIPK等候选基因遗传转化中的应用[D]. 曹艳玲. 福建农林大学. 2009
[8]. 冷诱导基因CBF4在辣椒中的遗传转化及抗寒性分析[D]. 王兴娥. 西北农林科技大学. 2009
[9]. 辣椒再生体系建立及器官发生的细胞组织学观察[D]. 臧顺. 西南大学. 2014
[10]. 高效辣椒遗传转化体系构建及其在辣椒功能基因组研究中的运用[D]. 刘文菊. 福建农林大学. 2009