陈红岩, 张军, 高毅, 杜海莲, 马英[1]2002年在《乙肝病毒表面抗原基因在花生中的遗传转化及免疫原性检测》文中提出首次用花生半胚作为外植体,与农杆菌EHA105(含质粒p1301HBs)共培养5d,再生培养基中通过加入潮霉素进行抗性筛选,得到抗潮霉素的芽,经芽的伸长、诱导生根获得转化植株。经PCR、PCR-Southern杂交、Southern点杂交等分子检测,证实目的基因已整合到花生基因组中,ELISA检测证实了在花生中表达的HBsAg具有较好的活性。经初步定量,花生小芽的蛋白初提液中可溶性蛋白含量1.044g/L,HBsAg小蛋白的含量约占总可溶性蛋白的0.032%,每克转化植株小芽鲜重含HBsAg小蛋白约2.4×10-7g。转基因花生植株初提重组蛋白经HPLC纯化、浓缩后,注射初免一次的小鼠,有明显的特异性抗体产生。口服饲喂已免疫但抗体下降至0.025(HBsAbELISAD值)Balb/c小鼠,发现有较强的抗体回升,达3.54,表明转基因花生疫苗可以加强口服免疫。
陈红岩[2]2001年在《乙肝病毒表面抗原基因在花生中的转化及免疫原性研究》文中进行了进一步梳理花生(Arachis hypoaea)具有较高的营养价值，是一种廉价的植物蛋白质源。花生中含有约30％的蛋白质，因此是生产口服基因工程疫苗的理想载钵之一。本研究通过乙肝病毒表面抗原(HBsAg)在花生中的遗传转化研究，初步建立了花生的转化体系，并进行了初步的小鼠实验，结果表明花生表达的外源蛋白有良好的免疫原性，初步证实了转基因花生口服疫苗的可行性，为实现利用转基因花生生产大量、廉价的蛋白质疫苗提供一些实验和理论指导。受体系统：比较“泉花一号”、“汕油”、“鄂花四号”、“7868”四个花生栽培品种的半胚、小叶、胚轴等不同外植体的发芽率和发芽数，结果表明半胚最优，其次为胚轴和小叶。四个品种中又以“鄂花四号”的半胚发芽率和发芽数最高，可达92.5％和9-10个芽。 植物表达载体的构建：将乙肝表面抗原(HBsAg)基因插入植物双元表达载体pCAMBIA1301中，采用花椰菜花叶病毒(CaMV)35s启动子，Tnos为终止子，以gus基因为报告基因，植物抗性基因为hvg基因。 转化系统：对农杆菌转化条件的比较发现，菌株、共培养时间、共培养条件等均对转化有较显着的影响。对3个菌株(LBA4404、AGL1、EHA105)侵亲染力比较中发现，用EHA105浸染花生的转化效率最高。另在提高细胞感受态方面，在菌液和共培养基中加入0.2 mol/L CaCl(?)共培养时间由常规的2-3d增加至5d，可有效的提高转化效率。 转化体获得：选择筛选剂及确立基础抗性时，发现花生半胚对潮霉素比卡那霉素敏感，在潮霉素浓度为20mg/L时就可以完全抑制芽的分化。转化植株的筛选时，比较了间歇加压法和持续加压法。通过间歇式加压法从46个外植体中得到5株抗性体，但均未见报告基因(gus)表达，假阳性率高达100％；经持续式加压法从85个外植体中得到3株抗性体，其中2株有gus基因表达，因此最终选择持续加压法进行筛选。从花生“鄂花四号”成熟胚120颗中，利用半胚诱导、持续加压最终获得3个转化植株，均有明显gus基因表达。转化体外源基因槛、表达酌检测：对获得的转化植株，经PCR、peR—Sou山ern杂交和点杂交，证实目的基因己整合到花生基因组中，ELISA检测表明花生中表达的乙型肝炎表面抗原具有良好的活性，并初步定量计算出花生小芽中HBSAg蛋白含量分别约为1．27 X 10；g／g、2．4X 10”g／g和1．21X10rtg／g潍。免疫原性检测：取HBSAg ＆jkgf高的植株巳的叶片经诱导愈伤，高压筛选扩繁出大量愈伤组织，分别以蛋白粗提液和部分纯化的重组蛋白，肌肉注射初兔一次的小鼠，抗体均有明显的上升趋势，表明转基因植株中表达的重组HBSAg具有良好的免疫原性。取同样的转化硼组织，敏饲喂己免驭懒体下降至0．025（HBsAb ELISA皿值）的Balb／c小鼠，在第 5周出现抗体回升，第7周抗体ODM至3．54，而饲喂未经初兔的小鼠，直至第7周仍未见明显抗体产生。这些结果表明转基因植株经口服可以诱导回亿性抗体产生，而目前的表臼主量尚不足以作为初兔疫苗。 本研究首次将花生半胚作为转化受体用于花生遗传转化，并表明了其相对于常规胚轴和子叶具有一定的优势，在此基础上优化了农杆菌介导的花生半胚的遗传转化系统，并首次实现了HBSAg基因在花生中的表达，初步证实了转基因花生作为口服疫苗的可行性，为今后研制具实用价值的转基因花生口服疫苗奠定了坚实的基础。
参考文献：
[1]. 乙肝病毒表面抗原基因在花生中的遗传转化及免疫原性检测[J]. 陈红岩, 张军, 高毅, 杜海莲, 马英. 生物技术通讯. 2002
[2]. 乙肝病毒表面抗原基因在花生中的转化及免疫原性研究[D]. 陈红岩. 厦门大学. 2001