董娜[1]2003年在《松材线虫和拟松材线虫分泌—排泄物的比较研究》文中研究指明松树萎蔫病是由松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)引起的松属树种上的一种毁灭性的病害。目前，该病在日本、美国、加拿大、韩国等国家都有分布，但危害程度不一。其中，中国和日本受害最严重。它不仅给林业生产带来巨大损失，而且造成生态景观的破坏。因此，对松材线虫致病机理的研究具有重要的理论和实践意义。 随着植物寄生线虫致病机理研究的深入，松材线虫食道腺分泌物对寄主细胞及其新陈代谢影响的分子机制日益受到研究者的关注。本文利用松材线虫和拟松材线虫致病性的筹异，通过电泳，酶染色等生物技术对松材线虫和拟松材线虫分泌-排泄物和分泌物亚细胞颗粒蛋白及纤维素酶进行了比较研究，主要研究结果如下： 1．通过6种不同生物染剂染色后发现，松材线虫和拟松材线虫各株系对各种染剂的敏感度各不相同。从实验结果看，松材线虫株系的口针、头感器、阴门和肛门都有分泌—排泄物被观察到。然而拟松材线虫株系只观察到口针和头感器的分泌物，其中F1株系仅观察到口针分泌物，这说明松材线虫和拟松材线虫线虫分泌—排泄物存在明显的差别，这种差别可能与松材线虫的致病性有关。本实验的所有线虫株系都有口针分泌物，然而松材线虫口针分泌物比拟松材线虫分泌的量大。而口针分泌物主要来自食道腺，这表明松材线虫的食道腺分泌物较多。因此，松材线虫食道腺分泌物在致病方面可能起者重要作用。此外，5个株系均对考马斯亮蓝敏感，而考马斯亮蓝是特异染蛋白的染料，因此，可证明口针分泌物中存在蛋白质。 2．从纤维素酶电泳分析结果看，成幼虫的纤维素酶的谱带在迁移率和量上均无明显区别，各株系间也无区别；分泌-排泄物和分泌颗粒的电泳分析中松材线虫和拟材线虫纤维素酶的量和谱带迁移率也相同；只有大量线虫匀浆提取液的酶谱带在各株系间有一定变化，但没有发现种内各株系共有而又与另一种相区别的酶谱带。本实验所有的纤维素酶电泳分析中所有线虫株系都具有或仅具有最快的一条和最慢的两条迁移率相同的谱带。实验结果表明，松材线虫与拟松材线虫都分泌纤维素酶，但在活性和酶谱带上无种间区别。因此，线虫的纤维素酶可能只是起到对植物细胞的疏松作 中文摘要用，以协助线虫降低纤维素网的机械强度，但在导致松树萎蔫方面并不起决定性作用。 3.本文对线虫分泌一排泄物和分泌物亚细胞颗粒蛋白的提取物分别进行了PAGE和SDS一队GE电泳。从电泳谱带结果上可以看出，松材线虫和拟松材线虫的PAGE电泳谱带有明显的种间区别。所观察到的蛋白质谱带的分子量在10一10OKD的低分子区域内，这与其它植物寄生线虫的实验结果相一致。SDS一PAGE电泳谱带明显多于PAGE电泳的谱带，这说明分泌一排泄物和分泌物亚细胞颗粒蛋白中都存在着多亚基的蛋白质。在护AGE电泳结果中，分泌一排泄物蛋自的谱带多于亚细胞颗粒的，此结果表明，除口针分泌物外，线虫还存在人量其它分泌物，井且其中存在着多种松材线虫特有的蛋白。37KD和23KD的蛋白在松材线虫株系中含量都较突出，一个来自食道腺，一个来自非口针分泌的分泌一排泄物，这些蛋白在松材线虫的致病过程中可能有重要功能。在SDS一PAGE电泳结果中，亚细胞颗粒蛋白中松材线虫特有的蛋白比以GE电泳中的明显增多，说明松材线虫亚细胞颗粒蛋白中的多体蛋白质较多。F1一直是在分类上有争议的株系，本实验结果偏向于Fl与拟松材线虫亲缘关系较近。上述研究结果显示，松材线虫食道腺分泌物与其它植物寄生线虫食道腺分泌物类似，通过口针分泌，含有大量蛋白质，其主要集中在低分子量区域，食道腺分泌物在致病机制中可能具有重要作月J。同时还发现，松材线虫的体外分泌物可能对致病性也有重要的影响。
任志禄[2]2006年在《松材线虫和拟松材线虫分离方法的改进及其食道腺分泌物的提取和比较》文中研究说明松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)是寄生于松属植物的一种线虫,它能引起松树萎蔫病,导致大量的木材损失,在国内被列为重要的检疫对象。目前,该病在日本、中国、美国、加拿大、韩国等国家都有分布,因危害严重,难于防治从而受到世界各国的重视。其中,中国和日本受害最严重。它不仅给林业生产带来巨大损失,而且造成生态景观的破坏。因此,对松材线虫致病机理的研究具有重要的理论和实践意义。 很多学者对松材线虫病的病因及其致病机理进行了研究,然而松材线虫引起松树萎蔫病的致病机理目前还不明确,伴随科学工作者对植物寄生线虫的深入研究,发现线虫的食道腺分泌物在其取食过程中起着重要的作用,所以松材线虫食道腺分泌物对寄主细胞及其新陈代谢影响的分子机制日益受到研究者的关注。长期以来,由于松材线虫个体微小,且易和真菌的菌丝以及细菌等杂质混在一起,从而影响试验的准确性,因此得到纯净的线虫材料对实验研究至关重要。由于松材线虫和拟松材线虫食道腺很小,其分泌物的量更是甚微,因此如何提取足量的食道腺分泌物成为实验研究的关键。因此,本研究工作主要对松材线虫和拟松材线虫(Bursaphelenchus mucronatus)的分离方法进行了改进,并用药物刺激方法分析食道腺分泌颗粒蛋白含量的变化,进而提取食道腺分泌物进行电泳分析。主要研究结果如下: 1.线虫分离方法的改进:用裂褶菌培养繁殖松材线虫后,当用浅盘法收集时,线虫的悬浮液中含有大量类似线虫形状的菌丝以及大量的细菌,从而使以需要纯净松材线虫为材料的研究无法进行。本文通过用90目/平方毫米的筛子自制的线虫分离器进行初级分离,然后在同一离心力下(1,700g,10min)以不同浓度的蔗糖溶液为离心介质进行二次分离试验,得出30%(w/w)的蔗糖溶液效果最好,能够把松材线虫和断裂菌丝分离。本文还分别以硫柳汞、硫酸庆大霉素、青霉素、链霉素、K-Medium的无菌去离子水这五种药物溶液进行线虫消毒灭菌,同时以空气刺激法来观察这些药物是否影响线虫的活性,结果是:K-Medium的
董娜, 田彦辉, 张路平[3]2004年在《松材线虫和拟松材线虫活体染色比较其分泌-排泄物》文中研究指明松树萎蔫病是由松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus)引起的松属树种上的一种毁灭性的病害,因此,对松材线虫致病机理的研究具有重要的理论和实践意义.根据松材线虫和拟松材线虫致病性的差异,通过活体染色对松材线虫和拟松材线虫分泌-排泄物进行了比较研究,发现松材线虫和拟松材线虫线虫分泌-排泄物存在明显的差别,这种差别可能与松材线虫的致病性有关.
刘裕兰[4]2007年在《松材线虫PCR快速检测方法的研究》文中进行了进一步梳理松材线虫病(pinewilt disease)是松属的一种毁灭性病害,具有发病致死速度快、传播蔓延迅速、防治难度大等特点,是严重威胁全世界林业生产的重大检疫性病害之一。该病由松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)引起,目前国内外尚无很好的根除方法,唯有通过设立和建设无病区、加强植物检疫严防病害传入。因此,加强病害的早期诊断和检测技术的研究尤为重要。松材线虫的传统检测技术(如形态鉴定、生理生化鉴定方法等)或多或少存在一定的局限性,如特异性差、灵敏度低等,尤为关键的是不能对病害进行早期快速准确检测。而核酸水平的分子检测技术,特别是聚合酶链式反应(PCR)作为检测技术具有快速、特异、灵敏的特点,可以满足国内外现代植物检疫的要求。研究目的:本文对松材线虫核酸分子检测技术进行了系统的研究,旨在建立起快速准确稳定安全的松材线虫分子检测技术体系,实现松材线虫样品的快速检验,为松树非疫区生产建设和病害预警监测提供一种分子检测技术和实用工具。研究内容和方法:比较改进CTAB法、试剂盒法和浸泡过滤法提取松材线虫和拟松材线虫( B.mucroratus )DNA的适用性;利用引物设计软件Primer Premier 5.0进行引物的设计;PCR同步扩增拟松材线虫、小杆线虫(Caenorhabd itis spp)、伪伞滑刃线虫(B. fraudulentus)和其他腐生线虫(saprophytic nematodes)等多种线虫来验证检测的特异性;PCR扩增松材线虫基因组DNA以测定检测的灵敏度;通过在不同DNA扩增仪和温度控制方式下的扩增程序测定检测的稳定性;将DNA靶片段与克隆载体pMD-18T连接后,用CaCl2法转化大肠杆菌(Escherichia. coli,JM109),然后通过测序来验证PCR扩增产物的准确性;以重组质粒和转化的大肠杆菌构建了无害化阳性参照体系;采用预混PCR反应液中加入生物活性分子稳定剂(MS)并冷冻干燥固相化处理的方法研制出能常温贮存的方便有效的检测试剂盒。利用优化的分子检测体系对天津、广西、湖南、重庆和四川等地采集的松木样品进行了PCR实际检测;利用BIO-RAD iCycler iQ定量PCR仪对松材线虫的定量检测做了初步的研究。研究结果:①通过比较研究不同制样方法对检测效果的影响,确定浸泡过滤法能有效地排除植物色素、蛋白质、多糖等物质对PCR反应的干扰,可以从木屑中直接提取适合于PCR反应的松材线虫DNA模板,检测限度到达了1条线虫/ 1.5g木屑,建立了从木屑中快速提取线虫DNA的制样方法。②根据松材线虫特异的基因序列设计不同的引物对,通过比较筛选出特异性强、稳定性好、灵敏度高(灵敏度达到200 pg/25μL)的引物对cqubs01/cquba01,并由此建立了准确、快速、灵敏、稳定、安全的松材线虫PCR检测体系。③根据拟松材线虫特异的基因序列设计不同的引物对,通过比较筛选出特异性强稳定性好灵敏度高的引物对cqubms01/cqubma01,并与松材线虫引物cqubs01/cquba01组合,由此建立了准确、快速、灵敏、稳定、安全的松材线虫和拟松材线虫双重PCR检测体系。④cqubs01/cquba01用于SYBR Green I实时荧光定量PCR检测,灵敏度达到100 fg/25μL,与常规PCR相比更灵敏、更简便、更快速,且保持了较低的检测成本。⑤利用浸泡过滤方法提取的线虫总DNA由于含量不同而且保存期限短,不宜作为阳性对照。而以转化的病菌靶序列重组质粒DNA和重组子作为阳性对照,不仅检测稳定、效果理想,而且安全可靠,可以用作定量检测的标准样品。⑥预混PCR反应液中加入适量的生物活性分子稳定剂,对DNA聚合酶,dNTPs等生物大分子具有良好的常温稳定作用,含有MS的预混PCR反应试剂经冷真空冻干燥处理后可以于常温下保存至少半年以上。结论:本研究利用改良的DNA提取方法及构建的重组阳性对照,成功的建立了快速、稳定、可靠的松材线虫定性及定量分子检测体系。从样品的制备到获得最终的检测结果,该体系仅用时6h,符合实际检测的要求。因此该技术可以广泛地用于出入境木材检疫检验、松树非疫生产区松材线虫病疑似样品鉴定和病害早期诊断监测。
董娜, 张路平[5]2005年在《松材线虫和拟松材线虫分泌-排泄物蛋白组分比较观察》文中提出松树萎蔫病是由松材线虫引起的松属树种上的一种毁灭性的病害,对松材线虫致病机理的研究具有理论和实践意义。本实验利用松材线虫和拟松材线虫致病性的差异,通过PAGE电泳对两者的分泌-排泄物和分泌物亚细胞颗粒蛋白组分进行了比较。结果表明:松材线虫和拟松材线虫种内和种间各株系的蛋白图谱均有差异;五个株系有相同的蛋白带;松材线虫有特有的蛋白带,其中37 kD和25 kD的蛋白在松材线虫中的含量都较突出,一种来自食道腺,一种来自非口针分泌的分泌-排泄物,两者在线虫的致病性中可能有重要功能
严东辉, 杨宝君[6]1997年在《松材线虫体外酶组成分析》文中研究指明将表面消毒的松材线虫，在Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲液中振荡培养，培养液经硫酸铵沉淀、透析、冷冻真空干燥，制成的干样，用于聚丙烯酰胺凝胶电泳。结果表明，松材线虫能向体外分泌多种可溶性蛋白，对其中酶组成分析发现有纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、淀粉酶等。同样条件下未能检出β－半乳糖酶、β－木糖酶、β－葡聚糖酶、漆酶等
蒋立琴[7]2006年在《伞滑刃线虫属和外滑刃线虫属部分种群的分类及分子鉴定研究》文中提出伞滑刃线虫属(Bursaphlenchus)中松材线虫(B.xylophilus)是松树癌症一松树萎蔫病的病原物。由于其危害严重和防治困难受到世界各国的高度重视,很多国家将其列为检疫对象。鉴于该线虫的重要性以及在分离该线虫的过程中,常分离到该线虫所在属的其它线虫,本研究对松材线虫及其所在属的伞滑刃线虫进行了系统的形态学和分子分类与鉴定研究,探索了利用rDNA的PCR-RFLP、duplex-PCR以及制备松材线虫单克隆抗体等方法构建部分伞滑刃线虫的分类诊断系统;同时对伴随松材线虫分离到的两种外滑刃线虫属种群(松外滑刃线虫和华美外滑刃线虫)进行了形态学与分子鉴定。 本研究对17个伞滑刃线虫群体进行形态学系统性比较,初步鉴定出8个松材线虫群体和6个拟松材线虫群体,2个明显区分于两者的伞滑刃线虫属种。应用rDNA中ITS的PCR-RFLP分析对形态学特征极其相似的来自中国、日本和韩国的松树或木质包装箱中分离出来的伞滑刃线虫属6个群体进行了分子鉴别。其中来自浙江镇海的松树和日本的木质包装箱中分离出的各一线虫群体被鉴定为松材线虫,而来自浙江富阳的松树和韩国、香港及日本的木质包装箱中的另一群体等4个群体被鉴定为拟松材线虫。本研究中选用的4种限制性内切酶(HinfⅠ、HaeⅢ、MspⅠ、cfoⅠ)的特异性酶切位点均可以有效地鉴别松材线虫和拟松材线虫。同时对来自中国浙江病死木和中国香港木质包装箱的两种伞滑刃线虫进行了形态与rDNA-PCR-RFLP的分析,结果显示来自浙江的伞滑刃属线虫为B.rainulfi,而来自香港的则为B.thailandae,两者均为在中国首次报道。此外运用clustalx1.8、Mega 2软件对所获得的上述四种伞滑刃线虫ITS序列以及从GenBank上下载的部分伞滑刃属线虫序列进行比对,并利用UPGMA法构建部分伞滑刃线虫系统树,12种伞滑刃线虫形成3个组群,反映了伞滑刃线虫属内种间的遗传学关系。 根据松材线虫及从GenBank上下载的其他伞滑刃线虫ITS序列,运用DNAstar软件进行比对分析,依据其在ITS1与ITS2上的差异,设计了松材线虫种的特异性引物。经检测,松材线虫种内群体能特异性扩增出长约580bp的片段,而拟松材线虫则为阴性,酶切与序列测定结果显示与ITS区序列相关部分完全吻合。将用于扩增28S RNA基因D2D3区的通用引物与特异性引物一起进行duplex-PCR扩增,结果所有的松材线虫株系均产生两大小分别约为770bp和580bp的片段;而其他线虫类群只能产生770bp左右的单一片段,无松材线虫种特异性片段。Duplex-PCR可对松材线虫进行种特异性检测,与其它的PCR方法相比,该方法具有灵敏、快速、有效等特点。 在对rDNA中ITS比较的基础上,该研究还探讨了28S RNA基因在分类和鉴定中的作用。通过对
参考文献：
[1]. 松材线虫和拟松材线虫分泌—排泄物的比较研究[D]. 董娜. 河北师范大学. 2003
[2]. 松材线虫和拟松材线虫分离方法的改进及其食道腺分泌物的提取和比较[D]. 任志禄. 河北师范大学. 2006
[3]. 松材线虫和拟松材线虫活体染色比较其分泌-排泄物[J]. 董娜, 田彦辉, 张路平. 河北师范大学学报. 2004
[4]. 松材线虫PCR快速检测方法的研究[D]. 刘裕兰. 重庆大学. 2007
[5]. 松材线虫和拟松材线虫分泌-排泄物蛋白组分比较观察[C]. 董娜, 张路平. 中国动物学会北方七省市动物学会学术研讨会论文集. 2005
[6]. 松材线虫体外酶组成分析[J]. 严东辉, 杨宝君. 林业科学研究. 1997
[7]. 伞滑刃线虫属和外滑刃线虫属部分种群的分类及分子鉴定研究[D]. 蒋立琴. 浙江大学. 2006