池海英[1]2001年在《重组逆转录—精原干细胞介导的转基因方法研究》文中进行了进一步梳理逆转录病毒法、精原干细胞介导法是制备转基因动物的手段。为了选择高效的基因转移的介导方式和理想的受体细胞，本研究建立了新的一种高效、稳定制备转基因小鼠方法。将感染滴度为3×10~6cfu/ml、携带Neo~R的重组逆转录病毒与台盼蓝、Polybrene按一定比例配制成注射液，单侧注射14～16日龄公鼠睾丸曲细精管内，于体内感染精原干细胞。45d后，收集性成熟公鼠精液，进行精液品质的检测，并利用根据Neo~R基因序列设计的叁对引物，对精子基因组DNA进行PCR扩增。实验结果表明，注射液对公鼠精液品质无不良影响，不影响公鼠繁殖力。10份被检精液样品中，有8份的PCR和套式PCR均为阳性，Neo~R基因在生殖系细胞上得到转移。在成功地实现了由重组逆转录病毒—精原干细胞介导的外源基因在生殖系细胞转移的研究基础上，建立了转基因小鼠的研究。在注射重组病毒45d后，与母鼠交配，共获得子代鼠48只。采取鼠尾，提取基因组，经PCR扩增，阳性鼠9只，Southern blotting检测，阳性鼠4只，3只为母鼠、1只为公鼠。将这4只F_0代小鼠与非转基因小鼠交配，共获得F_1代小鼠15只。应用PCR方法对15只F_1代小鼠进行检测，结果F_0代1号母鼠所生5只子鼠中有4只为阳性。以上结果表明，小鼠曲细精管内感染重组逆转录病毒后，能将外源基因整合入精原干细胞中，并通过精子将其携带入卵子中，获得了携带Neo~R的转基因小鼠，转基因阳性率为8.35％。这为逆转录病毒介导的外源基因在小鼠生殖系细胞水平的转移以及探索更为简捷而有效的转基因动物的生产方法打下了基础。
王凤阳[2]2001年在《重组逆转录病毒-精原干细胞介导的转基因研究》文中研究说明转基因动物技术作为生命科学领域中的一项重要的研究手段，广泛应用于医药、农业及生物学领域。自1980年Gordon等首次将显微注射技术用于小鼠受精卵的基因导入以来，人们对于转基因技术的研究与探索从未停止，因此，在显微注射技术不断发展和完善的同时，还相继建立了胚胎干细胞介导的基因转移，重组逆转录病毒介导的基因转移和精子载体法等转基因技术。但这些转基因技术普遍存在着操作复杂、投入较高、外源基因在受体细胞基因组上的整合率较低等不足之处。为了克服这些不足之处，本研究在多年跟踪国际转基因动物研究前沿的基础上，从选择高效的基因转移的介导方式和理想的受体细胞两个方面同时着手，进行了基因转移新技术的研究。 在众多的真核细胞基因转移技术中，动物病毒载体系统以其简单的基因组结构、比较清楚的分子生物学背景、易于改造和操作、转染率高等特点而最为引人注目，迄今已有数种病毒被改造为基因转移载体。其中，逆转录病毒载体-包装细胞系统被认为是在具有分裂功能的细胞中进行基因转移和表达最为成功的真核细胞基因转移技术。因此本研究选择重组逆转录病毒作为基因转移的介导方式。将3.7kb的LacZ基因片段分别插入到骨架为Moloney小鼠白血病病毒（MoMLV）、含有标记基因Neo~R的逆转录病毒载体pLXSN、pLNCX的5'ETR和CMV Promoter的下游，构建了含有LacZ的重组逆转录病毒载体pLNCL、pLLSN。运用脂质体、磷酸钙两种介质，以包装效率高、安全性好的包装细胞系PA317对pLNCX、pLXSN、pLLSN和pLNCL进行包装，得到了PA-1、PA-2、PA-3和PA-4四株产毒细胞。透射电镜下观察经差速离心法浓缩后的病毒悬液，观察到了具有逆转录病毒形态特征（球形，有囊膜，直径平均约为100nm）的重组病毒粒子。 精原干细胞属于未分化细胞，具有自增殖能力，可产生不断更新的干细胞及可定向分化的精原细胞，每次分裂形成的两个细胞，一个通过初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞等过程发育为精子，一个仍为干细胞，保持原始未分化状态和继续分裂增殖的能力。如果重组逆转录病毒介导的外源基因转染入精原干细胞，外源基因就会整合入精原干细胞基因组。由精原干细胞发育成熟的精子，就能够通过整合的方式携带外源基因，外源基因也会随干细胞增殖而复制并在干细胞中得到长期保留。这就克服了以受精卵作为目的基因载体时需要不断采卵和反复注射带来的巨额成本和繁重的工作强度等不足之处，从而提高转基因动物的生产效率。 由于以精原干细胞作为外源基因转染的靶细胞以建立转基因动物的研究具有极其重要的理论意义和实际应用前景。1997年，Kim JH等和本室赖良学等分别进行了脂质体包裹外源基因，曲细精管内转染精原干细胞的研究，并且各自得到了附睾精子和子代鼠整合检测的阳性PCR结果。Kim JH等还在睾丸组织切片中检测到了外源基因的表达。 中文摘要一 基于本研究以小鼠曲细精管内精原干细胞作为9懈塌因转染的靶细胞以建立转基因小鼠的目时为了 烙的重斑议臼色录病毒体内感染精原干细胞的效果，进行了含有ixc、NeoR基因的重组逆转录病毒体夕陋澡NIH3Th细胞的研究。将含有aH基因的浓缩病毒渤叨材摘滦NllB℃细胞，经多聚甲醛固定、Xwi染色，观察臣了蓝染细胞说明sxc基因获得表达。同时，将来自四株产毒细胞的浓缩病毒悬液分另u体夕h孜染NIH3Th细胞以测喉空逾跺嫡度，通过比较，含有标记基因Nr、由产毒细胞系PAZ所产生的浓缩重组逆转录病毒的感染滴度最高，过臣了3X106cllvilll。 在＄e了含有标记基因 Ne、感搁傲颤丝了 3 X 106 dilllTll的重组逆转录病毒的前提下经过注射条件和参数的多次优化，将pM台盼蓝、Poo按一定比例配制域注白比狡，单似收拄时ldsl6日龄公鼠寒丸曲细精管以体内感染精原干细胞。注射后4（hi，公圃倚溉进行精液品质（精子活率、精子顶体完整率、精于畸形率叁项指标）的匀觎o并利用根据M炉基因序列设计的叁对引物对精子基因组DNA进干了IWI；1和套式ICIt检狈。实验结果表明，注射液对公鼠精液品质无不良影响，不影响公鼠繁殖力。10 ff｝BfftZ；fR7so（品中，有8份为PCR和套式PCR附仕，说明Nd基因已经坐尧淮公鼠精子基因组中，从而首次成功地实现了M炉基因在公鼠生殖系细胞的转移。注射后45d，与母鼠交配，共获得子代鼠48只。采取鼠尾，提取基因组，利用根据Nej基因序歹uM的一对引物对子代鼠基因组DNA进行PCR检测，阳性鼠9只。经 Southern blotting检狈，阳性鼠 4只，其中 3只母鼠，l只公鼠。将这 4 ／q FO代小鼠与4F＄：FH因小鼠交配，共获得F；代小鼠15只。应用PCR方法（引物同FO代小鼠进行检测中使用的5！物）对这些F；代小励锁0，结果F；代1号母鼠听生5只子鼠中有 4只为阳胜。获得的转基因小鼠阳性率达到了 83％（4／48）。从而首次建立了重组逆转录病毒介导，以公鼠曲细精管内精原干细胞为9陇塌因转染的靶细胞的基因转移技术。并利用该技术成功的?
姚伟[3]2005年在《蚓激酶基因在山羊乳腺中的表达及其转基因小鼠的建立》文中研究说明本试验首先在山羊乳腺组织进行了蚓激酶的表达研究,然后利用逆转录病毒转染小鼠精原干细胞,旨在建立蚓激酶转基因小鼠,为最终获得其转基因山羊乳腺生物反应器奠定基础。首先将含有山羊β-酪蛋白基因(β-casein)5’区调控序列(BCP)、蚓激酶基因(lumbrokinase)以及牛生长激素基因polyA(BGHpolyA)序列的表达盒克隆到骨架为Moloney 小鼠白血病病毒(MoMLV)、含有标记基因NeoR 的逆转录病毒载体pLNCL 中,构建了蚓激酶重组逆转录病毒载体pLN-BCP-LKR。将其转染泌乳期奶山羊乳腺小叶,蚓激酶基因在乳腺组织实现了有效表达; 进而在脂质体介导下将pLN-BCP-LKR 质粒转染包装细胞PA317,获得可持续产生病毒颗粒的细胞克隆;利用重组逆转录病毒转染妊娠期奶山羊乳腺,在泌乳期采集乳汁检测蚓激酶表达,结果显示,蚓激酶在乳腺中实现了稳定表达。在上述试验基础上,将重组逆转录病毒制成转染液,单侧注射3 周龄公鼠睾丸曲细精管。待其发育成熟后,利用该公鼠进行繁殖,对获得的子代鼠进行目的基因的PCR 及Southern blotting 检测,结果显示:本试验获得了转基因小鼠,阳性率为8.8%。
覃金洲[4]2015年在《雄性生殖细胞介导的转基因技术的研究》文中指出雄性生殖细胞是指通过有性生殖繁衍后代的雄性生物生殖系统中能将遗传信息传递给后代的一类细胞,其中精原干细胞是整个机体内唯一贯穿一生,既可通过增殖维持自身数目稳定又能定向分化为精子的成体干细胞;同时,精原干细胞在自发或诱导条件下,具有分化为叁胚层的潜能,具有类似胚胎干细胞的特征而备受生物医学、转化医学和畜牧业广泛关注。目前对精原干细胞的研究主要集中在分子标记的筛选、体外培养体系建立及维持、经典及表观遗传修饰相关信号通路的研究、基于精原干细胞修饰的转基因动物制作以及睾丸组织块移植等领域,而这些研究中采用的免疫缺陷受体模型大大限制了精原干细胞的科研与应用,特别是实际生产及其在畜牧行业的推广;同时,基于精原干细胞显微移植的转基因动物制作具有一定的技术难度。因此,精原干细胞介导的简单易行的转基因动物制作策略亟需探讨。本研究主要着力于探究睾丸组织及精原干细胞非免疫缺陷移植受体模型制作的方法,探索体内简单易行的雄性生殖细胞介导的转基因技术的新方法。本研究获得如下结果:1,本研究探究了不同浓度的腺嘌呤(200mg/kg,260mg/kg,320mg/kg和380mg/kg)对非免疫缺陷大鼠(Sprague-Dawley,SD大鼠)睾丸的损伤情况,通过相关生理指标和睾丸切片观察,候选得到精原干细胞移植受体在SD大鼠体内的最佳的作用浓度(320mg/kg)。同时作为阳性对照,摸索了白消安(一种广泛使用精原干细胞受体模型制备的药物)在SD大鼠受体制作的合适作用浓度;从存活率、体重、睾丸指数及睾丸切片确定了腺嘌呤处理优于白消安处理,可作为替代方案阻滞内源性精子发生,为精原干细胞移植提供合适的微环境。同时,使用酶消化、差异贴壁及免疫磁珠分选等方法富集高纯度小鼠精原干细胞(Lin28阳性率达到84%,THY-1阳性率达到92%),同时利用体外慢病毒感染修饰的方法标记小鼠的精原干细胞,并移植到受体大鼠曲细精管内,首次检测到非免疫缺陷受体内异种移植完整的精子发生。本实验也使用细胞系和分离的原代生殖细胞及支持细胞作为研究对象,研究腺嘌呤对其体外作用机理;使用TUNEL证实染色体中DNA发生断裂,使用蛋白免疫印迹实验检测到了凋亡早期相关蛋白Caspase3和凋亡执行蛋白PARP浓度依赖性表达,初步探明了腺嘌呤通过诱导细胞凋亡对生殖细胞产生了特异的生殖毒性。2,本研究使用慢病毒体内感染雄性生殖细胞的策略,获得了超过67%的转基因后裔,生殖能力正常,外源转基因可稳定遗传给后代;同时也揭示了该策略与亲本年龄及慢病毒注射部位没有相关性(P>0.05),这提示我们可以在大家畜中尝试使用慢病毒注射睾丸间质部位获得转基因后裔,简化大家畜生产及育种中的繁琐环节和技术难题。同时,也比较了不同慢病毒系统对睾丸内精原干细胞感染能力,与慢病毒p CD513B-CMV-MCS-EF1相比,慢病毒p Lenti V-H1-MCS-CMV感染精原干细胞之后获得的转基因后代能正常表达外源转基因片段;进一步研究揭示不同慢病毒整合到子代基因组后,外源基因启动子序列甲基化水平存在显着差异:前者外源转基因片段启动子甲基化水平高达87.8%,而后者仅为45.5%。本研究为以后使用慢病毒载体制作转基因动物特别是对于曲细精管移植难于实现的大家畜提供了新思路。3,本研究探索了使用非免疫缺陷小鼠(成年昆明小鼠)作为睾丸组织块移植的受体,既可以完成同种不同品系间睾丸移植的精子发生,也首次检测到异种睾丸组织块移植后(大鼠睾丸移植到小鼠皮下),具有完整的异源精子发生。本研究同时发现,使用大量的睾丸组织块移植到非免疫缺陷受体小鼠皮下检测到移植组织块经历了破碎、重塑进而完成精子发生的过程;同时也发现在非免疫缺陷小鼠使用免疫抑制剂可提高异源组织块存活和完成精子发生的成功率,将完整精子发生的成功率从2-5%提高到了8.3%,并且重现了移植组织块经历破碎、重塑进入完成精子发生的过程,为精子发生及睾丸组织发育的研究提供了新模型,可为转基因动物制作提供新途径。综上所述,本研究着力探索了非免疫缺陷受体模型下精原干细胞研究的两大策略:其一是基于精原干细胞移植的相关研究,另一个是睾丸组织块移植的研究。探究了腺嘌呤作用于SD大鼠(免疫正常大鼠)睾丸组织生殖毒性,获得一种新型的可用于精原干细胞移植受体模型,经过输出小管移植获得了完整的异种移植精子发生;同时优化了基于慢病毒载体的依赖精原干细胞转基因动物制作的途径,从甲基化水平揭示了不同载体不同启动子在体内表达外源基因差异的原因。同时也对非免疫缺陷受体皮下睾丸组织块移植进行了探索,配合使用免疫抑制剂提高了异源组织块存活率和精子发生率。本研究对于精原干细胞功能、精子发生及睾丸组织发育提供了新见解,对于转基因动物制作提供了简单易行的策略,对于大家畜种和珍稀动物在生物学研究及实际应用具有重要意义。
张学明[5]2005年在《小鼠精原干细胞培养体系的优化及体外基因转移》文中指出系统评述了精原干细胞(SSCs)研究目前的进展,进一步优化了小鼠SSCs 的培养体系,探讨了其体外转基因的方法和条件。结果表明,盘化法结合差速贴壁法比Percoll 法更适于SSCs 富集;培养液中添加表皮生长因子及雌二醇-17β对SSCs 的体外培养有良好作用。创造性地建立了稳定表达小鼠胶质细胞源神经营养因子(GDNF)的转基因STO 细胞饲养层STOGDNF,并证明其对SSCs 的体外培养有显着效果。成功构建了携带人组织纤溶酶原激活剂基因t-PA 的逆转录病毒载体PLNC-tPA、PL-tPA-SN 并获得了稳定产毒的PA317 包装细胞;以优化的培养体系为基础,用PLNC-tPA、PL-tPA-SN及真核表达载体pcDNA3-tPA以3种方式对SSCs进行体外转染,移植后初步分析认为,将SSCs 培养于STOGDNF 饲养层上,用脂质体—pcDNA3-tPA 转染或用产毒PA317 的培养上清一次性感染,均适于将外源基因导入SSCs 基因组。
陈青, 曹文广[6]2011年在《动物转基因新技术研究进展》文中研究指明动物转基因技术是将外源基因导入动物体内,外源基因随机整合或定点整合(打靶)在染色体基因组上并得到表达和遗传的生物技术。该技术自发现以来,在畜牧业、医药产业、环境保护以及新型生物材料等领域已得到了广泛应用。本文主要就近年来迅速发展起来的慢病毒载体导入法、精原干细胞法、锌指核酸酶介导的基因打靶、RNA干扰介导的基因沉默等新的高效转基因技术进行了概述。
刘殿峰[7]2006年在《蚓激酶基因在牛乳腺中的表达及其转基因兔的建立》文中研究表明为了建立乳腺生物反应器,获得蚓激酶在牛乳腺中表达,本研究采用分子生物学与转基因技术,构建了蚓激酶乳腺特异性表达载体及逆转录病毒载体,在牛乳腺组织中进行了蚓激酶的表达研究,然后利用逆转录病毒转染家兔精原干细胞,旨在建立蚓激酶转基因家兔,为最终获得其转基因奶牛乳腺生物反应器奠定基础。首先构建了以山羊β-酪蛋白基因(β-casein)5′区调控序列(BCP)为启动子、蚓激酶基因(lumbrokinase,LK)为目的基因的乳腺特异性表达载体pBLK,然后将BCP与LK表达盒克隆到骨架为Moloney小鼠白血病病毒(MoMLV)、含有标记基因NeoR的逆转录病毒载体pLNCL中,构建了蚓激酶重组逆转录病毒载体pLN-BCP-LK。将上述两个载体转染泌乳期奶牛乳腺小叶,蚓激酶基因在乳腺组织实现了有效表达;进而在脂质体介导下将pLN-BCP-LK质粒转染包装细胞PA317,获得可持续产生病毒颗粒的细胞克隆;利用重组逆转录病毒转染妊娠期奶牛乳腺,在泌乳期采集乳汁检测蚓激酶表达,结果显示,蚓激酶在乳腺中实现了稳定表达。在上述试验基础上,将重组逆转录病毒制成转染液,单侧注射3月龄雄性家兔睾丸曲细精管。待其发育成熟后,利用该家兔进行繁殖,对获得的子代兔进行目的基因的PCR及Southern blotting检测,结果显示:PCR及Southernblotting检测结果一致,本试验获得的转基因家兔阳性率为6.25%。
张鑫[8]2009年在《睾丸注射法生产转基因小鼠效率的研究及抗菌肽Thanatin转基因小鼠的建立》文中提出在过去的近30年中,转基因技术在哺乳动物基因表达方面的研究应用,已经成为实验生物学及应用生物学领域最为显着的进展之一。传统的制作转基因动物方法有显微注射法、逆转录病毒感染法和胚胎干细胞法等,但每种方法都有其缺陷,限制了其在今后转基因动物研究中的广泛应用。通过睾丸注射法对体内生殖细胞进行外源基因转染是近些年来发展起来的一种进行转基因动物研究的新方法。由于其操作简便、成本低廉、效率较高且适于大量生产转基因动物的优点而越来越受到关注。但由于该方法起步较晚,目前还存在许多问题。因此,对该方法进行研究和完善,对今后制作和生产转基因动物,培育抗病动物品种以及通过建立转基因动物生物反应器生产珍贵蛋白等都具有重要意义。本研究共分叁部分:第一部分:小鼠精子形成各阶段转基因效率的研究本试验对小鼠体内生殖细胞进行外源基因转染,研究精子形成过程中制作转基因小鼠的效率。首先运用睾丸注射法将被脂质体包裹的绿色荧光蛋白表达载体(pIRES2-EGFP)注射到公鼠睾丸及附睾内,然后根据精子形成不同阶段,分别于注射后7d、16d、30d和42d与发情母鼠合笼,利用PCR和Southern印迹方法对新生小鼠进行基因组DNA检测。在各阶段所得新生小鼠中PCR阳性率分别为6.82%、0、56.86%和、42.86%,Southern印迹检测阳性率为分别为6.82%、0、47.06%、34.69%,经活体荧光成像系统及荧光显微镜分析,转基因小鼠呈现绿色荧光表达。通过比较精子生成各阶段转基因效率高低,为以后通过用睾丸内注射法转染雄性生殖细胞高效制作转基因动物提供了理论依据。第二部分:睾丸注射法在不同生精周期制作转基因小鼠效率的研究运用睾丸注射法将被脂质体包裹的绿色荧光蛋白表达载体(pIRES2-EGFP)注射到公鼠睾丸内,然后根据小鼠精子的形成周期,分别于注射后第42d、84d、126d、168d和210d即注射后连续5个周期内与正常发情母鼠合笼,利用PCR和Southern印迹方法对新生小鼠进行基因组DNA的跟踪检测。在各阶段所得新生小鼠中PCR阳性率分别为36.36%、17.78%、12.50%、10.87%、4.65%,Southern印迹检测阳性率为分别为31.82%、13.33%、8.33%、6.52%、2.33%,经活体荧光成像系统及荧光显微镜分析,转基因小鼠呈现绿色荧光表达。通过比较不同精子生成周期的转基因效率,初步表明精原干细胞可以长时间携带外源基因,但其效率随时间的延长而明显降低,这为今后通过用睾丸内注射法转染精原干细胞制作转基因动物提供了基础理论。第叁部分:睾丸注射法建立抗菌肽Thanatin转基因小鼠的初步研究人工合成抗菌肽Thanatin基因的叁条片段,利用重迭延伸PCR扩增技术得到完整的Thanatin基因,通过分子克隆方法构建出pIRES2-EGFP-Thanatin重组表达载体。然后与脂质体混合,采用睾丸打点注射将新构建的抗菌肽基因注入小鼠睾丸内,共注射公鼠5只。6周后与雌鼠交配,对F1代新生小鼠进行断尾,提取尾尖基因组DNA,利用PCR和Southern印迹方法对其进行检测,从检测阳性小鼠中随机挑选公、母鼠各3只分别与正常小鼠交配,用PCR方法对F2代进行检测。结果得到的52只F1代鼠中PCR检测阳性率为38.46%,Southern印迹检测阳性率为30.77%;转基因阳性小鼠所生55只F2代中,PCR检测阳性率36.36%;在活体荧光成像系统下转基因小鼠呈现绿色荧光表达。通过睾丸注射法使Thanatin基因在小鼠的基因组中得到整合,为今后进一步研究抗菌肽的作用机理、培育抗病动物品种以及今后通过建立转基因动物生物反应器进行抗菌肽的大量生产打下了基础。
何湃[9]2009年在《慢病毒载体介导MxA基因感染鸡精原干细胞及其体内移植》文中研究指明目的:构建人抗病毒基因MxA的重组慢病毒,体内及体外感染鸡精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs),并将体外感染MxA基因的SSCs移植至受体公鸡睾丸内,检测MxA基因在睾丸内的分布及表达,并收集精液,检测精子DNA中MxA基因的存在情况,以期得到携带目的基因的转基因精子。方法:本实验利用TOPO克隆技术,构建EGFP-MxA融合基因的重组慢病毒表达载体,经PCR及酶切鉴定EGFP-MxA插入载体的方向正确,且没有引起基因重排;重组载体导入真核细胞293FT细胞后,能表达EGFP-MxA融合蛋白特征性的颗粒状绿色荧光。在此基础上,通过脂质体介导,载体质粒与慢病毒包装质粒pLP1,pLP2和pLP/VSVG共转染293FT细胞,制备MxA重组病毒,超滤浓缩病毒,检测病毒滴度。分离培养25 d公鸡睾丸组织中的SSCs进行MxA重组病毒的体外感染,取出一定数量SSCs移植至预先用白消安处理的受体公鸡睾丸内,取睾丸组织进行RT-PCR检测目的基因的转录水平,并制作冰冻切片进行绿色荧光观察,免疫组化确定目的基因的分布与表达,同时采集受体鸡精液,提取精子中DNA,检测精液中目的基因的表达情况。本实验也同时进行了重组病毒对鸡精原干细胞的体内感染:将重组病毒直接注射至受体公鸡睾丸内,检测目的基因在睾丸及精液中的表达情况。结果:1. PCR及双酶切实验证明了EGFP-MxA融合基因重组慢病毒表达载体的成功构建。2.比较不同载体质粒与脂质体浓度比例,不同包装细胞接种密度,病毒收集时间,以及不同包装细胞培养温度等不同实验条件下收集到的重组慢病毒滴度,确定最佳的病毒包装条件:a.最佳载体质粒与转染脂质体的用量比例:载体质粒:包装质粒:脂质体(质量体积比) = 1:3:4b.最佳包装细胞接种密度:包装细胞接种密度= 1×105个/mlc.最佳包装细胞培养温度:包装细胞培养温度= 37℃d.病毒最佳收集时间:病毒收集时间= 48 h3.重组病毒进行超滤浓缩,病毒滴度可达到107 cfu/ml4.体外感染鸡精原干细胞48 h后,荧光倒置显微镜下可观察到EGFP-MxA融合蛋白特征性的颗粒状绿色荧光,RT-PCR,免疫细胞化学法在转录水平和翻译水平证实了融合基因可在SSCs中正确表达。移植后的受体鸡睾丸RT-PCR及冰冻切片的免疫组化实验均检测到目的基因的转录与表达,且受体鸡精子DNA中成功检测到MxA基因的存在。5.体内感染鸡精原干细胞后,RT-PCR及冰冻切片的免疫组化可检测到目的基因的转录及表达,但精子DNA中未能检测到MxA基因的存在。结论:重组病毒通过体外感染SSCs,并移植到受体鸡体内,比直接注射受体鸡睾丸具有更高的基因传递效率,为进一步利用MxA抗病毒基因遗传修饰后的精原干细胞结合体内移植技术获得抗病毒转基因鸡奠定了良好的基础。
阿拉达尔[10]2007年在《山羊精原干细胞体外培养体系的建立与移植研究》文中认为精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)是成年雄性动物体内唯一能进行终生自我更新,并且遗传亲代基因给予子代的一类二倍体永生细胞群,精原干细胞既有胚胎干细胞的发育特性又能发育成单倍体生殖细胞,也可以进行基因修饰后,将外源基因转移给后代。所以精原干细胞可以成为体外操作理想的干细胞群体。十年来小鼠精原干细胞培养和移植探索的不断完善,为各种哺乳动物及人类精原干细胞培养体系的建立和移植实验提供了新的思路和技术平台。本实验主要对山羊精原干细胞群体的富集、培养以及移植做了初步探索,结果如下:1.对2~3月龄的山羊睾丸做切片观察,发现曲细精管中细胞形态比较单一,生精上皮还没有进入生精周期,通过免疫组化染色发现在曲细精管基底膜有大量PGP9.5+精原干细胞。适合做精原干细胞体外培养的供体来源。采用两步酶消化法,0.1%胶原酶和0.1%透明质酸酶消化20 min,0.25%胰酶+0.04% EDTA+5μg/mL DNaseⅠ处理5 min,就可以使睾丸生殖细胞充分分离处出来,每克睾丸组织克获得8.4±2.6×106个细胞,其中PGP9.5+精原细胞占(19.7±5.3)%,c-kit+精原细胞占总数的(23.8±3.6)%。2.为了提高纯化方法富集PGP9.5+细胞的效率,本试验对比了Percoll法、差速贴壁法和盘化法。通过收集27~35%Percoll梯度间的细胞或盘化法纯化后,回收精原细胞纯度(包括PGP9.5+和c-kit+细胞)均达到82%以上,其中PGP9.5+细胞分别占(63.6±3.2)%和(71.9±4.1)%,而c-kit+分别占(21.2±1.8)%和(11.5±0.8)%。而差速贴壁法回收的精原细胞纯度可达60%左右,但其中c-kit阳性细胞所占比例较大。这叁种方法中盘化法回收细胞的活力最高。3.对山羊精原细胞体外培养生长行为进行了研究。将组织消化后的细胞在不添加生长因子和没有饲养层的情况下建立支持细胞和精原细胞(SC-SSC)共培养体系。我们在血清浓度为2.5%的培养体系内,第7d观察到有精原细胞克隆形成。原代SC-SSC共培养体系精原细胞克隆分布不均匀,在培养得7～10d,培养皿周边长出许多鸟巢状集落。在培养皿中心也可看到贴附予铺展开得体细胞上增殖的细胞集落。但集落形态松散,细胞之间连接不紧密。传代后,生殖细胞增殖没有退化的速度快,随着精原细胞死亡和分化,数量逐渐减少,一般维持不过第3代。我们将盘化法纯化的细胞接种到分裂抑制的MEF饲养层上培养,细胞贴壁较快,2～3d时开始增殖,5～6d出现16细胞以上的小细胞簇。但不添加生长因子时细胞增殖速度比较缓慢,脱落死亡的细胞比增殖的细胞多,集落会慢慢消失。4.本试验参考小鼠精原干细胞长期培养的方法加以改进,得到了较理想的山羊精原干细胞细胞培养体系。考虑到血清因素对干细胞增殖的影响和高浓度血清会加快体细胞增殖,我们没有采用文献中经常提到的10%FBS,而是采用了2.5%的FBS,并且在培养体系内添加GDNF、LIF和bFGF后,明显促进了山羊精原干细胞增殖,对精原细胞克隆形态的维持和体积的增大都有促进作用。GDNF对精原干细胞增殖的影响与剂量有关,高剂量的GDNF更有利于细胞增殖和克隆体积的增大。而LIF对山羊精原细胞增殖并无显着影响,但在干细胞克隆形态的维持上起到较好的作用。GDNF和bFGF联合使用时加快了精原细胞增殖和克隆的数量,提示在体外培养时,GDNF和bFGF协同作用,可以提高精原干细胞增殖小生境的数量。我们在2.5%FBS,和添加100ng/mL GDNF、10ng/mL LIF和10ng/mL bFGF结合MEF饲养层的培养体系下使山羊精原干细胞在体外至少培养了叁个月。5.本试验对新鲜分离的山羊精原细胞进行了异种移植实验。首先我们采用没有经过免疫抑制的昆白鼠做为受体动物。40mg/kg体重的白消安处理,对受体小鼠的生精能力破坏最大,处理后4～6周可作为无内源性生殖干细胞的受体,用于精原细胞的异种移植。白消安对生精能力的破坏是可以恢复的,大概在注射后10周左右,有内源生殖细胞开始增殖。采用曲细精管注射的方法使小鼠睾丸充盈率达到50%左右。供体山羊精原细胞经过PKH26红色荧光染料染色后,在荧光显微镜下可以与小鼠睾丸的内源生殖细胞区分开。并且PKH26可以随着细胞分裂,转移到子代细胞中。所以可以在一段时间内在体内追踪到目的细胞。山羊精原细胞移植到小鼠曲细精管后,可以附着在曲细精管基膜上,进行增殖,但移植后一个月左右,外源细胞明显减少。通过组织切片观察到小鼠自身生殖细胞开始增殖。可能是由于内源性细胞增殖后对外源山羊精原细胞产生了排斥。6.本试验对屠宰场收集到的不同体积的山羊睾丸进行了注射实验,为将来活体同种移植山羊精原干细胞建立有效的移植方法。由于山羊睾丸与小鼠睾丸解剖学上的不同,对小鼠睾丸的采取的曲细精管注射法和输出管注射法,在山羊上是不可取的。所以我们对山羊睾丸网进行注射实验,并且对注射部位进行了比较。结果显示外睾丸网注射法比内睾丸网注射法成功率要高,曲细精管充盈率也相对较高。超声波介导的的注射方法与徒手注射进行比较,二者对体积大的睾丸注射成功率相同,对小体积(8～25cm3)的睾丸采用徒手注射成功率更高一些。
参考文献：
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[8]. 睾丸注射法生产转基因小鼠效率的研究及抗菌肽Thanatin转基因小鼠的建立[D]. 张鑫. 山东农业大学. 2009
[9]. 慢病毒载体介导MxA基因感染鸡精原干细胞及其体内移植[D]. 何湃. 苏州大学. 2009
[10]. 山羊精原干细胞体外培养体系的建立与移植研究[D]. 阿拉达尔. 西北农林科技大学. 2007