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【摘要】目的：研究华蟾素对宫颈癌细胞珠SiHa细胞和Hela细胞的影响。方法：采用MTT法测定不同时间、不同浓度华蟾素对SiHa和Hela细胞的生长抑制作用；流式细胞仪检测华蟾素对宫颈癌Siha及Hela细胞周期的影响；划痕实验检测华蟾素对宫颈癌Siha及Hela细胞侵袭能力影响。结果：不同浓度的华蟾素作用于宫颈癌不同细胞珠24、48、72h 后，细胞生长显著变缓。与对照组相比较，华蟾素各浓度组G0/G1期细胞所占比例不断增加，S期细胞比例减少，G2/M期细胞比例无显著变化；不同华蟾素作用于宫颈癌Siha及siha细胞24、48h后，能够明显降低宫颈癌Hela细胞向远处转移的能力。结论：华蟾素能够抑制宫颈癌细胞珠Siha及Hela，细胞增殖且呈时间、剂量依赖性。药物华蟾素对宫颈癌Siha细胞无明显抑制作用。
【关键词】华蟾素；宫颈癌细胞；细胞增殖
【中图分类号】R453 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2017）12-0234-03
全球宫颈癌的发病率在女性恶性肿瘤中占第二位，仅次于乳腺癌。据世界卫生组织国际癌症研究署估计，2008年全球约530000例新发宫颈癌，85%发生在欠发达地区，59%发生在亚洲[1]。华蟾素注射液是由中华大蟾蜍全皮阴干后提练而成的中药复方制剂，蟾蜍提取物具有清热解毒、化瘀等多种作用[2，3]，并且大量研究已证实华蟾素对肝癌细胞[4]、胃癌细胞[5]、乳腺癌细胞[6]、膀胱癌细胞等均有一定的抑制作用。因此本文将华蟾素作用于宫颈癌SiHa及Hela细胞进行实验研究，探讨其对宫颈癌SiHa及Hela细胞抑制、增殖、迁移能力等影响。
1.材料与方法
1.1 材料
宫颈癌Siha细胞（上海桥杜生物科技有限公司，保存传代培养），宫颈癌Hela细胞（上海心语生物科技有限公司，保存传代培养），华蟾素购自安徽金蟾生化股份有限公司，RPMI1640培养基购自美国GIBCO公司，流式DNA检测试剂盒购自美国BECKMAN COULTER公司，链霉素购自Biowest公司，青霉素购自Biowest公司，胰酶购自GiBco，PBS液购自Hyclone，胎牛血清购自Hyclone，购自DMSO美国GIBCO公司。
1.2 方法
1.2.1细胞培养及分组
宫颈癌细胞珠Siha及Hela细胞，培养于含10%胎牛血清、100ug/ml链霉素、100U/ml青霉素的RPMI 1640细胞培养液中，37℃、5%C02培养箱中培养。
常规复苏、传代并培养，取对数生长期细胞用于实验。将细胞随机分为第１～５组，各组分别按照华蟾素０、1、10、100、1000ug/ml浓度加入细胞。
1.2.2 MTT法检测华蟾素对Siha及Hela细胞的抑制率
将对数生长期的Siha及Hela细胞株经胰酶消化，接种于96孔培养板中，每孔100μl（计数细胞密度为5×104个/ml），培养24h后吸出原培养液；每组设三个平行孔，继续培养24、48、72h后每孔加入20μl（5mg /ml）MTT溶液，继续培养4h。吸弃孔内培养上清液，每孔加入DMSO150μl，振10min。用酶标仪在490nm处测定各孔的吸光度A值(A490)，参考波长630nm。计算抑制率(R): R =1-（实验组A值/空白对照组A值）×100%。观察华蟾素对不同类型宫颈癌细胞的抑制作用。
1.2.3流式细胞仪检测华蟾素对宫颈癌Siha及Hela细胞周期的影响
将对数生长期的宫颈癌Siha及Hela细胞株经胰酶消化，接种于96孔培养板中，每孔100μl（计数细胞密度为5×104个/ml），培养24h后吸出原培养液；加入华蟾素继续培养至48h，用0.01M的PBS洗涤，800rmp，5min 2次，70%的冷酒精固定过夜；0.01M的PBS洗涤，800rmp，5min 2次，用含0.1% Triton X-100、50μg/ml RNAse的PBS混合液将细胞重悬，加入90ulPI(0.5mg/ml)避光孵育半小时后，用尼龙网过滤，然后流式细胞仪进行检测分析。
1.2.4划痕实验检测华蟾素对宫颈癌Siha及Hela细胞侵袭能力影响
将对数生长期的Siha及Hela细胞胰酶消化，制得细胞细胞悬液，接种于6孔板中，每孔5000个（计数细胞密度为1×106个/ml），37℃、5% CO2 培养箱培养24小时后，PBS洗一遍，然后通过直尺比量，利用200ul移液枪的Tip在单层细胞上进行划痕损伤，用PBS洗掉因为划痕而刮掉的Siha及Hela细胞，分别加入含不同浓度华蟾素的培养液培养细胞24、48小时后，于光学显微镜下测算各划痕的宽度，迁移能力以迁移率表示：细胞迁移率=(原划痕宽度-现划痕宽度)/原划痕宽度×100%。
1.2.5统计学分析
实验数据以-x±s表示，采用SPSS 17.0统计分析软件。
2.结果
2.1 MTT法检测华蟾素对宫颈癌Siha及Hela细胞的抑制率
MTT法检测不同浓度的华蟾素（1、10、100、1000μg/ml）作用于宫颈癌细胞珠Siha及Hela测定结果显示：当华蟾素作用于宫颈癌细胞珠Siha及Hela 24、48、72h后，可见细胞生长显著变缓。随着药物增强时间增长，抑制作用有增强趋势，差异有统计学意义(P＜0.01)。见表 1，表2。
3.3 划痕实验检测华蟾素对宫颈癌Siha及Hela细胞侵袭能力影响
细胞划痕实验结果示：当1、10、100、1000ug/ml 华蟾素作用于宫颈癌Siha及siha细胞24、48h 后，划痕宽度均大于对照组，通过公式计算各组细胞的迁移率发现：华蟾素组作用于宫颈癌Siha及HeLa细胞24、48h后，Siha细胞两个时间段与对照组相比，差异无统计学意义(P＞0.05)，Hela细胞迁移率均小于对照组，差异有统计学意义(P＜0.01)，显示药物华蟾素对宫颈癌HeLa细胞的迁移有一定的抑制作用，能够明显降低宫颈癌Hela细胞向远处转移的能力。药物华蟾素对宫颈癌Siha细胞无明显抑制作用。表5、表6。
3.讨论
宫颈癌在我国乃至全球女性恶性肿瘤发病率居第二位，仅次于乳腺癌，在女生殖系统恶性肿瘤中居第一位，严重威胁我国乃至全球妇女的生命健康。据世界卫生组织国际癌症研究署估计，2008年全球约530000例新发宫颈癌，85%发生在欠发达地区，59%发生在亚洲[1]。HPV疫苗可大量减少与HPV相关的宫颈病变及宫颈癌发病率和病死率，目前HPV疫苗研究日渐成熟，已进入市场推广阶段，因此，早期发现病因、早期治疗对于宫颈癌的治疗来说及其重要。
华蟾素注射液是由中华大蟾蜍全皮阴干后提练而成的中药复方制剂，蟾蜍提取物具有清热解毒、利水消肿、化瘀等多种作用[2，3]，并且大量研究已证实华蟾素对肝癌细胞[4]、胃癌细胞[5]、乳腺癌细胞[6]、膀胱癌细胞等均有一定的抑制作用。
本研究表明，华蟾素可以在体外通过诱导细胞凋亡，抑制宫颈癌Siha及Hela的增殖，能够促进宫颈癌细胞珠Siha及Hela的凋亡，能够明显降低宫颈癌Hela细胞向远处转移的能力。但是究竟是华蟾素中的何种活性成分有诱导细胞凋亡的作用，以及其通过哪些信号通路发挥作用，均有待进一步探讨。
【参考文献】
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论文作者:周俊1,刘明华2（通讯作者）
论文发表刊物:《医药前沿》2017年4月第12期
论文发表时间:2017/5/16
标签：细胞论文; 宫颈癌论文; 癌细胞论文; 划痕论文; 抑制论文; 宫颈论文; 作用论文; 《医药前沿》2017年4月第12期论文;