贾向志, 袁汉英, 马文煜, 李元, 李育阳[1]2001年在《人溶菌酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达》文中研究表明目的 利用巴斯德毕赤 (Pichia pastoris)酵母真核表达系统 ,构建真核表达载体 p PIC9K与人溶菌酶基因 (humanlysozyme,h L Y)的重组质粒 p PIC9K- h L Y,表达出具有活性的人溶菌酶 .方法 此项研究在本实验室构建的人溶菌酶(h L Y)基因与 p UC19的重组质粒 p UC19- h L Y的基础上 ,通过设计一对引物 ,用多聚酶链式反应 (PCR)扩增出人溶菌酶全基因片段后 ,将其克隆到巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体p PIC9K中 ,构建重组质粒 p PIC9K- h L Y,经 Bg1 酶切线性化后 ,用电穿孔法将其转入毕赤酵母细胞内 .通过 G418筛选 ,选到的高拷贝转化子经 PCR检测人溶菌基因与毕赤酵母染色体是否稳定整合 ,阳性克隆经甲醇诱导进行表达 .结果 序列测定 ,经 PCR扩增后的人溶菌酶基因与文献发表的序列相比 ,缺失 4个碱基 .我们决定采用重组 PCR法予以纠正 ,经序列测定结果正确 .用 PCR检测 ,人溶菌酶基因与毕赤酵母染色体稳定整合 .用甲醇诱导表达并以 SDS- PAGE分析 ,在 Mr为 15 0 0 0左右出现一条蛋白带 ,表达量约占上清总蛋白的 0 .47.Western Blot证实表达产物具有天然人溶菌酶的抗原性 .用黄色小球菌平板溶圈法鉴定表达产物具有人溶菌酶的活性 .结论 成功的构建了重组质粒 p PIC9K- h L Y并在毕赤酵母中表达了人溶酶基
贾向志[2]2001年在《人溶菌酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达》文中研究指明人溶菌酶（human lysozyme，hLY）参与机体的防御机制，有抗感染、抗肿瘤和免疫调节的作用，具有潜在的临床应用价值，在食品工业上也具有广泛的用途。人溶菌酶属于溶菌酶中的C型。通常人溶菌酶是从人乳或胎盘中少量提取获得。由于来源困难，不能进行工业化生产，而采取DNA重组技术，从原核或真核表达系统生产人溶菌酶是解决其供需矛盾的有效途径。 常规的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）表达系统已广泛应用，虽已积累大量经验，但也存在不足之处，如菌株生长速度慢、密度不高、外源蛋白的表达和翻译后加工都不够理想。巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris）表达系统，近年来已受到广泛重视，是一种非常具有潜力的真核表达系统。此系统不但能克服酿酒酵母表达系统的不足，而且具有高分泌、高稳定和高表达叁大显着特点，分泌蛋白糖基化适中，外源蛋白的表达水平也比酿酒酵母高。 本研究是以pUC19-hLY重组质粒DNA为模板，通过计算机辅助分 MWpeffertwewdeteat析，设计合成两对引物J，PZ人 其 5’端和 3’端分别带有 Xhd，ECORI酶切位点。通过多聚酶链式反应（PCR），扩增出人溶菌酶基因片断，并克隆至pGEM1载体中，经小量提取质粒，酶切鉴定筛选出阳性克隆。同时将其克隆至测序载体pBSKS“中。经小量质粒提取，酶切鉴定筛选出阳性克隆后用双脱氧链终止法进行核昔酸序列分析，结果与发表的人溶菌酶序列相比，在47斗8…之间缺失四个碱基＊AT G。我们决定用P＊R定点诱变，根据缺失的位置，设计并合成一对引物①3，P4），P3引物为6’－TGGCTACAGGGGAATCAGCC－3’），P4 引 物 为（5’－TCCATTCCCAATCTTTTCAGTGTTC。3’），以缺失AATG 的质粒pUC 119上LY为模板，进行 PCR扩增。将扩增产物切胶回收后进行自身连接，再转化到 Ecoli JM109中。对平板菌用 M13－47／RV－M进行 PCR检测。提取质粒 DNA，用 MI3，47引物测序，结果与文献发表的人溶菌酶序列完全一致。为了便于G4筛选高拷贝转化于，然后通过PPICg表达载体过渡到毕赤酵母表达载体pPICgK上，构建重组pPICgK七LY质粒。按照Invitrogen公司提供的方法，用Bglll酶将其线性化后，用电穿孔法转化至毕赤酵母mMDll68）感受态细胞。通过m．56）G418的压力筛选，能抗 sing／mlG4的转化子被选出。为了进一步证实 hLY基因与毕赤酵母菌侣MDll68）染色体基因组的整合，我们提取酵母菌总DNA，PCR法分析鉴定山LY稳定整合毕赤酵母菌SMDll68染色体基因组。我们选择能抗 4mg／ml和 sing／mlG418的重组子进行诱导表达。表达产物用SDS－PAGE测定，分于量约为15KD，与hLY分子量14．7KD接近；用薄层扫描分析，分泌蛋白占上清液总蛋白含量的46．7％（诱导72h和32．l％（诱导32h卜用免疫印迹将表达产物转移至硝酸纤维素膜上，用抗人溶菌酶抗体与之反应，加底物显色后，在人溶菌酶蛋白所在位置可显小一条特异性条带，说叨农达产物具有人溶凶酶的抗原性；川放色小球 －3· 窜四罩臣大像皿士快不菌琼脂平板溶圈法鉴定表达产物具有人溶菌酶的生物活性。以上实验证实表达产物为rhLY。 以上研究工作将为下一步提取、纯化和对工程菌株稳定性监控，大规模发酵条件的摸索，打下一定基础。
宋宛霖[3]2014年在《海参溶菌酶基因密码子优化及其在毕赤酵母中的表达》文中研究说明溶菌酶(lysozyme,EC3.2.1.17),又称胞壁质酶(muramidase)。根据免疫学特性、催化活性及空间结构,可以将溶菌酶分为六类。目前,国内外对溶菌酶的研究主要集中在c-型人溶菌酶以及c-型和i-型水产动物溶菌酶。研究发现,水产动物i-型溶菌酶对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌有显着地抑菌效果,能够代替抗生素等抑菌产品,具有广泛的应用价值。但目前,产业化存在很大问题。实验多以大肠杆菌为表达宿主,但其表达容易出现包涵体且酶活较低。本实验将海参溶菌酶基因导入毕赤酵母中进行表达,克服了包涵体的问题,但是,蛋白表达量很低。为解决这个问题,本实验通过对海参溶菌酶基因密码子进行优化,提高表达量。本实验根据毕赤酵母特有的密码子偏好特性结合AT含量有效控制的方式改变基因,对基因密码子进行一定程度的优化并调整发酵条件来提高产量。实验中,将优化后的海参溶菌酶基因(SjLys')经化学合成得到目的基因片段,再将带有海参溶菌酶基因的克隆载体pMD18-T-SjLys',进行EcoRI和NotI双酶切处理,然后,构建到表达载体pPIC9K-SjLys'。新构建的表达载体转化至毕赤酵母GS115中,利用MD、MM固体培养基,筛选出具有甲醇缓慢表现型的菌株。将上述菌株,结合含1mg/mL～4mg/mLG418的YPD培养基,筛选高效表达的菌株,共256株,并具有抑菌活性。经1%甲醇诱导表达72h后,TCA沉淀处理发酵液,SDS-PAGE分析蛋白的表达,筛选出最优表达量的菌株 pPIC9K-SjLys'-8-27。本研究成功将优化的海参溶菌酶基因在毕赤酵母中得到重组表达。实验结果发现,通过对海参溶菌酶基因密码子优化后,蛋白表达量明显提高。研究为进一步研究海参溶菌酶结构与功能及其纯化奠定了基础,也为今后的大规模的工业化生产提供了依据。
黄鹏, 阎丽萍, 张宁, 石金磊[4]2018年在《利用GAP启动子在毕赤酵母中组成型表达人鹅型溶菌酶2》文中研究说明利用甘油醛叁磷酸脱氢酶(glyceraldehydes-3-phosphatedehydrogenase,GAP)启动子在毕赤酵母中表达人鹅型溶菌酶2(human goose-type lysozyme 2,h LysG2),并在小试规模建立一套有效的重组hLysG2(recombinant hLysG2,rhLysG2)生产工艺流程。根据毕赤酵母密码子偏爱性设计并人工合成hLysG2基因,将其连接至pGAPZαA质粒中,构建重组表达质粒pGAPZαA-h LysG2。将重组表达载体线性化后电转化毕赤酵母GS115感受态细胞,通过Zeocin抗性筛选获取高拷贝重组菌株,并在5L生物反应器中进行发酵培养。发酵60h后发酵液上清酶活性达到最高,发酵液上清经SDS-PAGE及Western blot检测证实rhLysG2得到表达。与诱导型表达相比,组成型表达发酵时间缩短了48h,上清中rhLysG2总活性提高了23. 8%;使用甲壳素亲和层析和分子筛层析对rhLysG2进行纯化后,每升发酵液上清可纯化到187. 4mg重组蛋白,纯化产物纯度达99. 0%以上;浊度测定法分析显示,在pH 5. 6、30℃和0. 1mol/L Na+的条件下,rhLysG2可达到最大酶活性13 500U/mg。利用GAP启动子在毕赤酵母中成功表达了高纯度和高活性的rh LysG2,避免了甲醇的使用,缩短了发酵时间,提高了蛋白产量,为将rhLysG2开发为新型抗耐药菌药物奠定了基础。
参考文献：
[1]. 人溶菌酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达[J]. 贾向志, 袁汉英, 马文煜, 李元, 李育阳. 第四军医大学学报. 2001
[2]. 人溶菌酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达[D]. 贾向志. 第四军医大学. 2001
[3]. 海参溶菌酶基因密码子优化及其在毕赤酵母中的表达[D]. 宋宛霖. 大连工业大学. 2014
[4]. 利用GAP启动子在毕赤酵母中组成型表达人鹅型溶菌酶2[J]. 黄鹏, 阎丽萍, 张宁, 石金磊. 中国生物工程杂志. 2018