昔奋攻[1]2004年在《部分蜘蛛牵丝Ⅰ型蛋白基因合成及其聚合体的表达研究》文中指出蜘蛛牵丝是构成蜘蛛网的框架丝，是目前已知强度最高的天然蛋白质丝，能够与市售制造防弹衣的人工合成纤维相媲美。它由牵丝Ⅰ型蛋白和牵丝Ⅱ型蛋白按3:2的比例构成，这两种蛋白质丝在结构上存在许多相似之处，其N端均为串联重复结构，包括由多聚丙氨酸构成的β折叠结构和由其它氨基酸构成的α螺旋与β转角结构，C端含有约100多个氨基酸组成的非重复区。各串联重复区之间以及其与非重复结构区间无其它散在元件。研究表明牵丝的强度主要取决于β折叠结构，而弹性则主要来源于α螺旋和β转角结构。现推测牵丝Ⅰ型蛋白较牵丝Ⅱ型蛋白具有更高强度。 本工作以1990年Xu等人报道的金纺者牵丝Ⅰ型蛋白基因序列为基础，通过RNA二级结构分析确立使其结构能级达到较低的密码子，分别合成含有叁组多聚丙氨酸的牵丝Ⅰ型蛋白部分重复区序列(单体)及其3’端非重复区多肽基因，并在第叁组多聚丙氨酸结构中增加或减少一个丙氨酸，得到叁种不同的单体基因。再经过酶切、连接分别获得重复区为2、4、8、16拷贝的聚合体，并将它们与3’端非重复区基因连接获得15种牵丝Ⅰ型蛋白基因类似物。序列比对显示：合成基因八聚体与报道基因所编码氨基酸同源性高达84％，二者具有类似mRNA二级结构。 另根据重复区基因编码的多肽序列合成含有α螺旋和β-转角结构的半抗原短肽(17AA)，通过MBS与抗原KLH连接，连接产物经乳化后免疫成年雄性新西兰大耳白兔和20g以上雄性Bab／c小鼠，每两周免疫一次，共免疫5次，得到效价为64×10~4的兔抗血清及效价为1.0×10~4的鼠抗血清，用于检测合成基因的表达。 将上述不含非重复区序列的2、4、8聚合体分别克隆大肠杆菌表达载体，经IPTG诱导后，表达菌体总蛋白的SDS-PAGA电泳检测未见明显特异表达带，Western-blot显示无特异带。但采用利福平阻断菌体基因表达，并在培养基中添加~(35)S-Met，通过放射自显影可见由T7启动子起始的特异目的基因表达带。 将含有非重复区序列的叁种二聚体和叁种四聚体克隆真核表达载体，分别转染CHO(中国仓鼠卵巢细胞)、293T(SV40大T抗原转化的人胚肾细胞)、NBK(新生牛肾细胞)及CV-1(猴肾细胞)系，RT-PCR检测表明具有特异mRNA转录，间接免疫荧光显示目的基因在真核细胞中获得表达，且表达产物趋向于分布在细胞膜上。转染细胞经Zeocine抗性筛选及多次稀释培养，获得稳定表达目的基因的纯系CHO细胞克隆。
昔奋攻, 朱洪云, 李宁, 吴常信[2]2005年在《部分蜘蛛牵丝Ⅰ型蛋白基因的合成及其聚合体在大肠杆菌中的表达》文中进行了进一步梳理已知蜘蛛牵丝Ⅰ型蛋白N端序列不完整,有大量多聚丙氨酸基序组成的重复区。根据已报道的金纺者(Nephila clavipes)相应基因序列,合成若干寡核苷酸链,通过PCR获得编码涵盖叁组多聚丙氨酸基序的基因片断。并以此为单体,经过酶切和连接获得重复区分别为2、4、8拷贝的聚合体。序列及RN A二级结构比对显示:所获8聚体与已报道基因编码的氨基酸同源性高达84%,但8聚体基因m RN A具有较低能级。将上述3种聚合体基因分别克隆大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体pET-30a(+),经IPTG诱导、利福平阻断菌体基因表达及在培养基中添加35S-M et,通过放射自显影可见由T7启动子引发的特异目的基因表达带。
参考文献：
[1]. 部分蜘蛛牵丝Ⅰ型蛋白基因合成及其聚合体的表达研究[D]. 昔奋攻. 中国农业大学. 2004
[2]. 部分蜘蛛牵丝Ⅰ型蛋白基因的合成及其聚合体在大肠杆菌中的表达[J]. 昔奋攻, 朱洪云, 李宁, 吴常信. 农业生物技术学报. 2005