何云鹏 陶慧慧 刘群红
（安徽理工大学医学院 安徽淮南 232001）
【摘要】目的 观察RP多糖在体内对DHBV的抑制作用。方法 体内实验以先天感染DHBV的雏鸭为动物模型，将雏鸭(10只/组)随机分为5组(RP多糖高、中、低3个剂量组、3-TC组、生理盐水对照组)，均以20mg/kg/d灌胃给药10天。给药前1天、给药后5天、10天及停药后3天，均采用斑点杂交法观察血清中DHBV-DNA表达。结果 各剂量组RP多糖对DHBV均有相应的抑制作用。其中给药后第5天，高、中剂量组血清DHBV-DNA为0.77±0.27、0.69±0.15，第10天为0.57±0.11、0.49±0.19，与生理盐水对照组(1.32±0.56、1.24±0.53)相比明显降低。给药后第5天，RP多糖高、中剂量组对DHBV-DNA的抑制率为25.16%、25.35%，第10天为45.94%、48.28%，与生理盐水对照组对比显著提高。结论 RP多糖可降低血DHBV-DNA含量，对DHBV有抑制作用。
【关键词】菲律宾蛤仔多糖 鸭乙肝动物模型 乙型肝炎
【中图分类号】R392-3 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2014）04-0041-02
Experimental Study of Ruditapes philippinarum Polysaccharide
on Anti-DHBV in Vivo
He Yunpeng Tao Huihui Liu Qunhong
(School of Medicine，Anhui University of Science ＆ Technology，Huainan，Anhui 23200l，China)
【Abstract】 Objective: To observe the in-vivo inhibitory effect of RP polysaccharide on DHBV.Methods: 1-day old Beijing ducklings with congenital infection of DHBV were used as the animal model and were randomly divided into five groups(Namely, RP polysaccharide high dose group,medium dose group,low dose group,Lamivudine group and normal saline group).Each group of ducks were given the drug with the doses 20mg/kg/d for 10 days. The expression of DHBV-DNA was detected by dot-blot hybridization test 1day before treatment, five days and ten days during treatment, and 3 days after drug withdrawal, respectively. Results: In each group of the RP polysaccharide has corresponding inhibition on DHBV. After being medicated with RP polysaccharide for five days, in RP polysaccharide high dose group, medium dose group, Serum DHBV-DNA was 0.77±0.27,0.69±0.15; while for ten days, 0.57±0.11,0.49±0.19,respectively, which was obviously lower compared with those in normal saline group(1.28±0.54,1.20±0.5l). The inhibition rates of DHBV-DNA in RP polysaccharide high dose group, medium dose group were 25.16%,25.35% respectively 5 days after treatment, while 45.94%,48.28%;respectively 10 days after treatment, indicating remarkable improvement compared with the control group. Conclusion: RP polysaccharide can protect duck liver against inflammation by the inhibition of DHBV.
【Key words】 Ruditapes philippinarum polysaccharide Duck hepatitis B animal model Hepatitis B
菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum,RP)，属软体动物门(Mollusca)、双壳纲（Bivalvia）、帘蛤科(Veneridae)，广泛分布在我国南北沿海的浅海区，又称杂色蛤、蛤蜊、花蛤。其生长周期短，适应能力强，经济价值高，适合人工规模养殖，系我国传统养殖的四大贝类之一。菲律宾蛤仔可作食药两用，以其入药自古就有记载:宋朝掌禹锡《嘉祐本草》中记其“润五脏，止消渴，开胃，解酒毒，主老癖能为寒热者，及妇人血块，煮食之。”《中华本草》中总结其“味甘、咸、性寒；清热解毒。主臁疮；黄水疮。”因其药用功效显著且价廉易得，被广泛作为研究对象，国内外学者近年来的研究表明，其具有抗肿瘤、抗炎、增强免疫力、降压、降血脂、延缓衰老等药理作用[1]。目前对其抗病毒作用的研究不多，本文尝试对RP多糖在体内抗鸭乙型肝炎病毒（DHBV）的作用进行探讨。
1 材料
1.1 动物 先天感染DHBV的北京雏鸭50只(1日龄，重50±5g)，购自北京昌平种鸭场。
1.2 药物 本实验室提取的RP多糖（将活体RP去壳、洗净后匀浆，用超声波辅助热水提取、乙醇沉淀法提取多糖，经柱层析分离纯化后即得到水溶性好、米黄色的粗提物，经谢里瓦诺夫反应、莫立许反应和菲林反应鉴定，其中含多糖成分，纯度约为82.5%[3]）。葛兰素史克制药（苏州）有限公司生产的拉米夫定（化学名2’3’-双脱氧-3’-硫代胞嘧啶，又称3-TC）。
1.3 试剂 缺口翻译平移试剂盒：北京普洛麦格生物技术公司；NC膜：PALL公司；Sephadex G-50：Amresco公司；a-32p-dCTP：北京福瑞生物工程公司； DHBV质粒：北京普如汀生物技术公司。
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1.4 仪器设备 96孔杂交点样器:Bio-Rad公司；P-Ⅲ、H-Ⅲ显微摄影系统:Nikon公司；盖革氏计数器:S.E International 公司；恒温振荡器:Bio-Rad公司；高速冷冻离心机:Eppendorf；酶联免疫检测仪：上海华东电子管厂；数显恒温水浴锅：上海精宏实验设备有限公司；超低温冰箱:SANYO公司。
2 方法
2.1动物模型 1日龄北京雏鸭购回后，适应性喂养2天，于4日龄经胫静脉采血，离心后收集血清，用PCR法检测先天感染DHBV-DNA阳性雏鸭。将雏鸭(10只/组)随机分为5组(RP多糖高、中、低3个剂量组、3-TC组、生理盐水对照组)。
2.2 药物实验 采用公式LgS=0.8762+0.6981 lgW（S为体表面积，单位cm2，W为体重，单位g）计算药物剂量。3-TC组给药按照60kg人服用3-TC 100mg/d的剂量换算[2]。模型对照组给予生理盐水1ml/kg/d，RP多糖各剂量组、3-TC组均按20mg/kg/d，连续灌胃给药10 天。在给药前1天(D0)，用药第5天(D5)，用药第10天(D10)和停药后第3天(S3)，经胫静脉采血、分离血清，-20℃冻存待检。
2.3 检测方法 取备检鸭血清，每批同时点膜，血清中DHBV-DNA水平用斑点杂交法检测。操作方法按缺口翻译试剂盒说明，用32P标记DHBV-DNA探针，作鸭血清斑点杂交，放射自显影膜斑点，在酶标检测仪上测定A值（滤光片波长490nm），以此作为标本DHBV-DNA水平值，计算血清DHBV-DNA密度。
DNA抑制率公式：
抑制率（﹪）= 给药前A值- 给药后A值 ×100﹪
给药前A值
2.4 数据处理 实验数据以均数±标准差（x-±s）表示，采用SPSS11.5软件包进行统计分析，治疗前后比较采用配对t检验。
3 结果
表1 药物（RP多糖）对DHBV-DNA的抑制作用（x-±s，A490）
组别鸭数
（只）A490值
D0D5D10S3
药物高剂量组101.01±0.400.77±0.271）0.57±0.111）0.70±0.12
药物中剂量组100.91±0.050.69±0.151）0.49±0.191）0.72±0.03
药物低剂量组100.76±0.120.72±0.080.62±0.150.81±0.23
3-ＴＣ组101.06±0.060.94±0.081）0.52±0.192）0.93±0.06
模型对照组101.36±0.231.32±0.561.24±0.531.51±0.62
注：与给药前比较。1）P<0.05，2）P<0.01（配对t检验）
表2 各组雏鸭不同时段DHBV-DNA的抑制率的比较（﹪）
组别鸭数
（只）抑制率（﹪）
D5D10S3
药物高剂量组1025.161）45.941）31.72
药物中剂量组1025.351）48.282）21.72
药物低剂量组105.7018.527.12
3-ＴＣ组1011.9953.012）12.99
模型对照组103.129.3612.62
注：与对照组比较。3）P<0.05，4）P<0.01（成组t检验）
4 讨论
乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的一种常见多发的感染性疾病，其以肝脏炎性病变为主，持续感染可导致肝硬化、肝癌等肝脏疾病[4]。国家卫生计生委2013年7月公布的数据显示：我国乙肝病毒携带者近1亿人，每年新发感染者约10万人，每年约35万人死于病毒性肝炎及相关肝病。乙肝及相关疾病不仅给社会带来了沉重的负担，更严重威胁着我国人民的健康。目前乙肝治疗尚无特效药，在药物治疗中主要以抗病毒、免疫调节和护肝药物为主[5]。经美国FDA批准用于慢性乙型肝炎治疗的抗病毒药物有干扰素、拉米夫定、阿德福韦、替比夫定和恩替卡韦，但这几种药物的疗效均有一定局限性，因此不断研究开发疗效显著、治愈率高、毒副反应较少且不反弹的新型抗病毒药物是今后的发展方向[6]。
抗乙肝病毒药物动物模型常用的有鸭、土拔鼠、黑猩猩，及近年研究的转基因小鼠及移植人肝组织的小鼠模型等[7]。灵长类动物(黑猩猩、长臂猿等) 属珍贵动物，受伦理及费用等方面的限制，难以推广应用。土拨鼠主要分布在美洲，国内来源少，不作为首选。鸭(如北京鸭、重庆麻鸭等)是鸭乙型肝炎病毒(DHBV)的自然宿主，先天性或幼年感染的雏鸭可发展成持续性DHBV感染[8]，是目前普遍使用的动物模型。
本实验用北京麻鸭作为动物模型进行体内抗乙型肝炎病毒的研究。实验结果显示，阳性对照组(3-TC) 每天持续按20mg/kg的剂量灌胃，用药期间鸭血清的DHBV-DNA滴度明显降低，但停药后3天，病毒很快重新复制，出现反跳现象。在给药后5天、10天，RP多糖高、中剂量组与给药前及对照组比较，鸭血清的DHBV-DNA水平都降低(1）P<0.05，2）P<0.01)，低剂量组抑制作用不明显，结果见表1。给药后第5天，RP多糖的高、中剂量组对DHBV-DNA的抑制率为25.16%、25.35%，第10天为45.94%、48.28%，与生理盐水对照组对比显著提高(3）P<0.05,4）P<0.01)，结果见表2。综上所述RP多糖有明显抑制乙肝病毒作用，降低血清DHBV-DNA含量。RP多糖有望成为治疗乙型病毒性肝炎的新药，有进一步研究的价值。
参考文献
[1] 陶慧慧，何云鹏，刘群红.菲律宾蛤仔药用价值的研究进展[J].中外健康文摘，2011,8（3）:70-72.
[2] 袁伯俊．新药临床前安全性评价与实践[M]．北京．军事医学科学院出版社，1997，48．
[3] 陶慧慧.菲律宾蛤仔多糖的优化提取及体外抗HBV作用研究[D]．安徽：安徽理工大学,2011．
[4] 陈志强，董俊兴．抗乙型肝炎病毒药物研究进展[J]．中国药学杂志，2000，(35)：435-437.
[5] 刘红洽，廖俊艳．乙型肝炎的药物治疗[J]．临床合理用药，2011，4（1）：159－160．
[6] 赵丽红，任玉新．抗乙肝病毒药物的研究进展[J] ．医学理论与实践，2008，21（10）：
[7] 张亚兰，袁维峰，史利军．抗乙型肝炎病毒药物评价用实验动物模型现状[J]．生物技术通讯，2011，22（1）：127－129．
[8] 梁亮，李瑗．乙型肝炎相关动物模型的研究进展[J]．中国人兽共患病杂志，2005，21(3)：259-261.
论文作者:何云鹏,陶慧慧,刘群红
论文发表刊物:《医药前沿》2014年第4期供稿
论文发表时间:2014-5-5
标签：多糖论文; 剂量论文; 乙型肝炎论文; 药物论文; 血清论文; 给药论文; 抑制论文; 《医药前沿》2014年第4期供稿论文;