一、应用IFAT诊断日本血吸虫病的观察（论文文献综述）
郭庆红[1]（2021）在《日本血吸虫病核酸检测方法的建立和初步应用》文中进行了进一步梳理血吸虫病是由血吸虫感染引起的一种人兽共患寄生虫病,严重危害人类健康和畜牧业的发展。在我国流行的是日本血吸虫病,经过几十年综合防控措施的实施,人和家畜的日本血吸虫病感染率和感染强度已经大幅度下降。传统的病原学和免疫学诊断方法逐步无法满足需求。因此,本研究的目的是建立敏感性高、特异性强以及使用方便快捷的日本血吸虫病核酸诊断方法。本研究选取实验室前期筛选的G01片段作为检测靶序列,通过对羊血浆样本量、核酸模板量以及Real-time PCR退火温度等进行优化,建立了可以用于诊断羊日本血吸虫病的Real-time PCR方法。该方法检测下限为0.26 fg,与前后盘吸虫、大片吸虫、弓形虫、旋毛虫、裂头蚴、住肉孢子虫、巴贝斯虫和捻转血矛线虫均无交叉反应。应用该方法检测159份日本血吸虫感染的阳性羊血浆样本,敏感性为98.74%（157/159,95%CI:95.53%–99.85%）,对94份阴性羊血浆样本进行检测,特异性为100%（94/94,95%CI:96.15%–100%）。此外,应用该方法对望江（日本血吸虫病疫区）120份和威海（非日本血吸虫病疫区）33份羊血浆样本进行检测,结果表明,望江羊检出率为8.33%（10/120,95%CI:4.07%–14.79%）,威海羊检出率为0%（0/33,95%CI:0%–10.58%）。本研究同样选取G01片段作为检测靶序列,建立了诊断小鼠和羊日本血吸虫病的LFD-RPA检测方法。该方法检测下限为2.6 fg,同样与前后盘吸虫、大片吸虫、弓形虫、旋毛虫、裂头蚴、住肉孢子虫、巴贝斯虫和捻转血矛线虫均无交叉反应。应用该方法检测36份日本血吸虫感染的阳性小鼠血浆样本,敏感性为97.22%（35/36,95%CI,85.47%–99.93%）,对36份阴性小鼠血浆样本进行检测,特异性为100%（36/36,95%CI,90.26%–100%）;检测48份日本血吸虫感染的阳性羊血浆样本,敏感性为93.75%（45/48,95%CI,82.80%–98.69%）,对53份阴性羊血浆样本进行检测,特异性为100%（53/53,95%CI,93.28%–100%）。结果表明该方法的敏感性和特异性较高,同时具有快速诊断羊日本血吸虫病的潜力。此外,利用建立好的Real-time PCR方法对日本血吸虫不同感染量（感染5/10/40条尾蚴）的小鼠在感染后不同时间进行检测,以评估该方法在日本血吸虫病早期诊断上的效果。结果显示,在感染后1-7天,不同感染量小鼠的检出率在20%-75%之间;感染10-20天后,不同感染量小鼠的检出率均在12.5%以下;在感染20天后检出率逐渐升高,至感染后第40天,检出率均为77.8%以上。因此,该方法对小鼠日本血吸虫感染早期诊断的效果不理想。此外,我们对人工感染山羊在感染后1、2、3、4、5、6、7、14、24和56天采集的血浆样本进行了Real-time PCR检测,结果显示,在感染后1-5天,检出率在10%-50%之间;感染6-24天后,检出率均在12.5%以下;在感染20天后检出率逐渐升高,至感染后第56天检出率达到100%。因此,该方法对羊日本血吸虫感染的早期诊断效果不理想。
王丽萍[2]（2021）在《基于LFD-RPA的主要肠道血吸虫核酸快速可视化检测方法的建立及初步评价》文中认为当前我国正处于消除血吸虫病的攻坚阶段,日本血吸虫病疫情整体处于极低水平,但境外输入性病例时有报道,迫切需要更加快捷、敏感的检测方法,用于病例诊断或风险识别。目的:结合侧流层析试纸条（Lateral flow dipstick,LFD）和重组酶聚合酶扩增（Recombinase polymerase amplification,RPA）方法,建立能简单、快速识别日本血吸虫、曼氏血吸虫核酸的可视化检测技术,初步评价其对血吸虫中间宿主或终宿主感染早期的检测价值,并通过试剂、时间的折算,分析成本投入情况。方法:以日本血吸虫SjR2和SjG55A作为靶基因,结合Primer Premier 5软件及手工辅助设计引物,通过简易检出限、特异性确定引物序列,初步建立RPA检测方法。以RPA检测为基础,设计探针,确定最佳反应条件,初步建立LFD-RPA检测方法。以PCR方法为平行对照,评价建立检测方法的最低检出限、敏感性、特异性及不同终止方式检测结果。制备不同比例混合的阳性钉螺和阴性钉螺基因组,评价LFD-RPA方法的最低检出混合度。分别取毛蚴感染后不同时期钉螺样本,用解剖镜检法判断钉螺感染情况,提取钉螺样本DNA,评价LFD-RPA方法对钉螺不同感染阶段的血吸虫核酸检测能力,进行RPA、PCR的平行检测。LFD-RPA方法检测现场采集的钉螺样本,RPA、PCR为平行对照,评价LFD-RPA方法的检测效果。以曼氏血吸虫SmCOX1为靶基因,结合Primer Premier 5软件、手工辅助设计筛选引物,确定最终引物序列,初步建立RPA检测方法。以RPA检测为基础,设计探针,确定最佳反应条件,初步建立LFD-RPA检测方法。以文献中针对曼氏血吸虫Sm1-7基因设计的引物为基础,设计特异性探针,探索最佳反应温度及时间,建立LFD-RPA检测方法。以PCR为平行对照,评价建立方法的最低检出限及与特异性。建立40尾、80尾曼氏血吸虫尾蚴梯度感染小鼠的动物模型（简称“40尾组”、“80尾组”）,并于感染后不同时间收集小鼠粪便及血清,提取DNA,用PCR、RPA、LFD-RPA方法进行平行检测,全面评价LFD-RPA方法检测曼氏血吸虫早期感染的效能。随后,收集本实验室常用的血吸虫核酸检测生物学技术的基础数据,包括需要的试剂盒或主要试剂的具体名称、单盒价格、单盒反应次数以及来源。计算不同检测方法的每个样本投入成本,包括每个样本检测所需的试剂成本、劳动力成本。以每个样本投入试剂成本、劳动力成本为基础,在设置阴参、阳参的单个样本检测情况下,计算每次检测投入试剂成本、劳动力成本。同时,将96个反应作为不同检测方法批量检测总量。计算批量检测情况下,每个样本检测投入试剂成本、劳动力成本。并按照实验所需仪器数量将每种方法的技术要求划分为简单、一般、复杂、极复杂四个等级,对LFD-RPA和其他核酸检测方法的成本和技术要求进行比较分析。结果:成功建立了以日本血吸虫SjR2、SjG55A为靶基因的LFD-RPA检测方法以及以曼氏血吸虫SmCOX1、Sm1-7为靶基因的LFD-RPA检测方法,各方法的最优反应参数均为39℃、20min。冰上静置、滴加DNA提取液或酚氯仿三种终止LFD-RPA反应的方式对检测结果无影响。以SjR2、SjG55A为靶基因建立的LFD-RPA方法对含有日本血吸虫靶基因的质粒和成虫基因组最低检出限分别为1copies/μl、102copies/μl和1fg/μl、10fg/μl,SjR2-LFD-RPA更佳,优于对应RPA、PCR方法。SjG55A-LFD-RPA方法与曼氏血吸虫、阳性双脐螺、埃及血吸虫、华支睾吸虫、大片吸虫、卫氏并殖吸虫基因组DNA均无交叉反应。SjR2-LFD-RPA方法和埃及血吸虫、华支睾吸虫、大片吸虫、卫氏并殖吸虫基因组DNA无交叉反应,但可检出曼氏血吸虫、阳性双脐螺,提示与曼氏血吸虫有交叉反应。SjR2-LFD-RPA、SjG55A-LFD-RPA分别能最低检出2000只、1500只阴性钉螺中的1只阳性钉螺,最低检出混合度均高于对应RPA、PCR。SjR2-LFD-RPA、SjR2-RPA、PCR方法均可检出20组1:50的混合阳性钉螺,3中方法的敏感性均为100%。检测日本血吸虫实验室感染钉螺发现,血吸虫感染前6w的钉螺均镜检阴性,自7w出现镜检阳性钉螺,7～11w钉螺镜检阳性率分别为10%、30%、20%、40%、30%;SjR2-RPA在钉螺感染后的1d、3d、5d、1～11w 的检测阳性率分别为 90%、70%、50%、70%、60%、70%、60%、50%、20%、30%、70%、50%、50%、50%。SjR2-LFD-RPA 在钉螺感染后的1d、3d、5d、1～11w 的检测阳性率分别为 90%、80%、70%、70%、60%、60%、70%、70%、30%、30%、70%、50%、50%、50%。经统计学分析发现,SjR2-LFD-RPA、PCR、RPA的总检出率高于解剖镜检法。对现场采集共1550只钉螺的31管钉螺混合DNA的检测结果显示,SjR2-LFD-RPA的检出率为12.90%,其他方法均为阴性。建立的SmCOX1-LFD-RPA对质粒、曼氏血吸虫成虫基因组DNA检出限达到 10copies/μl、1fg/μl,均高于对应 RPA 及 PCR。建立的 Sm1-7-LFD-RPA 对质粒、成虫基因组DNA的检出限更高,达到1copies/μl、1fg/μlSmCOX1-LFD-RPA、Sm1-7-LFD-RPA对曼氏血吸虫、阳性双脐螺特异,与埃及血吸虫、日本血吸虫、阳性钉螺、华支睾吸虫、大片吸虫、卫氏并殖吸虫无交叉反应。检测曼氏血吸虫尾蚴感染小鼠模型的样本发现,不管是40尾组还是80尾组,SmCOX1-RPA和PCR对感染后1～8w的混合血样、混合粪样均无阳性结果出现。SmCOX1-LFD-RPA、Sm1-7-LFD-RPA检测40尾组混合血样和混合粪样时,均是自感染后3w开始出现较浅条带,随着感染时间的增加检测条带越来越明显,分别在感染后第8w和第6～8w时条带颜色达到最深;检测80尾组混合血样和混合粪样时,SmCOX1-LFD-RPA、Sm1-7-LFD-RPA均是自1w开始出现较浅条带,1～8w期间条带颜色逐渐变深,感染后第6～8w的条带颜色达到最深。总体上,Sm1-7-LFD-RPA的条带颜色要比SmCOX1-LFD-RPA的明显清晰一些。不同检测方法的成本比较及分析中,计算每次检测总成本后发现,PCR（453 RMB/次检测）>LFD-RPA（400RMB/次检测）>冻干粉态RPA（330RMB/次检测）>LAMP（300RMB/次检测）、液态RPA（300RMB/次检测）。每次检测时间排序为:PCR（2～2.5 h/次检测）>RPA（0.8～1 h/次检测）>LAMP（0.5～1 h/次检测）>LFD-RPA（0.4～0.6h/次检测）。以96个反应为一批量检测,计算不同检测方法的每批检测时间为:PCR（2～2.5 h/批检测）>RPA（3.2～4 h/批检测）>LAMP（2～4h/批检测）>LFD-RPA（1.6～2.4h/批检测）。批量检测情况下,每个样本检测投入总成本情况:LFD-RPA（112.77 RMB/批量每个样本）>冻干粉态RPA（61.92 RMB/批量每个样本）>LAMP（60.64 RMB/批量每个样本）>液态RPA（51.06 RMB/批量每个样本）>PCR（5.81 RMB/批量每个样本）。按是否需要特殊仪器设备分析实验操作人员技术要求,PCR检测方法和RPA归为“复杂”,而LAMP检测方法和LFD-RPA检测方法“简单”。结论:本研究建立了日本血吸虫、曼氏血吸虫核酸检测LFD-RPA技术,具有较低检出限,该方法操作简单,结果获取方式直接。SjG55A-LFD-RPA可用于日本血吸虫感染混合钉螺的检测,SjR2-LFD-RPA对曼氏血吸虫有交叉反应。基于SmCOX1、Sm1-7靶基因建立的LFD-RPA检测方法具有较低检出限,和其他虫种无交叉反应,有望用于曼氏血吸虫早期感染宿主识别。LFD-RPA作为较新的核酸检测技术,目前检测成本较高,但由于操作简便、敏感性高、特异性强,今后用于血吸虫病现场检测及风险监测有广阔的应用前景。
宋光明[3]（2020）在《磁性纳米颗粒探针-暗场显微镜法检测弓形虫、日本血吸虫卵的研究》文中指出弓形虫（Toxoplasma gondii,Tgondii）作为一种常见的人畜共患寄生虫,能感染所有温血动物。孕妇妊娠期感染,会对胎儿造成严重损害,如胎儿畸形、流产或死胎,免疫力低下的病人感染后会出现淋巴结病或眼弓形虫病。日本血吸虫（Schistosoma japonicum,S.japonicum）是我国最着名的人畜共患寄生虫,可以感染所有哺乳动物,损害免疫系统、神经系统、消化系统,最终造成机体营养流失过多而死亡。自新中国成立后至今,日本血吸虫病患者达到1200余万之多,严重威胁到我国人民的公共卫生安全以及每年给我国畜牧业造成重大经济损失。目前,弓形虫、日本血吸虫检测方法主要分为病原学检测、免疫学检测、分子生物学检测。这些传统的检测方法,都存在诸多缺陷,如:灵敏度低,检测流程繁琐,费时费力,需要昂贵的实验仪器,无法满足基层工作者在现场快速检测。为此,本研究尝试使用磁性纳米颗粒探针-暗场显微镜法对弓形虫和日本血吸虫卵进行检测,实现检测流程简单快速,高灵敏,低要求。本研究首先将表面修饰protein A的磁性纳米颗粒与目标寄生虫的抗体进行孵育,制备成探针。然后将探针与样本溶液在室温下混合振荡30 min,再通过磁力架拉取探针与寄生虫形成的复合物,洗涤重悬后,在暗场显微镜下进行点样观察。最后通过灵敏度实验确定该方法的检测下限,通过动物实验确定该方法在实际临床检测上是否可行。实验结果表明,探针牢牢结合在虫体表面,在暗场下衍射出金黄色亮光,使得虫体轮廓肉眼清晰可见,弓形虫呈现出金黄色月牙状,日本血吸虫卵呈现出金黄色椭圆形。弓形虫检测限可达到10000个/mL,与PCR检测弓形虫的检测限相同。日本血吸虫卵检测限可达到1000个/mL。用该方法在阳性动物样本上均成功检测出目标病原体。总之,我们使用的磁性纳米颗粒探针-暗场显微镜法对弓形虫和日本血吸虫卵检测效果良好,且简单快速、灵敏度高、特异性强,适合用于基层检测。
王盛琳[4]（2020）在《重组酶聚合酶扩增（RPA）技术检测日本血吸虫核酸方法的建立与初步评价》文中指出目的:系统评价各种日本血吸虫核酸检测技术的诊断价值,并采用综合评价较高的重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification,RPA）技术,建立一种特异、敏感、快捷的日本血吸虫核酸检测方法,并初步评价其应用于感染早期检测的潜在价值。方法:计算机检索1990年1月-2019年6月中国知网、万方、ScienceDirect和PubMed数据库中公开发表的与日本血吸虫核酸检测相关的文献,并结合手工检索和参考文献追溯法以最大程度地保证文章的查全。严格按照纳入与排除标准对文献进行筛选,纳入符合条件的文献并提取其中相关数据,采用Meta分析法对各种核酸检测技术的诊断价值进行综合评价。选择日本血吸虫Sj28S基因片段为靶序列,应用手工筛选法并辅以Primer Premier 5软件设计引物,进行温度、时间的优化以确定最佳反应条件,构建基于基础反应体系的RPA检测方法。提取日本血吸虫及其他寄生虫基因组DNA评价所建立方法的特异性。评价方法的敏感性,并与PCR和LAMP法的敏感性进行比较。此外,评价方法对血吸虫不同虫期基因组DNA的检出性能。制备血吸虫阳性钉螺及阴性钉螺不同混合比例的DNA样本,评价RPA方法的最低检出混合度和稳定性。建立5条、10条、20条、40条尾蚴梯度感染小鼠的动物模型（不同组别分别简称为“5尾组”、“10尾组”、“20尾组”、“40尾组”）,并于感染后第3d、lw、2 w、3 w、4 w、5 w、6 w收集小鼠粪便及血清样本,编号后进行冷冻保存。毛蚴攻击感染钉螺,于感染后第1 d、3 d、5 d、1 w、2w、3w、4w、5w、6w、7w、8w、9w、10 w、11 w分别收集10只钉螺样本,解剖镜检后进行冷冻保存。提取小鼠和钉螺样本的DNA,进行PRA与PCR两种方法的平行检测,综合评价RPA方法检出血吸虫早期感染的效能。结果:Meta分析共纳入19篇文献,其中中文文献5篇、英文文献14篇;共24组研究,其中17组研究涉及变温扩增技术与金标准的比较、7组研究涉及等温扩增技术与金标准的比较。文献质量评价结果表明,所纳入文献总体偏倚较小;Deek漏斗图提示变温扩增技术相关文献可能存在发表偏倚。变温扩增技术各研究之间存在非阂值效应引起的异质性,采用随机效应模型对合并效应量进行分析,结果显示:检测日本血吸虫病的综合灵敏度为0.81（95%CI:0.79-0.83）、特异度为0.73（95%CI:0.7]-0.74）、SROC曲线下面积为0.944 3。等温扩增技术各研究之间不存在异质性,采用固定效应模型对合并效应量进行分析,结果显示:检测日本血吸虫病的综合灵敏度为 0.96（95%CI:0.94-0.98）、特异度为 0.95（95%CI:0.94-0.97）、SROC 曲线下面积为0.989 9。构建的RPA方法可成功地扩增出日本血吸虫216 bp大小的目的基因片段。RPA的最佳反应条件最终选择为390C、20 min。该方法与曼氏血吸虫、埃及血吸虫、单尾尾蚴感染钉螺、华支睾吸虫、大片吸虫、卫氏并殖吸虫和牛带绦虫及阴性钉螺基因组DNA均无交叉反应。RPA法对于日本血吸虫成虫基因组的最低检出限为100 fg/μl,针对重组质粒的最低检出限为100拷贝/μl,且敏感性高于普通PCR和LAMP法。RPA法对日本血吸虫不同发育阶段的基因组DNA样本进行检测,各虫期均能被准确检出。应用建立的RPA方法检测阳性钉螺及阴性钉螺不同混合比例的DNA样本,结果显示,最低检出比例为1:1000。重复性试验结果显示,该方法重复性好且准确性高。动物模型结果显示,RPA法对20尾组小鼠可在第4 w检出粪便DNA阳性,10尾组和40尾组均可在第5 w检出粪便DNA 阳性,5尾组的低感染组仅在第6 w检出阳性。PCR方法对10尾组、20尾组、40尾组小鼠均可在第5 w检出粪便DNA阳性,5尾组仅可在第6 w检出粪便DNA阳性。针对小鼠血清样本的检测结果如下,RPA方法检测5尾组小鼠血清时于第5 w、6 w检出阳性结果,10尾小鼠血清于第2w、4w、6w检出阳性结果,20尾组小鼠血清于第3w、4w、5w、6w检出阳性结果,40尾组小鼠血清于第3d、lw、2 w、4 w、5 w、6 w均检出阳性结果。PCR法检测5尾组、10尾组小鼠血清时未检出阳性结果,20尾组小鼠血清于第4 w检出阳性结果,40尾组于第6 w检出阳性结果。钉螺的试验结果显示,压碎镜检法在感染第6w及之前均未观察到阳性结果,于感染第7w开始观察到血吸虫的子胞蚴结构。压碎镜检法对钉螺每个时间点检出的阳性率分别为:0%、0%、0%、0%、0%、0%、0%、0%、0%、10%、30%、20%、40%、30%;RPA 法的阳性率分别为:80%、60%、50%、60%、40%、60%、60%、50%、20%、20%、80%、50%、50%、50%;PCR 法的阳性率分别为:60%、70%、60%、50%、20%、0%、30%、0%、20%、0%、10%、30%、50%、50%。其中,压碎镜检阳性的钉螺共有13只,经RPA检测结果均为阳性,PCR方法仅将其中9只（69%）检出阳性,未能将镜检阳性钉螺全部检出。结论:变温扩增技术和等温扩增技术均对日本血吸虫病有较高诊断价值,其中等温扩增技术诊断准确性相对更高。本研究应用等温扩增RPA技术构建了一种日本血吸虫核酸检测方法,该方法敏感性高、特异性好、简便快速,有望用于血吸虫感染的快速检测及风险监测,具有较好的应用前景。
陈程[5]（2020）在《一种日本血吸虫病核酸诊断方法的建立》文中进行了进一步梳理血吸虫病是由血吸虫感染引起的、危害严重的人畜共患寄生虫病,在78个热带和亚热带国家或地区流行。在我国流行的是日本血吸虫病,几十年来我国血吸虫病防控取得举世瞩目的成就,大多数地区人、畜血吸虫病的流行已呈现低流行性和低感染特点,传统的病原学诊断逐渐无法满足现场需求。本研究的目的是建立一种敏感性高、特异性强、便于判断的日本血吸虫病核酸诊断方法。在前期研究及生物信息学分析的基础上,本文选择G01、F11、E12、H12、G1/3、G7-1、G7-2和G7-3作为候选基因,分别设计引物并以日本血吸虫虫体基因组DNA、BALB/c小鼠基因组DNA和新西兰大白兔基因组DNA为模板进行基因扩增,挑选出能特异性从日本血吸虫虫体基因组DNA扩增,但不能从BALB/c小鼠和新西兰大白兔基因组DNA扩增出目的片段的基因。以G01作为诊断靶基因,三个不同感染剂量（10条、40条、100条）的小鼠各10只,在感染后42d提取血浆提核酸为模板,均可扩增得到G01片段。同时以弓形虫、大片形吸虫、前后盘吸虫、住肉孢子虫、旋毛虫、棘球绦虫的虫体基因组DNA为模板对G01进行扩增,均未扩增出目的片段,表明G01基因是一种有诊断潜力的靶基因。对引物、退火温度、模板量、血浆样本量进行优化,最终选取特征峰单一、对应Ct值较小的引物G01-4为检测引物;58℃为退火温度;4μL模板体积（核酸量约为8ng/μL）;血浆样本量为200μL的反应体系和反应条件建立了Real-time PCR诊断方法,该方法的检测下限为0.01 fg。用该方法对感染10条、40条和100条日本血吸虫尾蚴42d的小鼠血浆样本进行检测,敏感性为99.3%（152/153）。检测77份未感染尾蚴的SPF级BALB/c小鼠血浆样本,均未检出阳性,其特异性为100%（77/77）。说明该方法具有较高的敏感性和特异性。应用建立的Real-time PCR诊断方法对感染10条和40条日本血吸虫尾蚴后不同时间的小鼠血浆样本进行监测。结果显示,感染10条尾蚴的小鼠在感染后7 d、10 d、14 d、18 d、21 d、28d、35 d、42 d后的阳性率分别为:40%（8/20）、60%（12/20）、30%（6/20）、40%（8/20）、20%（4/20）、60%（12/20）、60%（12/20）、95%（19/20）。感染40条尾蚴的小鼠在感染后10 d、14 d、18 d、21 d、28 d、35 d后的阳性率为:25%（2/8）、80%（4/5）、50%（4/8）、40%（2/5）、100%（8/8）、100%（5/5）。感染10条尾蚴的小鼠在感染后42 d的阳性率最高,为95%。感染40条尾蚴的小鼠在感染后28 d全部检出阳性。表明该方法的敏感性与感染度呈正相关。应用建立的Real-time PCR诊断方法对感染日本血吸虫的小鼠经吡喹酮治疗后的疗效考核进行研究。结果显示,感染10条和40条尾蚴的小鼠在给药治疗后6w时全部转为阴性,表明该方法具有疗效考核的潜力。本研究为日本血吸虫病防治提供了一种敏感、特异的诊断技术。
许瑞[6]（2016）在《诊断家畜日本血吸虫病胶体金免疫层析试纸条的研制》文中研究表明血吸虫病是一种危害严重的人兽共患寄生虫病。家畜血吸虫病诊断技术主要为病原学诊断和免疫学诊断。但随着感染强度的不断下降,传统的诊断方法越来越不适用于现场应用。为适应基层血吸虫病筛查和普查的需要,有必要研制针对多种动物的快速检测试剂盒。胶体金免疫层析技术因其具有简便、快速、敏感、特异、无需特殊仪器等优点而适于疫区现场大规模筛查。本课题目的是研制一种敏感性高、特异性强能够检测多种动物日本血吸虫病的试纸条。根据链球菌蛋白G（SPG）具有与多种动物的IgG结合特性,对链球菌蛋白G进行生物学分析,设计重组蛋白G（rSPG）的基因序列,构建rSPG的2种原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达,得到带有GST和His标签的融合蛋白,通过亲和层析纯化蛋白。Western blotting的结果显示,两种rSPG均有与IgG结合的能力。ELISA测定2种带有不同标签的rSPG与牛、山羊、兔、鼠四个物种IgG的亲和力,显示带有GST标签的重组蛋白G的亲和力普遍高于商品化链球菌蛋白G,带有His标签的重组蛋白G的亲和力与商品化链球菌蛋白G相比基本一致。将两种重组蛋白G进行胶体金标记蛋白的最佳pH值、最佳标记量的确定,最后选用His-rSPG进行胶体金的标记及制备金标垫。分别用可溶性虫卵抗原（SEA）和His-rSPG作为检测线和质控线,确定其最佳划线浓度与血清最佳稀释度。结果表明,胶体金标记蛋白的最佳pH值为5.0、最佳标记量为10μg/ml;检测线和质控线的最佳划线浓度均为0.5 mg/mL;血清最佳稀释度为1:20。用组装好的试纸条检测标准阴、阳性BALB/c鼠与新西兰大白兔血清,以及粪检阴、阳性的山羊血清、水牛血清,评估其敏感性和特异性;用胶体金免疫层析试纸条法（GICA法）检测前后盘吸虫病牛血清、捻转血矛线虫病羊血清、东毕吸虫病羊血清,并与ELISA法相比较,评价其交叉反应性。为进一步对试纸条进行评价,分别用GICA法和ELISA法分别对不同感染强度的水牛血清进行检测。对于血纸的评价,用实验室人工感染的水牛阴、阳性血纸和从疫区采集的水牛血纸分别用GICA法和ELISA法进行检测,评估检测效果。结果表明,以重组蛋白G制备的试纸条可用于检测日本血吸虫感染BALB/c鼠、新西兰大白兔、水牛、山羊血清抗体。该试纸条检测日本血吸虫感染小鼠与兔血清的敏感性、特异型均为100.00%。检测山羊血清的敏感性为100.00%,与ELISA法相同;特异性为88.64%,高于ELISA法的75.00%。检测水牛血清的敏感性为100.00%,与ELISA法相同;特异性为94.23%,高于ELISA法的84.62%。其与前后盘吸虫交叉反应率为14.29%;与捻转血矛线虫交叉反应性为16.67%;与东毕吸虫的交叉反应性为33.33%。在对不同感染强度的水牛血清进行评估时,GICA法和ELISA法检测日本血吸虫感染的水牛血清其特异性均为100.00%。在感染强度<20条/头时,GICA法的敏感性为75.00%低于ELISA法的100.00%。在感染强度>20条/头时,GICA法和ELISA法的敏感性均为100.00%。对水牛血纸进评估时,对于实验室人工感染水牛血纸GICA法和ELISA法的敏感性和特异性均为100.00%,并且两种方法之间无统计学差异。综上,本研究成功表达了重组链球菌蛋白G,并研制出能检测多种家畜血吸虫病的胶体金免疫层析试纸条,其检测家畜血吸虫感染的敏感性和特异性均较高。
张玲玲[7]（2012）在《尖吻蝮蛇舌形虫若虫诊断抗原分析及cDNA文库的构建、筛选和表达评价》文中认为人舌形虫病是由蠕虫样舌形虫引起的一种罕见人兽共患寄生虫病,主要分布于非洲、东南亚等国家和地区,人因误食舌形虫虫卵或含有感染性若虫的动物内脏而感染,我国的病例主要报道于浙江、广东、山东、台湾等省市,致病虫种主要为锯齿舌状虫、尖吻蝮蛇舌形虫、串珠状蛇舌状虫、台湾孔头舌状虫。目前,诊断方法主要是基于形态学、组织病理学及放射线检查,同时结合临床表现、流行病史进行的综合诊断,而相关血清学、分子生物学检测方法的研究较少,这常常造成临床上的误诊与漏诊,因此,亟待发展快速有效的舌形虫病体外诊断试剂,而诊断抗原是研发诊断试剂的关键,基因重组抗原又是诊断抗原的重要来源之一。基于此,本研究欲以尖吻蝮蛇舌形虫若虫为材料,通过对尖吻蝮蛇舌形虫若虫粗抗原以及尖吻蝮蛇舌形虫若虫cDNA文库的构建、免疫筛选、重组蛋白的表达等研究,以期获得有价值的诊断抗原。本研究以尖吻蝮蛇舌形虫若虫为材料,采用反复冻融法制备粗抗原,并分析粗抗原的蛋白组成、免疫特性及在舌形虫病诊断中的诊断效果；同时采用Gateway技术构建尖吻蝮蛇舌形虫若虫cDNA入门文库和表达文库,应用感染小鼠混合血清免疫筛选cDNA表达文库,并对筛选到的基因进行同源性比对和生物信息学分析；最后对所筛选到的阳性克隆进行诱导表达、纯化,并应用ELISA方法评价重组蛋白用于检测小鼠血清的诊断效果。结果发现,尖吻蝮蛇舌形虫若虫粗抗原经SDS-PAGE和Western Blot分析,可见9条主带和13条次带（Mr16-150kDa）,其中有16条特异性条带被感染小鼠血清识别,5条特异性条带被舌形虫病人血清识别,与肺吸虫病、鞭虫病病人血清在约Mr34kDa处出现较微弱的交叉反应带,同其余寄生虫病病人血清未出现交叉反应带。以尖吻蝮蛇舌形虫若虫粗抗原作为包被抗原,应用ELISA方法检测舌形虫病病人、感染小鼠、正常人和其它寄生虫病病人血清的敏感性和特异性均为100%。本研究采用Gateway技术首次成功构建了尖吻蝮蛇舌形虫若虫的cDNA入门文库和表达文库,经检测,cDNA入门文库的平均滴度为1.45×105cfii/ml,库总容量为1.74×106cfu,重组率为100%,平均插入片段大小约为1.4kb,插入片段范围为0.2-4.0kb；表达文库的库总容量可达105cfu,平均插入片段大小为1.0kb,插入片段范围为0.3-2.2kb。用感染小鼠混合血清免疫筛选cDNA表达文库,初筛共获取21个阳性克隆,选取其中的7个阳性克隆（编号分别为S1、S5、A1、D1、F1、P1、P5）进行分析,测序后利用NCBI中的blastn程序对其进行同源性比对,在舌形虫物种内未发现同源性较高的基因,表明这7个序列均为尖吻蝮蛇舌形虫的新基因,其中D1同茶足柄瘤蚜茧蜂的USDA-FP185181基因同源性较高,可达77%；利用NCBI中的blastx程序分析,发现S1、S5、A1、D1、F1、P1、P5分别与冈比亚按蚊的AGAP004551-PA蛋白、斑点钝眼蜱的假定蛋白、体虱的collagen alpha-1, IV, chain precursor蛋白、熊蜂的40Sribosomal protein S5a-like蛋白、赤拟谷盗的CG8092CG8092-PA蛋白、以色列黑鳄背蝎的putative protein kinase C inhibitor、赤拟谷盗的ribosomal proteinL19e有27%、45%、56%、86%、30%、61%、86%的相似性。对7个阳性克隆中的4个克隆（A1、D1、P1、P5）进行重组表达、纯化,采用ELISA方法评价重组蛋白检测小鼠血清的敏感性分别为100%、100%、85%、100%,特异性分别为95%、90%、100%、95%。综上所述,本研究以尖吻蝮蛇舌形虫若虫为材料,制备的粗抗原应用于ELISA方法检测尖吻蝮蛇舌形虫病具有较好的诊断效果；利用Gateway技术构建的尖吻蝮蛇舌形虫若虫cDNA入门文库和表达文库,为后续舌形虫遗传学研究提供了丰富的研究材料,同时为进一步克隆和分离有应用价值的基因、筛选免疫诊断靶抗原奠定了基础；通过对cDNA文库的免疫筛选,获得7个强阳性克隆,均为尖吻蝮蛇舌形虫的新基因,对A1、D1、P1、P5四个阳性克隆进行重组表达、纯化及评价,表明4个重组蛋白用于检测小鼠血清均具有较好的敏感性和特异性,但其应用于人舌形虫病的检测仍需进一步研究。
余琴[8]（2012）在《磁分离酶联免疫分析法在日本血吸虫抗体检测中的应用》文中进行了进一步梳理日本血吸虫病在我国主要流行于湖南、湖北、江西、安徽、江苏、四川和云南等7个疫区省、市的110个县。根据2009年全国血吸虫病疫情通报,血吸虫病人365770人,其中晚期血吸虫病人28820人,急性血吸虫病人77例,与2008年相比下降了11.42%。目前,我国血吸虫病流行区域感染率和感染度均呈现大幅度下降,粪检在低度流行区漏检率高,近年来广泛采用血清免疫学诊断方法开展筛查,以提高检测的敏感性,已取得了较好的效果。虽然检测循环抗原既能区分现在感染与既往感染,又具有一定的疗效考核价值,但目前检测的测试系统特异性较差,尤其对于慢性轻度感染者,循环抗原检测的敏感性并不理想。血清抗体检测因敏感性高,成本低廉,简便操作,而被广泛用于日本血吸虫病的辅助诊断和疫情检测。血清抗体检测的诊断抗原主要有粗制的成虫或虫卵抗原,纯化及重组抗原。基因重组抗原成本低廉,制备简便，且周期短,方法易于标准化,因此,更适合商品化生产和流行区血吸虫病的血清学辅助诊断。缺少准确、快速、简便、并且适合基层现场应用的血吸虫病检测方法已经成为目前血吸虫病防治研究领域的技术瓶颈,已严重阻碍了我国血吸虫病防治的步伐。磁分离酶联免疫技术（magnetic affinity enzyme-linked immunoassay, MEIA）是由瑞士Serono诊断中心在20世纪80年代中期发明的一种检测新技术。其原理是将磁性分离与酶联免疫分析技术相结合,以高度均匀的磁性微球作为固相支持物,采用磁性微球液相分离取代传统酶联免疫酶标板包被法的固相分离,在外加磁场的作用下迅速地分离游离物和结合物。磁性微球具有颗粒小、表面积大等优点,可结合更多的诊断分子,使蛋白吸附能力超出普通酶标板载体的千倍以上,从而使该方法的敏感性高于以普通酶标板为载体的ELISA方法。而且磁微粒可以利用磁性分离器方便地对所形成的复合物进行收集分离,使得洗涤结果更加彻底、干扰物浓度大大降低及靶物质浓度有效聚集,进而可提高检测方法的信噪比和灵敏度。另外,该方法具有操作简单、使用便捷等特点,因而在免疫学检测中具有较好的应用前景。本研究制备了日本血吸虫可溶性虫卵抗原及基因重组抗原,并将抗原与磁球偶联,建立了基于抗原的磁分离酶联免疫分析法。并将其用于检测轻度感染日本血吸虫病患者血清,治疗后血清及肺吸虫病患者血清,从而为提供一种新的可供选择的方法用于检测日本血吸虫抗体。本论文分为以下三部分：（1）SEA-MEIA方法在日本血吸虫抗体检测中的研究本研究利用SEA-MEIA法检测感染日本血吸虫血清中的抗体,进而将其与SEA-ELISA结果相比较。研究发现,SEA-MEIA法与SEA-ELISA法检测轻度感染日本血吸虫病患者的敏感性分别是96.55%（56/58）和91.38%（53/58）；SEA-ELISA检测为假阴性的5份阳性血清,其中3份被SEA-MEIA检测为阳性；经统计学比较分析,SEA-MEIA比SEA-ELISA具有更高的敏感性（χ2=21.95,P<0.01）。经非参数Pearson’s相关分析,两种方法检测日本血吸虫病患者血清抗体的OD值之间具有显着正相关关系（r=0.845,P<0.01）。SEA-MEIA和SEA-ELISA检测正常人血清均未出现阳性反应（0/30）,与肺吸虫病人的血清出现了交叉反应（3/6）。15例轻度感染血吸虫病患者,经吡哇酮治疗后半年收集血清,粪检显示虫卵为阴性。SEA-MEIA与SEA-ELISA检测的抗体转阴率分别为26.67%（4/15）、33.33%（5/15）,经统计学比较分析,两种方法的检出率具有显着性差异（χ2=10.909,P<0.01）。结果提示SEA-MEIA法是一种敏感性高、简便快速的日本血吸虫抗体检测方法。（2）日本血吸虫抗原基因的载体构建、原核表达及抗原性鉴定本研究利用基因重组技术成功构建了重组表达载体pGEX-Sj23突变体,pGEX-Sj23大亲水性片段（pGEX-Sj23-LHD）, pET28a-Sj23突变体,pET28a-Sj26及pET28a-Sj 14-3-3.含有重组质粒pGEX-Sj23突变体、pET28a-Sj23突变体的表达菌株,在IPTG的诱导下都未见明显的重组蛋白表达。含有重组质粒pGEX-Sj23-LHD的表达菌株在IPTG的诱导下可见重组蛋白的表达,且表达产物经GST免疫亲和层析纯化,SDS-PAGE电泳姐示该融合蛋白分子量约34 kDa,其中包括寄生虫蛋白LHD约8 kDa,载体表达蛋白26kDa。含有重组质粒pET28a-Sj26、pET28a-Sj14-3-3的表达菌株经IPTG诱导后,表达产物经镍柱亲和层析纯化,可获得高纯度的重组蛋白。SDS-PAGE电泳显示该融合蛋白分子量分别约27 kDa、31 kDa,其中包括6个His-tag,且两种蛋白都主要以可溶性的形式表达。重组蛋白Sj23-LHD、Sj26、Sj14-3-3可特异性的被感染了日本血吸虫的兔血清、小鼠血清所识别,而不能被正常兔血清、正常小鼠血清所识别,且重组蛋白Sj23-LHD可被感染了日本血吸虫3W的小鼠血清所识别。说明纯化的重组抗原具有抗原性,可用于后续的实验研究。（3）基于重组抗原的MEIA方法在日本血吸虫抗体检测中的研究研究发现,rSj26-MEIA和rSj14-3-3-MEIA都可检测出感染了日本血清吸虫小鼠血清中的抗Sj26及Sj 14-3-3的特异性抗体,且rSj26-MEIA与rSj14-3-3-MEIA检测为阳性血清的平均OD值与阴性血清的平均OD值之比（P/N）均高于ELISA （3.92 versus 2.66、3.71 versus 2.45）。rSj26-MEIA与rSj26-ELISA检测轻度感染日本血吸虫病人血清的阳性率均为24.14%（14/58）,经相关分析,rSj26-MEIA与rSj26-ELISA检测的抗体OD值之间存在正相关关系（r=0.658,P<0.01）,这两种方法检测为阳性血清的平均OD值与阴性清平均OD值之比（P/N）分别为3.61、2.56。rSj14-3-3-MEIA与rSj14-3-3-ELISA检测轻度感染日本血吸虫病人血清的阳性率为22.41%（13/58）,经相关分析,rSj14-3-3-MEIA与rSj14-3-3-ELISA检测的抗体OD值之间存在正相关关系（r=0.618,P<0.01）,这两种一方法检测为阳性血清的平均OD值与阴性血清的平均OD值之比（P/N）分别为3.65、2.71。经统计比较分析,rSj26-MEIA与rSj14-3-3-MEIA的阳性检出率之间没有显着性差异（χ2=3.198,P>0.05）。检测治疗后半年且粪检显示虫卵为阴性的血清,rSj26-MEIA与rSj26-ELISA的阳性检出率均为13.33%（2/15）；rSj14-3-3-MEIA与rSj14-3-3-ELISA均没有检出阳性反应（0/15）。基于这两种抗原的MEIA和ELISA检测肺吸虫病人血清（0/6）、正常人血清均未出现阳性反应（0/30）。上述结果显示,基于rSj26和rSj 14-3-3的MEIA法与ELISA法检测轻度感染日本血吸虫病具有相似的敏感性,rSj26-MEIA和rSj14-3-3-MEIA具有一定的疗效考核价值及较好的特异性。
王岑[9]（2011）在《环介导同温扩增检测全血日本血吸虫DNA的研究》文中进行了进一步梳理血吸虫病是一种人畜共患寄生虫病,流行于亚洲、非洲和拉丁美洲的76个国家和地区,是世界上重要的公共卫生问题之一。现主要存在6种寄生于人体的血吸虫,分别是日本血吸虫、曼氏血吸虫、埃及血吸虫、湄公血吸虫、间插血吸虫及马来血吸虫。在各种血吸虫病中,我国流行的日本血吸虫病对人体健康危害最严重,且防治难度最大。日本血吸虫病不仅影响个人健康,而且影响整个血吸虫病流行区域的经济发展。我国已于2004年将其列为乙类传染病,与传染性非典型肺炎、艾滋病处于同等重要的防治位置。据建国初期统计,我国的血吸虫病分布在江苏、浙江、上海、安徽、江西、湖南、湖北、四川、云南、广西、广东、福建等12个省（市）的433个县（市、区）4078个乡（镇）,共有钉螺面积148亿平方米,累计感染者达1160万例,受威胁人口在1亿以上。经过60年的积极防治,至2009年底,全国估计血吸虫病人365770例,与2008年相比下降了11.42%。新发急性血吸虫病77例（其中2例为境外输入的曼氏血吸虫病病例）,与2008年相比上升了35.09%。全年共救治晚期血吸虫病人24282例,比2008年增加了14.42%。全国现有钉螺面积372358.69hm2,其中新增钉螺面积879.42hm2。全国流行地区现有耕牛存栏数1570300头,耕牛感染率（1.03%）较2008年（1.34%）下降了23.13%。总的来说,全国的血吸虫病疫情已得到有效控制,但近年来由于生物、自然、社会经济、人口流动、政策保障等因素变化较大,一些地方呈现血吸虫病疫情扩散蔓延的态势,表现为老疫区血吸虫病患者增加,钉螺扩散明显,新钉螺区出现,感染性钉螺分布范围扩大,部分已达血吸虫病传播控制和传播阻断的地区可能出现疫情回升,各地输入性血吸虫病病例增加,说明我国的血吸虫病防治工作还任重道远。建立有效的血吸虫病诊断方法是控制血吸虫病流行的关键。血吸虫病的传统实验室诊断方法仍为病原学方法,由于血吸虫病的大规模化疗,导致血吸虫病流行区人群感染率和感染度大幅下降,由此造成粪检查出病原体的难度增大。同时,血吸虫病病原学检查的敏感性受到质疑,加之费工、费时以及疫区人群的依从性逐年下降,收集粪便检测的难度亦增加。因此,在血吸虫病防治和调查监测中,迫切需要一种快速、敏感、特异、简便、成本低廉的血吸虫病检测方法。血吸虫DNA多来源于虫体脱落物,是虫体存在的一个直接证据,这可以作为血吸虫感染的诊断指征。近年来,随着分子生物学技术的发展,涌现了许多新的核酸检测技术,环介导同温扩增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）法即为其中的一种。该法不需要使用PCR仪,可直接用肉眼判断结果,操作简便,是一个非常实用的核酸检测方法。本研究选择日本血吸虫基因组重复序列DNA SjR2（2718～3019 bp、836～1036 bp）、SjSH7（688～883 bp）和Sj-nonLTR1（2173～2376 bp）的4段DNA序列作为扩增片段,根据LAMP原理设计合成4组引物,比较分析4组引物用于LAMP扩增的敏感性和特异性,筛选出一组特异性强、敏感性高的引物,并通过对反应体系和反应条件的优化,建立一种简便、快速和高敏感性的检测全血标本中日本血吸虫DNA的环介导同温扩增方法。此外,应用建立的LAMP方法和传统PCR法对18只日本血吸虫感染前、感染后以及治疗后不同时间家兔的配对全血DNA进行扩增,观察并比较两种方法用于血吸虫病早期诊断和疗效考核的潜在应用价值。本研究获得如下主要结果:1、在建立环介导同温核酸扩增技术（LAMP）体系的过程中,采用不同浓度的甜菜碱（Betaine）配置的反应缓冲液,实验结果表明扩增效率最佳的Betaine终浓度为0.8M。我们在保持反应缓冲液其他成分不变的情况下,在LAMP缓冲液中分别加入不同量的Betaine,使Betaine的终浓度分别为1.6、0.8、0.4、0.2和0 mol/L,对DNA阳性对照模板（SjR2 2718～3019 bp区段）进行扩增。在含有Triton X-100和Tween-20的反应缓冲液中,均以含有0.8mol/L Betaine缓冲液的扩增效率最高,而不加Betaine的扩增效果与0.2 mol/L Betaine相似。2、在建立环介导恒温核酸扩增技术（LAMP）体系的过程中,采用Triton X-100配置的反应缓冲液的扩增效率优于用Tween-20配制的反应缓冲液。我们在保持反应缓冲液其他成分不变的情况下,比较了Tween-20和Triton X-100的效率。在将起始浓度均为1ng/mL的SjR2 2718～3019 bp区段的PCR纯化产物进行倍比稀释后,用含有Tween-20和Triton X-100的反应缓冲液进行LAMP扩增,含Tween-20的扩增灵敏度为10-3 ng/ml,含Triton X-100的扩增灵敏度为10-4 ng/ml,说明Triton X-100比Tween-20的扩增效率高出一个数量级。3、我们选择日本血吸虫基因组中的三段重复序列,针对其中四个区段设计四组引物,以特异性、敏感性及能否扩增出日本血吸虫感染的动物全血样本作为标准,筛选出SjR2-1作为最佳引物。选择日本血吸虫基因组重复序列DNA SjR2（2718～3019 bp、836～1036 bp）、SjSH7（688～883 bp）和Sj-nonLTR1（2173～2376 bp）的4段DNA序列作为扩增片段,根据LAMP原理设计合成4组引物,比较分析4组引物用于LAMP扩增的敏感性和特异性。4组引物中,以日本血吸虫SjR2-1（2718～3019 bp）作为扩增靶片段,可特异性扩增日本血吸虫中国大陆株(检出限为10-4 ng DNA)、菲律宾株和曼氏血吸虫的基因组DNA,而人全血基因组DNA、华支睾吸虫基因组DNA、疟原虫基因组DNA不能扩增。以Sj-nonLTR1（2173～2376 bp）为靶片段,LAMP扩增无特异性。以SjR2-2（836～1036bp）和SjSH7（688～883 bp）为靶片段,可特异性扩增日本血吸虫中国大陆株基因组DNA(检出限为10-6 ng和10-3 ng)及菲律宾株基因组DNA,而人全血基因组DNA、华支睾吸虫基因组DNA、曼氏血吸虫基因组DNA和疟原虫基因组DNA不能扩增。但是只有用SjR2-1 （2718～3019 bp）引物对10只日本血吸虫1500条尾蚴感染后5周兔全血标本进行扩增,设立感染前血样本DNA作为对照,感染后5周全血基因组DNA的标本均为阳性,而其余引物对感染兔的血样本DNA扩增效果不佳。综合上述结果,我们选择SjR2-1（2718～3019 bp）引物为最终的引物。4、在对三组日本血吸虫感染早期（感染后1周）的兔全血抽提基因组DNA采用LAMP法和传统PCR法进行扩增,结果表明在日本血吸虫感染的早期诊断中LAMP法的扩增效率高于传统PCR法。LAMP法对感染后1周的3组不同感染度的兔全血样本进行检测,无论是200条尾蚴感染组还是1500条尾蚴感染组,扩增的阳性率均为100%;而传统PCR法的扩增结果显示:200条尾蚴感染组的检出阳性率为50%,1500条尾蚴感染组的检出阳性率则为66.7%。传统PCR法对于全血样本血吸虫DNA检测的阳性率随着尾蚴感染条数的上升而升高。因此,针对SjR2-1区段,LAMP法在早期诊断中的效能高于传统PCR法。5、在对三组所有配对兔药物治疗前后全血样本DNA用LAMP法和传统PCR法进行检测后,动态结果显示:由于LAMP法敏感性高于传统PCR法,所以药物治疗后LAMP法的转阴时间和阴转率均晚于和低于传统PCR法。在对3组不同数量日本血吸虫尾蚴感染组的大耳兔采用不同药物进行治疗后,比较肝脏HE染色切片,结果显示,LAMP法和PCR法的动态曲线与冲虫数和肝脏虫卵及肉芽肿数吻合。LAMP法在感染后21周剖杀时,阳性率最低降至50%,PCR法则最迟在感染后15周全部转阴。因为在药物治疗消除虫体之后,宿主外周血中日本血吸虫特异性DNA片段的检出仍维持相当长的时间（4-5个月甚至更长的时间）,因此LAMP法可能不适合用于早期疗效考核的评价。6、作为技术探索,LAMP法初步应用于现场的效果没有达到预期目标,仍需进一步研究。对32份江西现场采集到的粪便毛蚴孵化阳性的血样DNA用LAMP法和PCR法进行检测后,LAMP法的阳性率为37.5%,而PCR法未检测出阳性,这一结果同样提示了LAMP法的高敏感性。但对流行区现场人群的测试不如实验室稳定,且结果的判读仍需继续明确。综上所述,本研究选择日本血吸虫基因组DNA中的三段重复序列,针对四个区段设计四组引物,筛选出特异性和敏感性较高的引物,建立了检测日本血吸虫感染兔外周全血基因组DNA的LAMP方法。选择最佳引物使用LAMP技术和普通PCR技术检测日本血吸虫感染的阳性率和治疗后的阴转率,比较评价其早期诊断和疗效考核的价值。该方法对治疗前DNA标本的检出时间早于传统PCR法,具有血吸虫感染早期的诊断价值,但LAMP法不适于早期疗效考核的评价。初步应用LAMP法检测流行区现场人群的样本,结果未达到预期目标,仍需进一步研究。
蔡世飞[10]（2011）在《rSj26GST-Sj32融合蛋白诊断慢性日本血吸虫病的研究》文中提出目的探讨重组Sj26GST-Sj32融合蛋白诊断慢性日本血吸虫病患者的价值;研究聚合酶链反应（PCR）和逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）分别扩增慢性日本血吸虫病患者血清中Sj26GST、Sj32和Sj14-3-3抗原编码基因用于该病的基因诊断价值。方法将本室保存的pET32α-Sj26GST-Sj32重组质粒在大肠埃希菌BL21（DE3）中经IPTG诱导表达,根据Ni-NTA纯化试剂盒说明进行操作获得rSj26GST-Sj32融合蛋白,并利用SDS-PAGE电泳进行鉴定。将纯化的rSj26GST-Sj32融合蛋白和Sj成虫抗原（SjAWA）分别建立酶联免疫吸附试验（ELISA）、斑点酶联免疫吸附试验（Dot-ELISA）和Dipstick等方法检测慢性日本血吸虫病患者血清中IgG和IgG4抗体,并以华支睾吸虫病、卫氏并殖吸虫病、泡型棘球蚴病、囊型棘球蚴病、乙型肝炎和肺结核患者以及健康人血清作对照。分别从慢性日本血吸虫病患者血清中提取DNA或总RNA,利用PCR或RT-PCR扩增Sj26GST、Sj32和Sj14-3-3抗原编码基因,用1.2%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定,同时以华支睾吸虫病患者、卫氏并殖吸虫病患者和正常人血清作为对照。结果成功获得rSj26GST-Sj32融合蛋白。rSj26GST-Sj32-IgG-ELISA检测慢性日本血吸虫病患者的敏感性和特异性分别为95.00%和97.67%,SjAWA检测的敏感性和特异性分别为92.50%和97.67%;SjAWA与2例泡型棘球蚴病患者血清有交叉反应,但rSj26GST-Sj32融合蛋白与该病患者血清无交叉反应。rSj26GST-Sj32-IgG4-ELISA检测慢性日本血吸虫病患者的敏感性和特异性分别为95.00%和100%;SjAWA检测的敏感性和特异性分别为97.50%和93.02%。SjAWA与泡型棘球蚴病、囊型棘球蚴病和乙型肝炎患者血清均有不同程度的交叉反应,但rSj26GST-Sj32融合蛋白与该三种疾病患者血清均无交叉反应。rSj26GST-Sj32-HRP-IgG-Dot-ELISA检测慢性日本血吸虫病患者的敏感性和特异性分别为92.50%和95.35%;SjAWA检测的敏感性和特异性分别为95.00%和93.02%。两种方法与华支睾吸虫病患者、卫氏并殖吸虫病患者和泡型棘球蚴病患者血清均有不同程度的交叉反应;但与囊型棘球蚴病患者、乙型肝炎患者和肺结核患者血清均无交叉反应。rSj26GST-Sj32-Immunogold-IgG-Dot-ELISA检测慢性日本血吸虫病患者的敏感性和特异性分别为95.00%和97.67%;SjAWA检测的敏感性和特异性分别为97.50%和95.35%。SjAWA与华支睾吸虫病和卫氏并殖吸虫病患者血清均有不同程度的交叉反应;而rSj26GST-Sj32融合蛋白与华支睾吸虫病、卫氏并殖吸虫病、泡型棘球蚴病、囊型棘球蚴病、乙型肝炎和肺结核患者血清均无交叉反应。rSj26GST-Sj32-Immunogold-IgG-Dipstick法检测慢性日本血吸虫病患者的敏感性和特异性分别为92.50%和97.67%;SjAWA检测的敏感性和特异性分别为97.50%和95.35%。SjAWA与华支睾吸虫病、卫氏并殖吸虫病和泡型棘球蚴病患者血清均有不同程度的交叉反应;而rSj26GST-Sj32融合蛋白与这些疾病患者血清均无交叉反应。PCR或RT-PCR从慢性日本血吸虫病患者血清扩增出了约400 bp的Sj14-3-3抗原编码基因片段,但未扩增出676 bp的Sj26GST和1270 bp的Sj32抗原编码基因片段,对照组均呈阴性反应。结论1. rSj26GST-Sj32融合蛋白可用于慢性日本血吸虫病的免疫诊断。2. PCR或RT-PCR扩增Sj14-3-3抗原编码基因可用于慢性日本血吸虫病的基因诊断。
二、应用IFAT诊断日本血吸虫病的观察（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、应用IFAT诊断日本血吸虫病的观察（论文提纲范文）
（1）日本血吸虫病核酸检测方法的建立和初步应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 血吸虫病概述 |
| 1.2 血吸虫病诊断技术 |
| 1.2.1 病原学诊断 |
| 1.2.2 免疫学诊断 |
| 1.2.3 分子生物学诊断 |
| 第二章 羊日本血吸虫病Real-time PCR诊断方法的建立 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 生物材料 |
| 2.2.2 仪器设备 |
| 2.2.3 酶和试剂 |
| 2.2.4 试剂配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 小鼠组织、日本血吸虫成虫、虫卵和羊血浆和血清样本的收集 |
| 2.3.2 DNA提取 |
| 2.3.3 Real-time PCR反应条件优化 |
| 2.3.4 Real-time PCR诊断方法的检测下限、敏感性、特异性 |
| 2.3.5 血浆和血清样本检测结果对比 |
| 2.3.6 血浆保存时间 |
| 2.3.7 ELISA检测 |
| 2.3.8 对疫区和非疫区羊进行Real-time PCR诊断 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 Real-time PCR反应条件优化 |
| 2.4.2 Real-time PCR反应的检测下限、敏感性和特异性 |
| 2.4.3 血浆样本和血清样本检测效果对比 |
| 2.4.4 血浆保存时间 |
| 2.4.5 ELISA检测结果 |
| 2.4.6 疫区和非疫区羊血浆样本的Real-time PCR检测结果 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 小鼠/羊日本血吸虫病LFD-RPA诊断方法的建立 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 生物材料 |
| 3.2.2 仪器设备 |
| 3.2.3 酶和试剂 |
| 3.2.4 引物 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 小鼠和羊血浆样本的收集 |
| 3.3.2 DNA提取 |
| 3.3.3 LFD-RPA最佳引物的选择 |
| 3.3.4 LFD-RPA反应条件优化 |
| 3.3.5 LFD-RPA检测下限、特异性和敏感性 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 LFD-RPA最佳引物和探针的选择 |
| 3.4.2 LFD-RPA反应甜菜碱加入量的优化 |
| 3.4.3 LFD-RPA反应最佳孵育温度的优化 |
| 3.4.4 LFD-RPA反应最佳孵育时间的优化 |
| 3.4.5 LFD-RPA反应产物最佳稀释度的优化 |
| 3.4.6 LFD-RPA检测下限和交叉反应结果 |
| 3.4.7 LFD-RPA与 Real-time PCR在小鼠和羊上检测敏感性和特异性比较 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 Real-time PCR诊断早期日本血吸虫病的效果评估 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 生物材料 |
| 4.2.2 仪器设备 |
| 4.2.3 酶和试剂 |
| 4.2.4 试剂配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 小鼠和羊血浆样本的收集 |
| 4.3.2 DNA提取 |
| 4.3.3 Real-time PCR检测小鼠和羊样本 |
| 4.3.4 日本血吸虫虫体计数 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 Real-time PCR检测小鼠结果 |
| 4.4.2 虫体计数结果 |
| 4.4.3 Real-time PCR检测羊结果 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（2）基于LFD-RPA的主要肠道血吸虫核酸快速可视化检测方法的建立及初步评价（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 前言 |
| 1 研究背景 |
| 1.1 血吸虫病流行概况 |
| 1.2 血吸虫病的实验检测技术 |
| 1.3 LFD-RPA检测技术 |
| 2 研究目的 |
| 3 研究内容 |
| 3.1 快速检测日本血吸虫核酸的LFD-RPA方法的建立及初步评价 |
| 3.2 快速检测曼氏血吸虫核酸的LFD-RPA方法的建立及初步评价 |
| 3.3 LFD-RPA检测方法的成本分析 |
| 4 技术路线图 |
| 第一部分 FD-RPA检测日本血吸虫核酸方法的建立及初步评价 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料来源 |
| 1.2 主要实验试剂与仪器 |
| 1.3 基因组DNA的提取 |
| 1.4 重组质粒的构建及提取 |
| 1.5 RPA方法的建立及初步评价 |
| 1.6 LFD-RPA方法的建立及初步评价 |
| 1.7 LFD-RPA方法的检测效能评价 |
| 2 结果 |
| 2.1 RPA方法的建立及初步评价 |
| 2.2 LFD-RPA方法的建立及初步评价 |
| 2.3 LFD-RPA方法的检测效能评价 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分 LFD-RPA检测曼氏血吸虫核酸方法的建立及初步评价 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料来源 |
| 1.2 曼氏血吸虫感染小鼠实验模型构建及样本采集 |
| 1.3 主要实验试剂与仪器 |
| 1.4 基因组DNA的提取 |
| 1.5 重组质粒构建及平行PCR对照的建立 |
| 1.6 RPA方法的建立及初步评价 |
| 1.7 LFD-RPA方法的建立及初步评价 |
| 1.8 LFD-RPA对曼氏血吸虫感染小鼠模型样本的检测评价 |
| 2 结果 |
| 2.1 RPA方法的建立及初步评价 |
| 2.2 LFD-RPA方法的建立及初步评价 |
| 2.3 感染小鼠样本的检测评价 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第三部分 LFD-RPA反应的成本比较及分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 基础数据 |
| 2.2 仪器方面 |
| 2.3 技术要求方面 |
| 2.4 成本方面 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 主要创新点 |
| 不足和展望 |
| 参考文献 |
| 附表1 主要肠道血吸虫检测方法、特点及成本整理表 |
| 个人简历 |
| 硕士期间申请专利与发表文章 |
| 致谢 |
| 附件 |
（3）磁性纳米颗粒探针-暗场显微镜法检测弓形虫、日本血吸虫卵的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 1 弓形虫概述 |
| 2 日本血吸虫概述 |
| 3 弓形虫、日本血吸虫的检测方法的研究进展 |
| 4 磁性纳米材料在生物学医学领域的应用 |
| 5 暗场显微镜 |
| 6 论文研究内容及意义 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第一章 弓形虫的体外培养 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞系与虫株 |
| 1.2 主要试剂和耗材 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 HFF细胞培养 |
| 2.2 弓形虫的体外培养 |
| 2.3 弓形虫PCR检测 |
| 2.4 SEM观察弓形虫 |
| 3 结果 |
| 3.1 弓形虫体外培养 |
| 3.2 PCR结果 |
| 3.4 弓形虫SEM结果 |
| 4 讨论 |
| 第二章 磁性纳米颗粒探针的制备及表征 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 弓形虫MNP探针制备 |
| 2.2 SDS-PAGE验证探针的抗体结合效率 |
| 2.3 探针SEM表征 |
| 2.4 暗场下观察探针是否团聚 |
| 3 结果 |
| 3.1 探针SDS-PAGE结果 |
| 3.2 探针SEM表征 |
| 3.3 探针暗场结果 |
| 4 讨论 |
| 第三章 MNP-暗场显微镜法检测弓形虫 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 MNP探针捕获弓形虫暗场下观察 |
| 2.2 SEM观察验证探针的特异性 |
| 2.3 MNP-暗场显微镜法的检测下限 |
| 2.4 小鼠血液样本的检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 MNP探针捕获弓形虫效果 |
| 3.2 SEM观察验证探针的特异性结果 |
| 3.3 MNP-暗场显微镜法检测下限 |
| 3.4 小鼠血液样本检测结果 |
| 4 讨论 |
| 第四章 MNP-暗场显微镜法检测日本血吸虫卵 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 1.1 虫株和实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 腹水纯化 |
| 2.2 日本血吸虫卵MNP探针制备 |
| 2.3 SDS-PAGE验证探针 |
| 2.4 暗场下观察探针是否团聚 |
| 2.5 探针捕获日本血吸虫卵暗场显微镜下观察 |
| 2.6 MNP-暗场显微镜法检测下限 |
| 2.7 粪便样品检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 腹水纯化SDS-PAGE鉴定结果 |
| 3.2 探针SDS-PAGE结果 |
| 3.3 探针暗场下结果 |
| 3.4 探针捕获日本血吸虫卵暗场下效果 |
| 3.5 MNP-暗场显微镜法检测日本血吸虫卵下限 |
| 3.6 粪便样本检测结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及发明专利目录 |
| 致谢 |
（4）重组酶聚合酶扩增（RPA）技术检测日本血吸虫核酸方法的建立与初步评价（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 前言 |
| 1 研究背景 |
| 1.1 血吸虫病流行概况 |
| 1.2 日本血吸虫病诊断技术 |
| 1.3 重组酶聚合酶扩增技术 |
| 2 研究目标 |
| 2.1 总体目标 |
| 2.2 具体目标 |
| 3 研究内容 |
| 3.1 系统评价各种核酸检测技术对日本血吸虫病的诊断价值 |
| 3.2 建立一种快速检测日本血吸虫核酸的RPA方法 |
| 3.3 初步评价RPA方法应用于日本血吸虫早期感染检测的效果 |
| 4 技术路线 |
| 第一部分 不同核酸检测技术对日本血吸虫病诊断价值的Meta分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 文献检索策略 |
| 1.2 纳入与排除标准 |
| 1.3 数据提取 |
| 1.4 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 文献的一般特征 |
| 2.2 文献质量评价 |
| 2.3 文献发表偏倚 |
| 2.4 Meta分析结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分 RPA技术检测日本血吸虫核酸方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料来源 |
| 1.2 样本的采集 |
| 1.3 主要实验试剂与仪器 |
| 1.4 基因组DNA的提取 |
| 1.5 重组质粒的构建及提取 |
| 1.6 RPA方法的建立 |
| 1.7 RPA方法特异性评价 |
| 1.8 RPA方法敏感性评价 |
| 1.9 日本血吸虫不同虫期基因组DNA的检测 |
| 1.10 混合钉螺样本的检测 |
| 1.11 RPA检测重复性评价 |
| 2 结果 |
| 2.1 RPA最佳反应条件的确定 |
| 2.2 RPA方法特异性评价 |
| 2.3 RPA方法敏感性评价 |
| 2.4 RPA方法检测日本血吸虫不同虫期样本 |
| 2.5 钉螺混合样本的检测 |
| 2.6 RPA方法的重复性评价 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第三部分 RPA技术检测日本血吸虫感染样本效果的初步评价 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料来源 |
| 1.2 材料的采集 |
| 1.3 主要试剂及仪器 |
| 1.4 样本DNA的提取 |
| 1.5 RPA方法 |
| 1.6 PCR方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 小鼠样本的检测 |
| 2.2 钉螺样本的检测 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 全文小结 |
| 主要创新点 |
| 不足和展望 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 硕士期间申请专利与发表文章 |
| 致谢 |
| 附录 |
（5）一种日本血吸虫病核酸诊断方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 血吸虫病及血吸虫病诊断的概述 |
| 1.2 血吸虫病的诊断技术 |
| 1.2.1 病原学诊断 |
| 1.2.2 免疫学诊断 |
| 1.2.3 利用核酸进行诊断 |
| 第二章 日本血吸虫病核酸诊断目的基因的筛选 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 生物材料 |
| 2.2.2 仪器设备 |
| 2.2.3 酶和试剂 |
| 2.2.4 试剂配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 血浆样品、动物组织和日本血吸虫成虫的收集 |
| 2.3.2 DNA提取 |
| 2.3.3 PCR |
| 2.3.4 交叉反应性 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 以虫体DNA为模板对候选基因的筛选结果 |
| 2.4.2 以鼠基因组DNA和兔基因组DNA对候选基因的筛选结果 |
| 2.4.3 候选基因的评估 |
| 2.4.4 交叉反应性试验结果 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 日本血吸虫病Real-time PCR诊断方法的建立 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 生物材料 |
| 3.2.2 仪器设备 |
| 3.2.3 酶和试剂 |
| 3.2.4 试剂配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 血浆样本的收集 |
| 3.3.2 DNA提取 |
| 3.3.3 Real-time PCR条件优化 |
| 3.3.4 Real-time PCR反应的特异性、敏感性和灵敏度 |
| 3.4 结果 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 核酸诊断方法对小鼠感染日本血吸虫后的连续监测 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 生物材料 |
| 4.2.2 仪器设备 |
| 4.2.3 酶和试剂 |
| 4.2.4 试剂的配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 血浆样本的收集 |
| 4.3.2 DNA提取 |
| 4.3.3 Real-time PCR |
| 4.3.4 虫体计数 |
| 4.3.5 肝脏虫卵计数 |
| 4.4 结果 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 核酸诊断方法对日本血吸虫病疗效考核的评估 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 生物材料 |
| 5.2.2 仪器设备 |
| 5.2.3 酶和试剂 |
| 5.2.4 试剂的配制 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 血浆样本的收集 |
| 5.3.2 DNA提取 |
| 5.3.3 Real-time PCR检测 |
| 5.3.4 虫体计数 |
| 5.3.5 肝脏虫卵计数 |
| 5.4 结果 |
| 5.5 讨论 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（6）诊断家畜日本血吸虫病胶体金免疫层析试纸条的研制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 血吸虫病概述 |
| 1.2 日本血吸虫病诊断方法 |
| 1.2.1 病原学诊断 |
| 1.2.2 免疫学诊断 |
| 1.2.3 分子生物学诊断 |
| 1.3 胶体金免疫层析试验 |
| 1.3.1 胶体金的发现 |
| 1.3.2 胶体金的性质及制备 |
| 1.3.3 胶体金探针的制备 |
| 1.3.4 胶体金免疫检测技术 |
| 1.3.5 胶体金免疫层析技术的应用 |
| 第二章 链球菌蛋白G的结构域重构、表达及鉴定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 生物材料 |
| 2.2.2 仪器设备 |
| 2.2.3 酶和试剂 |
| 2.2.4 试剂配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 重组蛋白G的构建 |
| 2.3.2 重组质粒的构建、转化和表达 |
| 2.3.3 重组蛋白的纯化 |
| 2.3.4 Western blotting检测重组蛋白与IgG的结合活性 |
| 2.3.5 ELISA法测定重组蛋白与不同物种IgG亲和常数 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 重组蛋白G原核表达质粒构建 |
| 2.4.2 重组蛋白的诱导表达和可溶性鉴定 |
| 2.4.3 重组蛋白的纯化 |
| 2.4.4 重组蛋白与IgG结合活力测定 |
| 2.4.5 ELISA法测定重组蛋白与不同物种IgG亲和常数 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 胶体金免疫层析试纸条的组装及优化 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 生物材料 |
| 3.2.2 仪器设备 |
| 3.2.3 酶和试剂 |
| 3.2.4 试剂配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 胶体金的烧制 |
| 3.3.2 可溶性虫卵抗原（SEA）的制备 |
| 3.3.3 胶体金标记的最佳PH值 |
| 3.3.4 胶体金标记的最佳蛋白标记量 |
| 3.3.5 胶体金探针的制备 |
| 3.3.6 胶体金免疫层析试纸条的制备及优化 |
| 3.3.7 胶体金免疫层析试纸条保存 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 胶体金颗粒的鉴定 |
| 3.4.2 胶体金标记蛋白的最佳PH值及最佳蛋白标记量 |
| 3.4.3 稳定液及重悬液的选择 |
| 3.4.4 金标垫及样品垫的选择 |
| 3.4.5 检测线、质控线及血清最佳用量 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 胶体金免疫层析试纸条的初步应用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 生物材料 |
| 4.2.2 仪器设备 |
| 4.2.3 酶和试剂 |
| 4.2.4 试剂配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 GICA法对实验动物血吸虫病的检测 |
| 4.3.2 GICA法对水牛、山羊血吸虫病的检测 |
| 4.3.3 GICA法对水牛不同感染强度的血吸虫病检测 |
| 4.3.4 试纸条交叉反应性的初步评价 |
| 4.3.5 GICA法对水牛血纸的检测 |
| 4.3.6 统计学分析 |
| 4.3.7 胶体金免疫层析试纸条的稳定性实验 |
| 4.3.8 胶体金免疫层析试纸条的重复性实验 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 GICA法检测的敏感性、特异性 |
| 4.4.2 对水牛不同感染强度的检测 |
| 4.4.3 交叉反应性 |
| 4.4.4 对水牛血纸检测 |
| 4.4.5 稳定性实验 |
| 4.4.6 重复性实验 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（7）尖吻蝮蛇舌形虫若虫诊断抗原分析及cDNA文库的构建、筛选和表达评价（论文提纲范文）
| 目录 |
| 中英文全称及缩写对照 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 技术路线 |
| 第一部分 尖吻蝮蛇舌形虫若虫粗抗原的制备、组分分析及诊断效果的观察 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 2.试剂与仪器 |
| 3.方法 |
| 4.结果 |
| 5.讨论 |
| 第二部分 基于Gateway技术的尖吻蝮蛇舌形虫若虫cDNA文库的构建 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 2.试剂与仪器 |
| 3.方法 |
| 4.结果 |
| 5.讨论 |
| 第三部分 尖吻蝮蛇舌形虫若虫cDNA文库的免疫筛选 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 2.试剂与仪器 |
| 3.方法 |
| 4.结果 |
| 5.讨论 |
| 第四部分 阳性克隆的原核表达、纯化及诊断价值的初步评价 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 2.试剂与仪器 |
| 3.方法 |
| 4.结果 |
| 5,讨论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 致谢 |
| 附录1 硕士期间论文发表、专利申请情况 |
| 附录2 登录GenBank的序列信息 |
| 附件 |
（8）磁分离酶联免疫分析法在日本血吸虫抗体检测中的应用（论文提纲范文）
| 前言 |
| 参考文献 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 第一部分 SEA-MEIA方法在日本血吸虫抗体检测中的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 日本血吸虫抗原基因的载体构建、原核表达及抗原性鉴定 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 基于重组抗原的MEIA方法在日本血吸虫抗体检测中的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 研究生期间发表的论文情况 |
| 致谢 |
| 附录 |
（9）环介导同温扩增检测全血日本血吸虫DNA的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 LAMP 法检测全血样本中日本血吸虫DNA 方法的建立 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 LAMP法和PCR法对日本血吸虫感染家兔全血DNA早期检测和疗效考核的评价 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 LAMP 法初步尝试检测日本血吸虫病流行区感染人群的研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（10）rSj26GST-Sj32融合蛋白诊断慢性日本血吸虫病的研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一章 rSj26GST-Sj32 融合蛋白的制备 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 rSj26GST-Sj32 间接ELISA 诊断慢性日本血吸虫病的研究 |
| 第一节 rSj26GST-Sj32-IgG-ELISA 诊断慢性日本血吸虫病的研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二节 rSj26GST-Sj32-IgG4-ELISA 诊断慢性日本血吸虫病的研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三节 rSj26GST-Sj32 检测IgG4 用于慢性日本血吸虫病疗效考核价值的研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 rSj26GST-Sj32-Dot-ELISA 诊断慢性日本血吸虫病的研究 |
| 第一节 rSj26GST-Sj32-HRP-IgG-Dot-ELISA 诊断慢性日本血吸虫病的研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二节 rSj26GST-Sj32-Immunogold-IgG-Dot-ELISA 诊断慢性日本血吸虫病的研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 rSj26GST-Sj32-Immunogold-IgG-Dipstick 法诊断慢性日本血吸虫病的研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 慢性日本血吸虫病的基因诊断 |
| 第一节 PCR 扩增Sj26GST、Sj32 和Sj14-3-3 抗原编码基因诊断慢性日本血吸虫病的研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二节 RT-PCR 扩增Sj26GST、Sj32 和Sj41-3-3 抗原编码基因诊断慢性日本血吸虫病的研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表和待发表的学术论文目录 |
四、应用IFAT诊断日本血吸虫病的观察（论文参考文献）
- [1]日本血吸虫病核酸检测方法的建立和初步应用[D]. 郭庆红. 中国农业科学院, 2021(09)
- [2]基于LFD-RPA的主要肠道血吸虫核酸快速可视化检测方法的建立及初步评价[D]. 王丽萍. 中国疾病预防控制中心, 2021
- [3]磁性纳米颗粒探针-暗场显微镜法检测弓形虫、日本血吸虫卵的研究[D]. 宋光明. 扬州大学, 2020(04)
- [4]重组酶聚合酶扩增（RPA）技术检测日本血吸虫核酸方法的建立与初步评价[D]. 王盛琳. 中国疾病预防控制中心, 2020
- [5]一种日本血吸虫病核酸诊断方法的建立[D]. 陈程. 中国农业科学院, 2020(01)
- [6]诊断家畜日本血吸虫病胶体金免疫层析试纸条的研制[D]. 许瑞. 中国农业科学院, 2016(02)
- [7]尖吻蝮蛇舌形虫若虫诊断抗原分析及cDNA文库的构建、筛选和表达评价[D]. 张玲玲. 中国疾病预防控制中心, 2012(08)
- [8]磁分离酶联免疫分析法在日本血吸虫抗体检测中的应用[D]. 余琴. 华中科技大学, 2012(09)
- [9]环介导同温扩增检测全血日本血吸虫DNA的研究[D]. 王岑. 南京医科大学, 2011(11)
- [10]rSj26GST-Sj32融合蛋白诊断慢性日本血吸虫病的研究[D]. 蔡世飞. 重庆医科大学, 2011(11)