张克勤[1]2001年在《甲状旁腺激素的促成骨作用研究》文中认为目前抗骨质疏松药物主要是骨吸收抑制剂，它们升高骨量的作用十分有限。甲状旁腺激素（PTH）及其某些片段已被认为是最有前途的促成骨药之一。以往该方面的动物实验大多是用3月龄甚至更年幼的大鼠为实验对象，为了探讨间歇性注射PTH对壮年大鼠去卵巢后较长时间（类似于妇女绝经后较长时间）的促成骨作用及其在细胞和分子水平的作用机理，我们完成了以下研究。 一、间歇性注射重组人甲状旁腺激素（1—84）（rhPTH_(1-84)）对去卵巢大鼠骨矿密度（BMD）和骨组织形态计量学的影响 将6月龄雌性未育SD大鼠随机分成5组：①去卵巢终点组（OVXE组，n=6），②去卵巢+PTH注射组（OVXE+PTH组，n=6），③假手术终点组（ShamE组，n=6），④假手术基础组（Sham B组，n=5），⑤去卵巢基础组，（OVXB组，n=6）。其中①、②和③组均在术前、术后3和4.5个月时用双能X线骨密度仪（DEXA）测腰椎和右股骨上端BMD，在术后3～4.5个月期间，给②组大鼠每日皮下注射1次rhPTH_(1-84)（20μg/100g体重，6次/周），①和③组大鼠，则注射PTH溶媒（含0.001％乙酸的PBS）；①、②和③组在术后4.5个月，④和⑤组于术后3个月处死取右胫骨上端做骨组织形态计量学分析，所有动物处死前第6和第2天均在腹腔内注射Calcein。结果显示：①OVXE组大鼠在术后3和4.5月时腰椎BMD与术前比无明显变化（P均＞0.05），OVXB组胫骨上端骨小梁面积百分数（％TbAr）比Sham B组下降了52％（P＜0.001），其表示成骨功能的动态指标标记周长百分数（％LPm）、矿化沉积率（MAR） 南京医科大学博士学位论文和表示破骨功能的骨。J、梁表面破骨细胞数（NOfOC）均明显高于同龄的 Sham B组（P＜0．05和 0．01入②PTH／PBS注射期间 OVX＋PTH组腰椎 BMD上升了 15．7士9．sing／。mvX士SD人与 Sham E组相似（PIno．05人而 OVXE组下降了 13．8士8．sing／Cm＼OVXE＋PTH组与 OVXE组 BMD变化值差别显着（P＜0．01），这叁组股骨上端BMD均上升且上升幅度相似（P＞0．05入③骨组织形态计量学分析显示：在治疗终卢、OVXE十 PTH组％TbAr明显高于OVXE组（P t 0．0 5），与 OVXB组相近（P ＞ 0．0 5），其骨小梁厚度（TbTh）明显高于其他 4组o均＜0．05X骨小梁数目（TbN）略多于 OVXE组但差异不显着（0．05riP＜0．1入其％LPm、MAR和骨形成速率（BFR／BV）均明显高于 OVXE和 Sham E组（P＜0．01和0．001人N of Oc N。I与 OVXE b Sham E lA无明显差别（P＞0．05人这些结果表明：①6月龄 SD大鼠在去卵巢后腰椎 BMD的变化不如腴骨上端骨小梁面积变化敏感，去卵巢对大鼠皮质骨BMD无明显影响，大鼠去卵巢后3个月内成骨与破骨活动均增强。②rhPTH；、s硝明显提高去卵巢大鼠腰椎BMD，能维持其股骨上端骨小梁面积不下降，但对股骨上端 BMD无明显影响，③间歇性注射PTH能促进成骨活动增强而对破骨活动无明显影响，虽对骨小梁数目有轻度增多作用，但主要是通过促进骨小梁增厚而提高骨量。 二fTH对体外培养的大鼠成骨细胞增遁及功能的影响 我们按PTH给大鼠注射后的药代动力学设计了大鼠成骨细胞（OB）培养方案，即在 48h／循环培养周期中对照组细胞在前 6h和后 42h均在含 PTH溶媒的培养基中培养，PTH间歇刺激组O 刺组）细胞于前 6h在含 PTH。－。。而后 4 Zh在含 PTH溶媒的培养基中培养，PTH持续刺激组（持刺组）细胞在前 6h和后 4 Zh均在含PTH；－。J的培养基中培养，各组细胞均在第 6h fa 48h换液。OB中 1型胶原（a＊链 mRNA含量用逆转录－多聚酶链式反应（RT－PCR）测定，无血清培养基中 1型原胶原梭基端前肽（PICP）采用放射免疫法测定，钙结节数目用 Von Kossa染色显示，细胞层总钙用原子吸收仪分析，细胞增殖能力用＊＊T法评价。结果显示：按此方案培养 ·2· 南京医科大学博士学位论文OB到第 3个循环第 6h间刺组与持刺组 Col mRNA含量均高于对照组o分别＜0．01和0．05人间刺组于第24和48h与对照组同水平，而持刺组则降到低于对照组水平；培养液中 COil蛋白浓度在间 刺组在O～6h和25～帕h与对照组相 同（P＞O．05），而在7～24h明显高于对照 组（Prto．001），持卒组于0～6h和25～48h均低于对照组（Prto．001）而仅在7～24h与对照组相同（P＞0．05＼间刺组细胞 ALP表达量产结节数目和细胞层总钙含量均明显高于其他二组，而持刺组细胞上述 3项指标均明显低于其他二组；在第2循环末间刺组与持刺组细胞数目相似，均高于对照组。这些结果提示：叮H间歇刺激体外大鼠OB能增加其骨胶原合成和钙结晶量，其机理是既促进OB数量增多又增强其活性，而 PTH持续刺激虽然也会增加 OB数目，但由于抑制其活性，两者抵销的结果是成骨功能明显减弱。 叁PTH?
吕国良[2]2004年在《甲状旁腺激素促成骨作用的初步研究》文中提出目的 探讨卵巢切除及间歇注射人甲状旁腺激素1-34片段对大鼠局部骨组织中胰岛素样生长因子1(IGF-1)表达的影响，同时检测血清中转化生长因子β_1(TGF-β_1)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)表达变化，从而评价各种细胞因子在绝经后骨质疏松的发病及PTH促成骨机理中的作用。 方法 3月龄雌性SD大鼠随机分为3组：假手术组(Sham)、去卵巢对照组(OVX)、去卵巢PTH注射组(PTH)，每组6只。假手术组暴露双侧卵巢并切除一块与卵巢大小相同的脂肪组织，去卵巢对照组和去卵巢PTH注射组于卵巢切除两周后分别皮下注射PBS溶剂或hPTH_(1-34)，6ug／100g体重，10天后所有大鼠一批处死，腹主动脉取血分离血清，-20℃保存。取胫骨中上1／3制备脱钙骨标本，免疫组化法(IHC)检测骨组织中细胞因子IGF-1的蛋白表达；酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清中细胞因子TGF-β、IL-6、IL-1β、TNF-α的含量。 结果 成骨细胞呈线状排列于骨小梁的边缘，细胞因子IGF-1表达于成骨细胞胞浆，骨细胞、软骨细胞及骨基质中也存在IGF-1。不同部位的成骨细胞IGF-1的表达量并不一致，卵巢切除及PTH注射对不同部位成骨细胞IGF-1表达的影响也不一样。卵巢切除后软骨细胞 南京医科大学硕士学位论文工GF一1表达降低，皮质骨及小梁骨部位成骨细胞的工GF一1表达无明显变化。PTH注射对软骨区及皮质骨区IGF一表达无显着影响，但可以明显增加小梁骨部位成骨细胞IGF一1的表达。萝尸巢切除后血清中细胞因子TGF一日:升高，但去卵巢PTH注射组与去卵巢对照组无显着差异。大鼠血清中IL一1日、工L6、TNF一a含量较低，各组间未见显着差异。 结论局部骨中细胞因子IGF一1在PTH的促成骨机理中起着重要作用;间隙性PTH注射对血液循环中TGF一日，、IL一6、IL一1日、TNF-a无明显影响，其在局部骨组织中的变化尚有待于进一步研究。
张瑞[3]2016年在《ClC-3氯通道参与TGF-β/Smads通路调控甲状旁腺激素对MC3T3-E1细胞成骨分化的作用研究》文中进行了进一步梳理研究背景:骨质疏松是临床上最常见的骨代谢疾病之一,主要表现为疼痛、易骨折,严重者可致呼吸功能下降,显着影响病患的生活质量,因而骨质疏松的治疗越来越受到人们的关注。甲状旁腺的主细胞能够分泌PTH,从而来调控骨组织代谢以及来维持机体的钙平衡。然而,PTH能够双向地调节骨组织的代谢。具体言之,间断PTH刺激下,小剂量时能够促进骨组织的形成;持续PTH刺激下,大剂量则可以促进骨组织的吸收。但其具体的作用机制尚未探明,因而未能应用于临床上骨质疏松患者的治疗,因此进一步阐明PTH促进骨形成的机制将为其应用于临床提供更多的理论依据。ClC-3电压门控氯通道存在于成骨谱系细胞中,在对成骨细胞的作用上与PTH有许多共同点。前期研究发现,PTH刺激能显着上调成骨细胞中ClC-3的表达。并且PTH能通过ClC-3调节下游成、破骨相关基因的表达,但其分子机制并不十分明确。有研究认为,pth与tgf-β1在膜受体水平上可相互影响,共同调节骨吸收和骨形成,但其作用机制非常复杂还不清楚。在前期研究中我们发现clc-3也参与了成骨细胞中tgf-β1信号的调控,tgf-β可以调节成骨细胞的增殖与分化,其中tgf-β1通过smad2/3信号调控核心结合蛋白因子runx2的表达,进而促进成骨作用。由此可见,clc-3不仅和pth在骨代谢的调节上有密切关系,还参与了tgf-β1信号的调控。所以,clc-3如何介导tgf-β1与pth之间的相互作用关系,还有待进一步研究。本课题旨在研究在pth间断刺激下,clc-3氯通道、tgf-β1及下游信号分子之间的相互关系,为进一步深入研究pth的促成骨分化作用机制提供新的思路。研究目的:本研究旨在通过调节clc-3氯通道基因及tgf-β1基因的不同表达水平来初步探究clc-3氯通道在pth调节成骨分化过程中的作用机制。研究内容:(1)研究在1×10-9mpth对mc3t3-e1细胞每隔6小时间断刺激下,分别下调tgf-β1和clc-3基因表达水平后,观察两者基因、蛋白表达的表达情况。(2)研究在1×10-9mpth对mc3t3-e1细胞每隔6小时间断刺激下,分别下调及共同下调tgf-β1和clc-3基因表达水平后,研究其下游成、破骨相关基因的表达情况。(3)研究在1×10-9mpth对mc3t3-e1细胞每隔6小时间断刺激下,分别下调及共同下调tgf-β1和clc-3基因表达水平后,检测成骨细胞体外矿化能力的变化。研究方法:(1)采用基因转染的方法,分别用特异性sirna下调成骨细胞mc3t3-e1中tgf-β1及clc-3基因的表达水平,同时利用real-timepcr检测mc3t3-e1细胞中tgf-β1和clc-3基因表达水平,成、破骨相关基因(runx2、alp、bsp、oc、opg及rankl)表达水平。(2)通过免疫印迹方法及细胞免疫荧光法检测pth刺激下tgf-β1和clc-3氯通道蛋白表达的影响,初步分析两者之间的关系。(3)利用茜素红染色及计算钙结节观察成骨诱导培养及pth刺激培养下各组mc3t3-e1细胞的体外矿化能力。研究结果:(1)10-9 M的PTH间断刺激时,MC3T3-E1细胞中仅下调TGF-β1基因表达后,ClC-3氯通道基因及蛋白表达水平增强;仅下调ClC-3氯通道基因后,TGF-β1基因及蛋白表达水平增强。(2)10-9 M的PTH间断刺激时,在分别下调MC3T3-E1细胞中ClC-3氯通道基因和TGF-β1基因后,成、破骨相关基因(Runx2、Alp、Bsp、Oc、Opg及Rankl)表达水平较对照组明显降低。(3)10-9 M的PTH间断刺激时,共同下调MC3T3-E1细胞中ClC-3氯通道基因和TGF-β1基因之后,成、破骨相关基因(Runx2、Alp、Bsp、Oc、Opg及Rankl)较对照组无明显差异。(4)10-9 M的PTH间断刺激时,成骨诱导液诱导成骨的能力优于PTH刺激,在分别下调ClC-3氯通道基因和TGF-β1基因表达水平后,MC3T3-E1细胞的体外矿化能力较对照组均下降。在共同下调两者之后,其体外矿化能力较对照组无明显差异。研究结论:(1)在PTH刺激促进MC3T3-E1细胞成骨分化过程中,ClC-3与TGF-β1信号可相互影响。(2)ClC-3氯通道基因和TGF-β1基因均可响应PTH的间断刺激而发生变化,进而影响下游成、破骨相关基因的表达。(3)不同表达水平的ClC-3氯通道基因和TGF-β1基因对PTH刺激促进MC3T3-E1成骨分化作用有一定影响。
王金凤, 徐小雅, 丁巧灵, 周轶, 金慰芳[4]2013年在《成纤维生长因子(FGF)23基因沉默对甲状旁腺激素(PTH)促成骨细胞分化作用的影响》文中认为目的研究内源性成纤维生长因子23(fibroblast growth factor 23,FGF23)对甲状旁腺激素(parathyroid hormone,PTH)促成骨细胞分化作用的影响。方法采用酶消化法分离培养新生SD大鼠头盖骨成骨细胞,应用小发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)干扰技术(RNAi)沉默成骨细胞FGF23表达,应用MTT法和PNPP法检测细胞增殖和碱性磷酸酶(alkaline phosphates,ALP)活性,应用real-time RT-PCR法检测其FGF23、ALP和骨钙素(osteocalcin,OCN)等基因mRNA水平,研究PTH对培养成骨细胞和FGF23基因沉默细胞的作用。结果 rhPTH1-34对培养成骨细胞增殖促进作用明显,分化促进作用弱。1×10-10～1×10-8mol/L rhPTH1-34作用3天,细胞增殖率增加31.6%～50.5%(P<0.05),而细胞比活性未见明显改变。同时其ALP和OCN转录水平轻度上调,分别较对照组增加35%(P<0.05)和16%(P>0.05)。rhPTH1-34上调成骨细胞FGF23mRNA水平(4倍),该作用可被针对FGF23特异的shRNA转染所抑制。FGF23基因沉默后PTH促分化作用明显增强,其ALP和OCN mRNA水平分别较对照组增加1.8倍(P<0.05)和5.8倍(P<0.05),显示内源性FGF23对PTH促分化的干扰作用。结论内源性FGF23可能参与PTH促分化作用的调节,FGF23上调可干扰PTH的促成骨细胞分化作用。
王金凤[5]2013年在《内源性FGF23对PTH促成骨细胞分化作用的影响》文中研究说明目的：甲状旁腺激素(parathyroid hormone, PTH)的促成骨作用是其治疗骨质疏松症的重要药理基础,然而对其促进成骨细胞分化的细胞基础和影响因素等尚存争议,其作用机制也未完全阐明。PTH有调节成纤维生长因子(fibroblast growth factor, FGF)23表达的作用,而FGF23对成骨细胞分化和基质矿化具有直接影响。细胞FGF23表达是否影响PTH的促成骨细胞分化作用等尚不明确。为此,本文利用体外培养大鼠成骨细胞,在观察rhPTH1-34促成骨细胞分化的基础上,采用RNA干扰技术沉默其FGF23的表达,研究内源性FGF23对PTH促分化作用的影响。方法：1.采用酶消化法分离培养新生SD大鼠头盖骨成骨细胞,应用碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase, ALP)染色和体外矿化结节茜素红(Alizarin Red staining, ARS)染色进行成骨细胞功能学鉴定。2.为观察PTH对成骨细胞分化的作用,本文以重组人甲状旁腺激素(recombinant human parathyroid hormone, rhPTH)1-34间隙循环加入作用3d,应用PNPP法和MTT法检测体外培养大鼠成骨细胞总碱性磷酸酶(ALP)活性和细胞增殖率,分别以OD405nm/孔和OD570nm/L表示,并以OD405nm/OD570nm计算细胞ALP比活性。为进一步观察rhPTH1-34对成骨细胞分化的时效作用,以10-9mol/L rhPTH1-34一次性给予后,分别于2h、8h和24h连续取样,应用实时荧光定量PCR (Real-time PCR)技术分析成骨细胞ALP和骨钙素(OCN) mRNA水平变化。3.为明确PTH对成骨细胞FGF23表达的作用,本文采用10"9mol/L rhPTH1-34一次性给予后,分别于2h、8h和24h连续取样,应用Real-time PCR技术观察细胞FGF23转录水平变化。进一步以10"9mol/L rhPTH1-34作用3d后,收获细胞应用Western blot技术检测胞内FGF23蛋白水平。4.为研究内源性FGF23在PTH促成骨细胞分化中的作用,本文采用RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术,以大鼠成骨细胞FGF23mRNA213～235位点为靶序列设计小发夹RNA (FGF23i-shRNA),以慢病毒载体pLKO.1为骨架,构建重组载体。采用脂质体法转染沉默大鼠成骨细胞FGF23表达后,以10-9mol/L rhPIH1-34作用2h,取细胞应用Real-time PCR分析其FGF23.ALP和OCN mRNA水平。结果：1.PTH对体外培养成骨细胞分化具有一定刺激作用。PNPP法检测结果显示,10-12～10-8mol/L rhPTH1-34间隙循～环作用3d细胞总ALP活性增加14.8%-40%(P<0.05P<0.001),以10-9mol/L浓度作用最明显。MTT法测定结果显示,10-10～10-8mol/L rhPTH1-34间隙循环作用3d细胞增殖率增加31.6%-50.5%(P<0.05～P<0.001)。细胞ALP比活性(OD405nm/OD570nm)在2.1-2.4之间波动,与对照组比较差异无统计学意义。Real-time PCR结果显示,10"9mol/L rhPTH1-34作用2h时细胞ALP mRNA水平增加35%(P<0.05),8h和24h时逐渐恢复;OCN mRNA水平在2h时有增加趋势(16%,P>0.05),8h时增加幅度加大至80%(P<0.05),24h时恢复。2.PTH上调体外培养成骨细胞FGF23表达。Real-time PCR结果显示,10-9mol/L rhPTH1-34作用2h时细胞FGF23mRNA水平增加4倍(P<0.001),8h时增加67%(P<0.05),24h时恢复。Western blot分析结果显示,10"9mol/L rhPTH1-34作用3d细胞FGF23蛋白表达有增加趋势(41%),但差异无统计学意义(P>0.05)。3.FGF23基因沉默后PTH促成骨细胞分化作用明显增强。Real-time PCR结果显示,10-9mol/L rhPTH1-34作用2h,FGF23沉默(FGF23i-shRNA)细胞FGF23表达无上调,而其ALP和OCN表达明显上调,其转录水平分别增加1.8倍(P<0.05)和5.8倍(P<0.01),明显高于空载体转染细胞的43.5%(P<0.05)和25.5%(P>0.05)。结论：1.PTH对体外培养成骨细胞分化具有一定刺激作用；2.PTH上调体外培养成骨细胞FGF23表达;3.FGF23基因沉默后PTH促分化作用明显增强。
姜惠, 蒋兰兰, 刘超, 王富强, 张克勤[6]2007年在《间歇性甲状旁腺激素刺激的大鼠成骨细胞中β-肌动蛋白和波形蛋白表达上调》文中研究说明目的:探讨间歇性甲状旁腺激素(PTH)应用促成骨的可能机制。方法:大鼠成骨细胞(ROBs)分为两组培养:①对照组,在每个培养周期(24h)中均不加PTH;②PTH间歇刺激组,仅在前6h的培养液中加PTH。收集第3周期24h末的细胞,应用双向凝胶电泳方法比较两组细胞的总蛋白,选择2个在间歇刺激组表达明显上调的蛋白质点进行基质辅助激光解吸离子化-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析。结果:初步确定这2个蛋白分别为β-肌动蛋白(β-actin)和波形蛋白(vimentin),它们均属于细胞骨架蛋白。结论:在PTH间歇刺激组表达上调的β-肌动蛋白和波形蛋白可能参与了间歇性PTH应用的促成骨过程。
张克勤, 陈家伟, 刘超, 王美莲, 赵人铮[7]2001年在《甲状旁腺激素对体外培养的大鼠成骨细胞增殖及功能的影响》文中指出目的:为了研究甲状旁腺激素(PTH)间歇性注射的促成骨作用机理.方法:我们按PTH给大鼠注射后的药代动力学设计了大鼠成骨细胞(OB)培养方案,即在48h/循环培养周期中对照组细胞在前6h和后42h均在含PTH媒的培养基中培养,PTH间歇刺激组(间刺组)细胞于前6h在含PTH_(1～34)而后42h在含PTH溶媒的培养基中培养,PTH持续刺激组(持刺组)细胞在前6h和后42h均在含PTH_(1～34)的
卢晓琳[8]2015年在《ClC-3氯通道介导甲状旁腺激素对MC3T3-E1细胞成骨分化的作用研究》文中研究说明研究背景:骨代谢紊乱包括骨形成和骨吸收过程的不调,骨吸收障碍可导致骨质硬化症,而骨形成不足会引起骨质疏松症。骨质疏松症患者的骨密度降低、骨量减少、骨小梁排列紊乱的特点也给其缺牙种植修复、错牙合畸形正畸矫治等口腔临床治疗带来了诸多问题,严重影响着患者的健康和生活质量。甲状旁腺素(PTH)是体内调节骨代谢的重要激素之一,已有研究表明持续性给予PTH刺激可造成骨量丢失及骨密度降低,而间断性给予PTH刺激可使骨密度及骨强度显着增高,其具体机制复杂而不明确。Cl C-3氯通道是一类电压门控型的离子通道,然而Cl C-3基因敲除小鼠表现出生长阻滞及骨发育的异常,着提示我们Cl C-3氯通道可能与骨发育和骨代谢有关。我们课题组前期研究发现,Cl C-3氯通道存在于成骨细胞中,具有增强细胞体外矿化能力及促进成骨分化的作用。既然PTH和Cl C-3氯通道在骨代谢过程中都具有促进骨形成的作用,那么研究二者在成骨分化过程中是否具有某种内在的联系就具有重要的意义。研究目的:本研究旨在通过观察在不同浓度及不同给药方式的PTH刺激下,MC3T3-E1细胞中Cl C-3氯通道及成骨相关基因的表达变化,并通过干扰Cl C-3氯通道的表达来初步探索成骨细胞中Cl C-3氯通道在PTH的促进成骨分化过程中的作用,为PTH在促进成骨作用的机制研究提供新的思路。研究内容:(1)研究不同浓度及不同给药方式的PTH刺激对MC3T3-E1细胞增殖能力及其成骨相关基因表达的影响。(2)研究PTH刺激对MC3T3-E1细胞中Cl C-3氯通道表达的影响。(3)初步探究Cl C-3氯通道在PTH促成骨分化中的作用。研究方法:(1)通过CCK-8试剂盒法检测不同实验分组的MC3T3-E1细胞的增殖情况,同时利用Real-Time PCR法检测MC3T3-E1细胞中成骨相关基因Alp、Runx2的表达情况。(2)通过Real-Time PCR方法及细胞免疫荧光法检测PTH刺激对Cl C-3氯通道表达的影响,初步分析两者之间的关系。(3)利用免疫荧光方法检测不同Cl C-3氯通道表达水平的MC3T3-E1细胞在PTH刺激下Cl C-3氯通道蛋白的变化情况,利用Real-Time PCR检测各组细胞中成骨相关基因及Clcn3的表达情况,并进一步观察各组细胞体外矿化能力的变化。研究结果:(1)10-9 M的PTH间断刺激下,MC3T3-E1细胞中Alp、Runx2的表达最显着。(2)10-9 M的PTH间断刺激时,MC3T3-E1细胞中的C l C-3氯通道表达量在各实验组中最强。(3)10-9 M的PTH刺激MC3T3-E1细胞,C l C-3 si RNA干扰组比C l C-3氯通道正常表达组的成骨相关基因表达量明显降低,同时,体外矿化能力也减弱。结论:(1)合适浓度的PTH间断刺激有促进成骨细胞成骨分化作用。(2)MC3T3-E1细胞中的Cl C-3氯通道能够响应PTH的刺激发生变化。(3)Cl C-3氯通道介导了PTH对成骨细胞的促成骨分化作用。
张莹[9]2011年在《甲状旁腺激素羧基端肽段细胞凋亡作用的研究》文中提出甲状旁腺素(PTH)是由甲状旁腺主细胞合成分泌的、调节钙磷代谢及骨转换的重要肽类激素。人体血液循环中存在叁种PTH分子：PTH1-84、PTH37-84及少量PTH7-84,后两者称为PTH羧基端肽段(C-PTH)。研究发现,PTH1-34具有与PTH1-84完全相同的受体结合能力及促成骨作用,美国FDA已于2001年批准甲状旁腺素(1-34)肽(rhPTH1-34)用于治疗妇女绝经后骨质疏松症。但实验发现,当给予大鼠PTH1-34后骨肉瘤的发病率明显上升(最高致瘤率达52%)。近来发现,人体内存在C-PTH受体(CPTHR), C-PTH与其特异性受体(非PTH受体)结合后可产生促细胞凋亡的生物学效应。因此我们推断PTH1-34的成骨-即抗成骨细胞凋亡作用可能诱发成瘤,而C-PTH的促凋亡作用可抑制PTH1-34的成瘤效应。该推断如果成立,将会对PTH在调节骨代谢方面作用的研究产生极其深远的影响。目的本研究拟从细胞实验和动物实验两方面,采用real-time PCR、western blot等实验技术和方法探讨PTH1-84、PTH37-84及PTH1_34对细胞周期的作用。已期阐明不同PTH分子对成骨细胞凋亡的不同作用,特别是人体内所含有的C-PTH分子即PTH37-84对成骨细胞细胞周期及细胞凋亡的影响,从而进一步证明C-PTH有促凋亡的作用,可能与抑制肿瘤的发生有关。方法1.培养原代成骨细胞：2日龄大鼠,采用酶交替消化法对成骨细胞进行分离。ALP染色、Von Kossa染色进行鉴定。2.进行药物干预：加入10"9 mol/L的PTH1-34,PTH37-84,PTH1-84,对照组加入等体积的PBS,培养24h后,收获细胞,分别提取总RNA和蛋白质。3.采用real-time PCR技术,2-ΔΔCT法在mRNA水平检测骨肉瘤相关凋亡基因：bax、bcl-2、caspase3、c-fos、cyclin Dl,并检测管家基因GAPDH作为内参照。SPSS 14.0统计软件处理试验数据,多组比较采用单因素方差分析,两两比较采用Student-Newman-Keuls检验。4.采用western blot技术,在蛋白质水平检测骨肉瘤相关凋亡蛋白(检测对象同上),并检测管家基因GAPDH作为内参照。将曝光后X-ray照片用UVP凝胶成像分析系统进行扫描,计算各基因蛋白条带与内参GAPDH蛋白条带的光密度比值,推算各凋亡因子表达的变化趋势。5.构建动物模型：对于联合切除甲状腺及甲状旁腺的大鼠随机分成4组,分别给予40μg/Kg的PTH1-34、PTH37-84、PTH1-84及生理盐水,给药持续2个月,取骨组织分别提取总RNA和蛋白质。6.采用real-time PCR、western blot技术检测骨肉瘤相关凋亡基因在mRNA水平及蛋白质水平的表达。(同细胞实验部分)结果1.细胞实验部分：(1)原代成骨细胞的鉴定：原代成骨细胞经传代后,于显微镜下观察,细胞贴壁生长,形态以不规则形、长梭形、叁角形为主,经ALP染色,说明细胞纯度较高。并采用Von Kossa染色,镜下见黑色的矿化结节,说明本实验分离得原代成骨细胞具有矿化功能。(2)PTH1-34对原代成骨细胞的作用：实验结果显示,给予10-9 mol/L的PTH1-34的原代成骨细胞,抑制细胞凋亡的基因(如bcl-2, caspase3, c-fos, cyclin Dl)与对照组相比,表达量明显增加；促进细胞凋亡的基因(如bax)与对照组相比,表达量明显降低。mRNA水平与蛋白质水平结果一致。(3)PTH37-84对原代成骨细胞的作用：实验结果显示,给予10"9 mol/L的PTH37-84的原代成骨细胞,促进细胞凋亡的基因(如bax)与对照组相比,表达量明显增加；抑制细胞凋亡的基因(如bcl-2, caspase3, c-fos, cyclin Dl)与对照组相比,表达量明显降低。mRNA水平与蛋白质水平结果一致。2.动物实验部分：(1)成功建立动物模型。(2)PTH1-34对大鼠成骨细胞的作用：给予40μg/Kg PTH1-34的大鼠检测结果与细胞实验一致,且mRNA水平与蛋白质水平结果一致。(3)PTH37-84对大鼠成骨细胞的作用：给予40μg/Kg PTH37-84的大鼠检测结果与细胞实验一致,且mRNA水平与蛋白质水平结果一致。结论1.我们成功培养了大鼠原代成骨细胞。细胞实验证实10-9 mol/L浓度的PTH1-34可能具有抑制大鼠原代成骨细胞凋亡的作用。1O-9 mol/L浓度的PTH37-84可能具有促进大鼠原代成骨细胞凋亡的作用。2.我们成功构建了去除甲状腺和甲状旁腺的动物模型。动物实验证实40μg/Kg的PTH1_34可能具有抑制大鼠成骨细胞凋亡的作用。而40μg/Kg的PTH37-84可能具有促进大鼠成骨细胞凋亡的作用。3.细胞实验和动物实验都初步证实PTH1-34可能具有抑制细胞凋亡的作用,而PTH37-84则具有促进细胞凋亡的作用。
姜惠[10]2006年在《间隙性应用甲状旁腺激素（PTH）对大鼠成骨细胞蛋白谱的影响》文中认为目的：间隙性PTH应用于大鼠和人都可以促进骨形成，但是其作用机理尚未明确。本研究试图通过蛋白质组学方法来比较间隙性PTH刺激组大鼠成骨细胞与对照组大鼠成骨细胞的蛋白质表达谱，初步探讨间隙性PTH应用促成骨的可能机制。 方法：在每个为期24小时的细胞培养周期中，大鼠成骨细胞(ROB)与PTH在前6小时共孵育，后18小时与PTH溶剂共孵育(PTH间隙刺激组)；或整个周期中仅与PTH溶剂共孵育(对照组)。在第3周期的第6小时末(PTH间隙刺激组称Itm6h，对照组称Ctr6h)、24小时末(PTH间隙刺激组为Itm24h，对照组为Ctr24h)分别收集细胞，裂解液溶解细胞蛋白。利用双向电泳方法分离细胞蛋白质，并用ImageMaster图像分析软件比较这二组细胞的蛋白质图谱，随机选择一些差异蛋白质点，应用基质辅助激光解吸离子化-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)测定其胶内酶解后的肽质量指纹图谱，通过Mascot软件查询Swiss-prot数据库。 结果：我们获得了重复性好的成骨细胞蛋白质图谱。分析蛋白质图谱发现Itm6h较Ctr6h有7种蛋白表达下调，选取其中5个蛋白质斑点，鉴定结果为：F-actin capping beta subunit, phenylalanine-tRNA synthetase-like subunit, Pp protein, IL-22R-alpha-2以及一个未知功能蛋白；Itm24h较Ctr24h有14种蛋白表达上调，有5种蛋白表达下调，选取其中14个蛋白质斑点，经鉴定得知在Itm24h中表达上调的蛋白质分别是：beta-actin, Vimentin，GRP78, GrpE-like 1, GrpE protein homolog 1, PDI precursor, ERP29 precursor, GDI alpha, proteinDJ-1，Galactokinase 1，IGFBP-3 precursor以及一个未知功能蛋白。这些差异表达的蛋白中大多数具有直接或间接调节某些细胞凋亡的功能。 结论：PTH间隙性刺激体外培养成骨细胞后能引起成骨细胞蛋白
参考文献：
[1]. 甲状旁腺激素的促成骨作用研究[D]. 张克勤. 南京医科大学. 2001
[2]. 甲状旁腺激素促成骨作用的初步研究[D]. 吕国良. 南京医科大学. 2004
[3]. ClC-3氯通道参与TGF-β/Smads通路调控甲状旁腺激素对MC3T3-E1细胞成骨分化的作用研究[D]. 张瑞. 第四军医大学. 2016
[4]. 成纤维生长因子(FGF)23基因沉默对甲状旁腺激素(PTH)促成骨细胞分化作用的影响[J]. 王金凤, 徐小雅, 丁巧灵, 周轶, 金慰芳. 复旦学报(医学版). 2013
[5]. 内源性FGF23对PTH促成骨细胞分化作用的影响[D]. 王金凤. 复旦大学. 2013
[6]. 间歇性甲状旁腺激素刺激的大鼠成骨细胞中β-肌动蛋白和波形蛋白表达上调[J]. 姜惠, 蒋兰兰, 刘超, 王富强, 张克勤. 南京医科大学学报(自然科学版). 2007
[7]. 甲状旁腺激素对体外培养的大鼠成骨细胞增殖及功能的影响[C]. 张克勤, 陈家伟, 刘超, 王美莲, 赵人铮. 中华医学会第六次全国内分泌学术会议论文汇编. 2001
[8]. ClC-3氯通道介导甲状旁腺激素对MC3T3-E1细胞成骨分化的作用研究[D]. 卢晓琳. 第四军医大学. 2015
[9]. 甲状旁腺激素羧基端肽段细胞凋亡作用的研究[D]. 张莹. 天津医科大学. 2011
[10]. 间隙性应用甲状旁腺激素（PTH）对大鼠成骨细胞蛋白谱的影响[D]. 姜惠. 南京医科大学. 2006