马丽娟肖旭平
湖南省人民医院410005
[摘要]目的探讨MMP1和TIMP4在喉癌中的表达及其与肿瘤发生、侵袭和转移的相关性。方法应用实时荧光定量PCR对MMP1和TIMP4基因在20例喉癌及癌旁正常粘膜中mRNA水平进行定量检测，同时应用SP法检测其在50例喉癌及癌旁正常粘膜中蛋白水平的表达。结果MMP1mRNA喉癌组织中的表达0.548±0.274髙于癌旁组织0.215±0.181(P<0.05)，TIMP4mRNA在喉癌组织中的表达0.478±0.24低于癌旁组织0.223±0.161(P<0.05)；MMP1在喉癌组织和癌旁组织中的蛋白表达阳性率分别为84.0％和27.2％;TIMP4在其两组中的蛋白表达阳性率分别54.0％和86.36％;MMP1和TIMP4mRNA及蛋白表达与组织病理学分级、淋巴结转移相关（P<0.05)，而与年龄无关（P>0.05);喉癌组织中MMP1和TIMP4mRNA及蛋白表达未检测到相关性（P>0.05)。结论MMP1和TIMP4表达与喉癌的发生、发展、浸润转移有关，它们有可能作为确定喉癌转移和预后的新生物学标记物。
关键词：喉肿瘤；基质金属蛋白酶类；基质金属蛋白酶类组织抑制剂
【中图分类号】R739.65【文献标识码】A
1材料与方法
1.1标本来源。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）实验标本均来源于2011年1月至2013年1月湖南省人民医院耳鼻咽喉头颈外科。所有标本均在手术切除后30min内切取适当大小保存于液氮中，所用样本均经病理科确诊。其中含20例喉癌和20例癌旁相对正常的粘膜上皮组织标本，20例喉癌均为中或高分化鳞癌。中位年龄56岁，男18例，女2例，I期和II期9例，III期和IV期11例。声门型喉癌12例，声门上型喉癌8例。
免疫组化所用的100例组织标本均来源于2008年1月至2012年1月湖南省人民医院耳鼻咽喉头颈外科和湘雅医院耳鼻咽喉头颈外科。所用样本均经病理科确诊。其中含50例喉癌和50例癌旁相对正常的粘膜上皮组织标本，50例喉癌均为中或高分化鳞癌。中位年龄60岁。男48例，女2例。I期和II期23例，III期和IV期27例。声门型喉癌37例，声门上型喉癌13例。
1.2仪器和试剂。TrizolReagent试剂购于美国Invitrogen公司，RT-PCR试剂盒购于美国Promega公司；SYBRGREENPCRMasterMix购于美国ABI公司；兔抗人MMP1多克隆抗体购自SantoCruz公司，生物素标记羊抗兔Ig-G和SABC试剂购自Sigma公司。鼠抗人TIMP-4单克隆抗体购自美国的R&DSystems，免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.3方法。实验步骤按照试剂盒说明书操作，以MMP1、TIMP4和GAPDH基因引物加入SYBRgreenⅠ荧光染料进行定量PCR反应，反应在密闭的Roche毛细硅管中进行，qRT-PCR反应条件如下：94℃2min；94℃16sec；MMP1，55℃/TIMP4,54℃20sec；72℃20sec；进行42个循环。反应完成后，软件将自动进行数据分析，调整基线，计算出Thresholdcycle(Ct值)，通过2ΔΔCt方法进行相对定量。
1.4免疫组化。检测喉癌组织中MMP1和TIMP4的表达按试剂盒操作说明进行。以阳性对照片为阳性对照，每批设置阴性对照，即用PBS代替一抗。MMP1和TIMP-4蛋白阳性表达主要表现为细胞质内含棕黄色或者棕褐色颗粒。标本阳性率由阳性标本数之和占总标本数的百分率来计算。在高倍镜下（×400）随机选择4个视野，计算出阳性细胞所占的百分率及染色强度：阳性细胞百分率0：无细胞着色；1：<25%细胞显色；2:25%-50%细胞显色；3：>50%细胞显色。染色强度0：不显色或显色不清；1：浅黄色；2：棕黄色；3：深褐色。两项乘积得最终评分。结果判定由两位病理科医师独立进行。
1.5统计学方法。采用SPSS16.0软件进行数据分析，所有数据均采用均数±标准差（x±s）表示。所有计数资料采用2检验。计量资料结果呈正态分布，且方差齐，则采用成组t检验；双侧P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1喉癌组织中MMP1和TIMP4mRNA在各组中的表达及其与临床病理学特征的关系：MMP1mRNA在喉癌组织中的表达显著高于癌旁组织（P<0.05),而TIMP4mRNA在喉癌组织中的表达显著低于癌旁组织（P<0.05)(图1,2)。随分化程度的降低MMP1mRNA的表达显著升高（P<0.05),而TIMP4mRNA的表达则显著降低（P<0.05)。淋巴结转移组中MMP1mRNA的表达显著高于无淋巴结转移组（P<0.05),而TIMP4mRNA的表达则显著低于无淋巴结转移组（P<0.05)；MMP1和TIMP4mRNA的表达与患者的年龄、性别无关（P>0.05)；相关性分析显示MMP1和TIMP4的表达无相关性（P>0.05)。
2.2喉癌组织中MMP1和TIMP4蛋白在各组中的表达及其与临床病理学特征的关系：免疫组化显示MMP1蛋白在喉癌中的阳性表达率为84.0％(42/50)显著高于癌旁组织27.2％（12/44）（P<0.05),TIMP4在喉癌组织中的阳性表达率为54.0％(27/50)显著低于癌旁组织86.36％（38/44）（P<0.05)（见图3）。在喉癌组织中，MMP1蛋白在淋巴结转移组的阳性表达率明显高于无淋巴结转移组，Ⅲ、Ⅳ期的阳性表达率的阳性表达率明显高于Ⅰ、Ⅱ期（P<0.05)；TIMP4蛋白在淋巴结转移组的阳性表达率明显低于无淋巴结转移组，Ⅲ、Ⅳ期的阳性表达率的阳性表达率明显低于Ⅰ、Ⅱ期（P<0.05)；MMP1/TIMP4的蛋白表达与患者的年龄、性别无关(P>0.05)；相关性分析显示MMP1/TIMP4蛋白的表达无相关性(P>0.05)。
3讨论
本实验分别用qRT-PCR和免疫组织化学的方法研究了MMP1和TIMP4在喉癌组织和癌旁组织中的表达情况，结果显示喉癌组织中MMP1的表达明显高于癌旁正常的粘膜组织，而TIMP4的表达明显低于正常组织;且MMP1的表达随喉癌分化程度降低和淋巴结转移而升高;TIMP4的表达则与之相反;说明MMP1和TIMP4的表达情况与喉癌的分化和转移有关。所以对恶性肿瘤而言仅检测MMP的绝对表达量意义不大,MMPs/TIMPs似乎更能作为肿瘤浸润转移的一个预后指标。尽管我们通过研究表明MMP1/TIMP4在喉癌的浸润转移中发挥非常重要的作用，但其调控机制还需进一步阐明。相信随着研究的继续深入，某些MMPs和TIMPs如MMP1/TIMP4有可能作为确定喉癌转移和预后新的生物学标记，这将为喉癌生物学靶向治疗提供重要的理论依据。
参考文献
1、YaoP,WangZB,DingYY,etal.Regulatorynetworkofdifferentiallyexpressedgenesinmetastaticosteosarcoma.MolMedRep,2015,11:2104-2110.
2、KimKY,ZhangX,ChaIH,etal.Combinedgenomicexpressionsasadiagnosticfactorfororalsquamouscellcarcinoma.Genomics,2014,103:317-322.
论文作者:马丽娟肖旭平
论文发表刊物:《中国耳鼻咽喉头颈外科》2015年8月第8期供稿
论文发表时间:2015/9/10
标签：喉癌论文; 组织论文; 阳性论文; 淋巴结论文; 蛋白论文; 标本论文; 相关性论文; 《中国耳鼻咽喉头颈外科》2015年8月第8期供稿论文;