贺 铭1，3 江 俊2 梁蕾蕾3 蒋玮莹1（通讯作者）
1中山大学中山医学院医学遗传学教研室 广东广州 510089；
2德宏职业学院 云南芒市 678400；
3昆明医科大学基础医学实验教学中心 云南昆明 650500
【摘 要】葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD）缺乏症是世界上最为常见的酶缺乏症之一。G6PD催化磷酸戊糖途径的第一步，由此酶催化生成的还原型辅酶II（NADPH）参与抗氧化性损伤是极其重要的。为了更好地理解该病，本文对G6PD表达、细胞内定位、组织表达和翻译后调节所起到的重要作用进行总结。
【关键词】G6PD缺乏症；还原型辅酶II（NADPH）；活性氧簇（ROS）；谷胱甘肽；过氧化物酶；超氧化物歧化酶（SOD）
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）缺乏症俗称蚕豆病，是一种世界上最为常见的遗传性溶血性红细胞酶缺乏病。该病在全世界分布广泛，全球约有4亿多人受累[1]。其发病原因主要因G6PD基因突变，导致G6PD酶活性降低，红细胞受氧化损伤而遭到破坏，引起溶血性贫血。世界卫生组织根据G6PD酶活性水平和临床症状，把G6PD变异性分成5类：I型：酶活性为0，伴有慢性非球形细胞性溶血性贫血；II型：酶活性严重缺乏（＜10%），当食用蚕豆或某些药物时发生溶血性贫血；III型：酶活性轻中度缺乏（10%-60%），常因感染或药物诱发溶血，一般没有溶血性贫血；IV型：酶活性为60%-150%，没有溶血性贫血，IV型又分为a和b两种（a：酶活性60%-100%；b：100%-150%）；V型：酶活性高于正常（＞200%），没有溶血性贫血[2]。
1.生物化学与分子生物学研究
当葡萄糖转运至细胞后，在己糖激酶/葡萄糖激酶作用下使葡萄糖磷酸化。葡萄糖-6-磷酸（G6P）可在糖酵解途径中被利用，产生能量ATP和NADH，以糖原形式存储或在磷酸戊糖途径（PPP）中被利用。磷酸戊糖途径被分为氧化阶段（催化第一步脱氢反应的G6PD是此代谢途径的关键酶）和非氧化阶段（包括转酮醇酶和转醛醇酶作用下一系列基团转移），磷酸戊糖途径的主要产物包括5-磷酸核糖和NADPH：前者参与核酸合成，后者在G6PD和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶（PGD）作用下由NADP+接受产生的H+而生成。G6PD是体内磷酸戊糖途径产生还原型辅酶II（NADPH）的关键酶，NADPH作为辅酶参与维持体内重要的抗氧化物，还原型谷胱甘肽（GSH），因此G6PD对维持红细胞抗氧化系统功能正常及保证红细胞膜骨架的稳定性有着极其重要的作用。
G6PD缺乏症以X染色体连锁不完全显性方式遗传。G6PD基因定位于Xq28，即X染色体长臂2区8带，这一序列在进化中高度保守。一个含赖氨酸残基的八肽序列（RIDHYLGK）决定G6PD酶活性，提供二核苷酸结合位点的七肽序列（GxxGDLx）高度保守[3]。基因由13个外显子和12个内含子组成，在哺乳动物细胞中，表达的蛋白质以二聚体或四聚体呈现活性，而非单体。其蛋白质由514个氨基酸组成，具有NADP和G6P的结合位点和稳定二聚体、保持蛋白质处于活性构象而提供给NADP的变构调节结合位点[3]。人类G6PD变异体的功能分析表明[4]，G6PD电荷特征、极性、基团的pK值、替代氨基酸的支链基团对酶活性产生影响；在锚定NADP+至催化结构域、维持酶活性时，G6PD氨基酸链中459和463位精氨酸发挥了重要作用；羧基末端第459位密码子对G6PD酶活性有重要作用。
2.G6PD的调节
有观点认为，NADPH/NADP比值调节G6PD活性，当比值下降导致G6PD酶活性增加，以产生更多的NADPH。事实上，G6PD的激活是由于细胞暴露于多种胞外氧化物质而引起NADPH水平降低。体外实验已经很清晰地证明NADPH/NADP比值调节G6PD活性，但在体实验并没有做到。其它因素如非氧化性刺激物也可以调节G6PD活性。许多研究显示G6PD活性受转录水平、翻译水平、翻译后水平和细胞间定位的高度调节，这其中主要是通过诸如磷酸化和直接的蛋白质-蛋白质相互结合的方式对G6PD的翻译后进行调节，如，Ataxia Telangiectasia Mutated（ATM）蛋白质和p53[5，6]。首先证明的是：G6PD经过翻译后修饰（磷酸化）和生长因子如PDGF和EGF，在哺乳类细胞（纤维母细胞和肾皮质细胞）刺激G6PD活性和细胞间移位。类似的发现还有：Phosphatidylinositol-3-kinase（PI-3K），Phospholipase C-γ和Ras-GTPases调节生长因子介导刺激G6PD的移位。现在已经很清楚，一系列正性和负性的调节因子可对G6PD进行调节。正性因子还包括：Vitamin D，insulin，PI3-K，AKT，mTOR（mammalian target of rapamacycin）和S6 kinase等。基因也可以起到正性调控，通过主要的脂质转录因子——胆固醇调节元件结合蛋白（SREBP）在为脂质生物合成的条件下，增加NADPH需求量，并通过转录因子Nrf2调节许多抗氧化反应元素的基因表达。抑癌基因p53作为下游的调节信号，TP53-induced glycolysis and apoptosis regulator（TIGAR）被p53激活，由于TIGAR对G6PD和PPP的调节，导致ROS降低。虽然TIGAR可上调G6PD，但p53也可抑制G6PD活性[6]。因此p53的激活后，p53的下游信号对G6PD激活和抑制的平衡决定了ROS水平和细胞表型。
主要的G6PD负性调节因子包括cAMP和cAMP依赖的蛋白激酶A（PKA），两者增加而抑制了巨噬细胞内的G6PD激活[7]。另外，PKA可增加G6PD的丝氨酸/苏氨酸磷酸化，从而导致G6PD活性的下调。虽然PKA在体外可以直接降低G6PD活性，但是仍旧不知道在体内对G6PD的效应是直接或是间接。实验显示，cAMP反应元件调节子（CREM）降低了G6PD基因的转录。这样，cAMP通过减少G6PD基因转录和减少蛋白质翻译后修饰使G6PD活性降低。花生四烯酸抵消了AMP激酶和p38 MAP激酶调节胰岛素后对G6PD的刺激作用。
从基因水平到蛋白质表达调节水平，以上多种相互作用的信号调节G6PD活性、定位和蛋白质相互作用，最终导致最后的细胞表型。
3.G6PD在细胞生存中的关键作用
我们对G6PD活性在细胞处于正常或是肿瘤生长作用的认识逐步增多。实验假设增加G6PD活性本身是正常细胞生长的必要成分[8]，使用不同的细胞类型，结果显示G6PD活性直接与细胞生长相关，抑制G6PD活性阻止细胞生长，单独过表达G6PD则刺激细胞生长。亦显示，增加的G6PD活性对于防止ROS介导细胞死亡和血清饥饿是必不可少的。实验显示，在G6PD基因敲除的胚胎干细胞中，G6PD活性对外源性氧化剂的有害效应异常敏感，亦证明在哺乳类中G6PD敲除导致胚胎致死。
4.NADPH的作用
哺乳类细胞的磷酸戊糖途径中，NADPH主要由两个酶产生，G6PD、PGD。这两个酶的作用研究很广泛，对于细胞起到了关键的作用。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆当G6PD的抑制剂损伤那些依赖于NADPH的细胞代谢进程时，G6PD在细胞利用NADPH过程中作用就显得非常重要的。抗氧化系统依赖NADPH还原产量发挥特有的功能。细胞中主要有三类抗氧化物质：谷胱甘肽、过氧化氢酶和超氧化物歧化酶（SOD）[9]。产生还原型谷胱甘肽的谷胱甘肽还原酶依赖于NADPH。过氧化氢酶在催化H2O2转变为H2O时不需要NADPH参与；但是为维持过氧化氢酶活性构象，需要该酶的变构结合位点与NADPH结合。SOD催化超氧化物为H2O2也不需要NADPH，但是如果没有过氧化氢酶或谷胱甘肽提供足够的还原态时，过氧化氢水平将在数量上增加而抑制SOD。
其它依赖NADPH的酶为一氧化氮合成酶（NOS）。NADPH提供还原当量给NOS，使其能将精氨酸转变为瓜氨酸和一氧化氮（NO）。研究表明内皮NOS（eNOS）活性依赖于G6PD产生的NADPH。经eNOS作用生成NO的基础量和刺激eNOS产生NO的增加量显著低于内皮细胞经反义寡核苷酸抑制G6PD活性。在抗氧化体系中，eNOS依赖于G6PD所产生的NADPH。有趣的是，二氢叶酸还原酶（四氢生物蝶呤主要来源）是NADPH依赖酶。所以G6PD降低致使NADPH减少可导致NO产量的降低。
其他依赖由G6PD产生NADPH的体系是一类所谓的NADPH氧化酶家族。这类酶扮演重要的生理功能角色（如正常细胞生长、白细胞功能）和病理生理功能角色（作为ROS的主要来源，在糖尿病和心血管疾病中起作用）。
5.G6PD活性降低与人类疾病
人类G6PD缺乏症相关研究主要集中在溶血和抗疟机制的研究，但也有G6PD活性和其他疾病相关的研究报道。例如，有研究推测G6PD活性降低可致糖尿病发病倾向增高，比较同一人群野生型G6PD酶活性，G6PD缺乏的对象与糖尿病发病率具有显著相关性[10]。建议应对糖尿病患者进行G6PD酶活性筛查。另一研究发现在人类中，G6PD活性与糖尿病视网膜病变程度呈负相关。
是否由于G6PD活性降低而导致许多疾病的易感性增加？这个问题仍旧没有答案。有趣的是，G6PD缺乏症可导致某些疾病的发病倾向性。虽然在过去的几年只有小型研究报道，还未见较大规模研究涉及有关G6PD缺乏症在一些疾病发展过程中所扮演的角色。如前所述，全球约有4亿人患有G6PD缺乏症（Class I、II或III突变），其G6PD活性小于野生型的60%，这个数字在全球人口范围内有可能被低估。本文中所报道的研究中，G6PD活性只有在相对适度降低时（G6PD活性为野生型的60%-100%），才能足够引起对细胞功能和细胞存活重要的损伤。这些结果暗示，G6PD活性相对较小的降低可对细胞生理和细胞存活有明显的有害效应。疾病易感性的大规模研究也需要包括IV型突变（定义为具有60%-100%正常G6PD活性）的对象，但是增加人群样本量也可能有风险。温和型G6PD缺乏症很不可能单独引起疾病，但是G6PD缺乏症是非常重要的倾向因子。
6.总结
G6PD是在许多重要代谢通路中起到纽带作用。在细胞体系中，我们对G6PD、NADPH和两者之间的关系的了解仅仅才开始。G6PD的全面了解、G6PD在细胞体系中所起到代谢纽带作用及其如何调节G6PD将为细胞进程和疾病发病机制提供关键观点。
参考文献：
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[10]Niazi G A.Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency and diabetes mellitus[J].Int J Hematol，1991，54（4）：295-298.
*国家自然科学研究基金-云南省联合重点项目（U1132606）
论文作者:贺铭1，3,江俊2,梁蕾蕾3,蒋玮莹1（通讯作者）
论文发表刊物:《航空军医》2015年4期
论文发表时间:2015/12/4
标签：活性论文; 细胞论文; 磷酸论文; 作用论文; 蛋白质论文; 缺乏症论文; 基因论文; 《航空军医》2015年4期论文;