(1湖南科技学院湘南优势植物资源综合利用湖南省重点实验室 湖南永州 425100)
(2湖南科技学院化学与生物工程学院 湖南永州 425100)
(3湖南恒伟药业股份有限公司 湖南永州 425100)
【摘要】目的:建立血络通胶囊银杏黄酮醇苷的HPLC测定方法。方法:Agilent C18柱（4.6 mm×150 mm，5?m)；流动相为甲醇-0.4%磷酸水溶液(50∶50)；流速为1.0 mL?min-1；检测波长为360 nm；柱温为30℃。结果:槲皮素、山柰素、异鼠李素分别在3.06～61.2μg?mL-1、2.46～49.2μg?mL-1、2.29～45.84μg?mL-1线性关系良好，平均回收率槲皮素为98.47%，山柰素为99.53%，异鼠李素为99.26%。结论:该测定方法简便易行、准确性好、灵敏度高、重复性好，可用于血络通胶囊中银杏黄酮醇苷的质量控制。
【关键词】血络通胶囊；黄酮醇苷；含量测定
【中图分类号】R927.2 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8231（2016）16-0232-03
血络通胶囊处方由银杏叶提取物和人参2味中药组成，由湖南恒伟药业股份有限公司研制并生产，临床上用于轻度脑动脉硬化症初期属气虚血滞所致的头痛，眩晕，健忘，肢体麻木，神疲乏力，舌质紫暗等症，其主要有效成分是银杏总黄酮醇苷，因此，建立银杏总黄酮醇苷的含量测定方法非常重要。
本研究采用HPLC对血络通胶囊中的槲皮素、山柰素和异鼠李素3种银杏叶黄酮醇苷进行定量分析，目的是建立一个能够有效控制该胶囊内在质量的方法，以利于临床更广泛、更安全地使用。此方法简单快捷，结果准确，专属性强，可用于血络通胶囊的质量控制。
1.仪器与试药
1.1 仪器
Agilent1200（美国安捷伦）高效液相色谱系统；AG285电子天平（梅特勒公司）。
1.2 试药
血络通胶囊及其阴性样品均由湖南恒伟药业股份有限公司提供(规格：0.18g/粒)；对照品槲皮素、山柰素、异鼠李素（中国食品药品检定研究院，批号分别为100081-201408，110861-201310，110860-201410；含量分别为99.1%，98.3%，99.9%）。
1.3试剂
甲醇为色谱纯，水为超纯水，其它试剂为分析纯。
2.方法与结果[1-3]
2.1色谱条件的选择
色谱条件与系统适用性实验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-0.4%的磷酸水溶液(50∶50)为流动相；检测波长360nm。流速mL?min-1，柱温30℃。理论塔板数按槲皮素计算应不低于2500。槲皮素、山柰素、异鼠李素之间及其与之相邻的峰之间的分离度应大于1.5。
2.2 对照品溶液的配制
分别精密称取槲皮素15.30mg、山柰素12.30mg、异鼠李素11.46mg对照品，加甲醇定容至50ml制成混合溶液，并作为对照品溶液。
2.3 供试品溶液制备
取本品适量，混匀，研细，取0.9g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20mL，密塞，称定重量，超声处理（功率250W，频率25KHz）30min，取出，放冷，称定重量，用甲醇补足减少的重量摇匀，滤过，精密量取续滤液10mL，加甲醇10mL、25%的盐酸溶液5mL置水浴加热回流30min，迅速放冷却至室温，转移至50mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.4 测定法
精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，记录色谱仪，取其中三个最大峰的峰面积，以外标法计算，结果乘以2.51，即得。
计算公式：总黄酮醇苷含量=（槲皮素含量+山奈素含量+异鼠李素含量）×2.51
2.5 阴性对照溶液的制备
阴性对照溶液的制备按处方比例制备不含银杏叶提取物的阴性样品，按照“2.3”项下方法制备阴性对照溶液。
2.6 专属性试验
精密量取槲皮素、山柰素、异鼠李素对照品溶液，供试品溶液，阴性对照品溶液各20μL，分别注入高效液相色谱仪，结果见图1。可见供试品与槲皮素、山柰素、异鼠李素对照品相应位置有吸收，而阴性对照无吸收，表明其他成分对银杏黄酮醇苷的测定无干扰。
1.槲皮素 2.山奈素 3.异鼠李素
A:对照品溶液 B:阴性对照品溶液 C:供试品溶液
图1 专属性试验HPLC图谱
1. Quercetin 2. Kaempferide 3. Isorhamnetin
A:Reference soloution B: negative control C: Sample solution
Table1 Specificity experiment HPLC
2.7 线性关系考察
分别精密吸取“2.2”项下的槲皮素、山柰素、异鼠李素标准储备液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于5mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，各对照品溶液分别进样10μL，记录峰面积。以峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标进行线性回归，得回归方程分别为槲皮素：y=382230x+94258,r=0.9995；山柰素：y=363883x-44785,r=0.9997；异鼠李素：y=280281x+6750.5,r=0.9994；总黄酮醇苷：y=36201x+9361.7,r=0.9992。结果表明槲皮素在3.06～61.2μg?mL-1，山柰素在2.46～49.2μg?mL-1，异鼠李素在2.29～45.84μg?mL-1，总黄酮醇苷在10.16～150.10μg?mL-1与峰面积线性关系良好。
2.8 精密度试验
取“2.2”项下标准储备液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，测定槲皮素、山柰素、异鼠李素峰面积的RSD分别为0.37%、0.68%、2.31%（n=6），表明仪器的精密度良好。
2.9 稳定性试验
取血络通胶囊内容物，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别在供试品溶液制备后0、2、4、8、10、24 h进样，测定峰面积。结果槲皮素、山柰素、异鼠李素峰面积的RSD分别为1.67%、0.69%、1.07%，结果表明供试品溶液在室温条件下放置24h内基本稳定。
2.10 重复性试验
取血络通胶囊内容物，平行6份，按“2.3”项下方法分别制备供试品溶液，依法测定，结果血络通胶囊中槲皮素、山柰素、异鼠李素的含量，结果RSD分别1.6%、1.4%、1.7%，表明该方法重复性良好。
2.11 加样回收试验
精密称取血络通胶囊内容物约0.36g，共6份，加入槲皮素对照品溶液(0.306mg?mL-1)12mL、山柰素对照品溶液(0.246mg?mL-1)8mL、异鼠李素对照品溶液(0.2292mg?mL-1)9mL，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定峰面积，计算回收率，结果槲皮素的平均回收率为98.47%，RSD值0.32%；山柰素的平均回收率为99.53%，RSD值为0.99%；异鼠李素的平均回收率为99.26%，RSD值为0.63%，表明该方法的准确度良好。
2.12 样品测定
取3批血络通胶囊（规格：0.18g/粒），按“2.3”项下方法制备供试品溶液，依法进样并测定槲皮素、山奈素、异鼠李素的峰面积，依照《中华人民共和国药典》2015版一部银杏叶提取物项下含量测定规定，银杏黄酮醇苷含量=(槲皮素含量+山柰素含量+异鼠李素含量)×2.51,结果见表4。
3.讨论
血络通胶囊由银杏叶提取物和人参二味药组成，且银杏叶提取物比例大，人参比例少，因此，其黄酮醇苷的含量测定分析相对简单，HPLC测定时杂质少。
制备供试品时超声的原因是利用超声波产生的强烈的振动、高的加速度、强烈的空化效应等作用，可加速黄酮类化合物的溶出，以提高所需物质的溶出率且明显缩短时间，减少溶剂的浪费[4]。邓丹丹[5]等研究发现用甲醇-25%盐酸(4:1，V/V)的混合液热回流提取测定银杏叶和银杏叶提取物的黄酮含量时水解2.0h为最佳，因此供试品只加热半小时以免破坏黄酮醇苷的稳定。
本文研究参照《中国药典》2015版一部银杏叶提取物项下的总黄酮醇苷含量测定方法,采用HPLC测定血络通胶囊中银杏总黄酮醇苷的含量,此法简便、准确、灵敏度高,分离效果好，见图1。本品每粒含银杏总黄酮醇苷（规格0.18g/粒）的含量不低于5.20mg。
【参考文献】
[1]尹红卫，潘苏华.HPLC测定复方胶囊银杏叶刺梨胶囊中银杏黄酮醇苷的含量[J].中国现代中药，2015.17（1）：54-57.
[2]顾燕，刘萌，张现涛，邵文豪.高效液相色谱法测定银曲胶囊张银杏总黄酮醇苷的含量[J].时珍国医国药，2008.19（8）：2016-2017.
[3]国家药典委员会，中华人民共和国药典：一部[S]北京，2015：315.
[4]熊冬梅，邓泽元，刘蓉，范亚苇，李静.高效液相色谱法测定银杏保健品中总黄酮[J].食品科学，2009.30(22):259.
[5]邓丹丹，赵浩如，黄罗生.水解时间对银杏黄酮含量的影响[J].中成药，2004，26(8):662-664.
论文作者:陈小明1,2,3,周思珂2,邵金华2,吕宏再3,李治
论文发表刊物:《心理医生》2016年16期
论文发表时间:2016/10/13
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