朱一蓓[1]2001年在《人树突状细胞体外诱导扩增的影响因素及优化方案》文中提出树突状细胞（DC）是机体内最重要的一群专职性抗原递呈细胞（APC），也是机体免疫应答的有力启动者。近年来，随着DC的功能和生物学特性被不断认识，DC在肿瘤免疫、移植免疫和抗感染免疫等方面日益受到人们的重视，被运用于B细胞淋巴瘤、黑色素瘤、前列腺癌、转移性肾癌和多发性骨髓瘤等恶性肿瘤的临床尝试性治疗，并取得了令人鼓舞的疗效。 DC的前体细胞来源于骨髓造血干细胞，继而这些前体细胞经血流到达外周组织，分化为幼稚的DC。这些DC可以通过胞吞作用摄取入侵的抗原物质，加工、处理成小分子的多肽片段，再把这些多肽片段与MHC分子结合，表达在细胞表面，然后DC离开抗原入侵的部位，进入淋巴组织，定居于淋巴结的T细胞区。在迁移的过程中，DC发生一系列的变化，逐渐失去摄取抗原的能力，上调表达协同刺激分子。成熟的DC在淋巴结与T细胞相互作用，其表面的抗原肽-MHC分子复合物被T细胞表面受体（TCR）识别产生抗原特异性信号，同时DC胞膜上表达的协同刺激分子与T细胞表面的相应分子 摘 要 结合，给T细胞提供协同刺激信号。此外，DC还分泌一些细胞因子，如 IL． 12、ILl、IL七等，使T细胞进一步活化、增殖和产主针对相应抗原的细胞 免疫应答。这一系列复杂而精细的过程，是在一些生物因子的作用下完成的， 因此进一步探讨调节DC分化、生长和成熟的生物因子和影响因素及其机制， 将有助于DC为佐剂的生物治疗的开展。 一．细胞因于对DC ｛E＠fd＆的峨 由于 DC在外周血的含量极低（仅占单个核细胞总数的 0．5l％人 sot分 离纯化，不能满足DC的实验研究及临床应用的需要，如何在体外大量扩增DC 一直是DC研究的热点。本研究首先比较了INF仓、FL、sCD40L、gp 130等 不同细胞因子对DC的诱导扩增效应，通过对所扩增DC的数量、细胞表型、 激发同种混合淋巴细胞反应的能力、分泌的 ILl 的含量、抗原摄取能力、 对 T细胞的趋化能力及对 IL刁 的桔抗效应的测定和分析，为进一步探讨 DC 体外诱导扩增的优化方案寻找可行的细胞因子组合。结果显示：＊）SCD4（） 和TNF仓都具有促进n姚、成抉的能力，可以有效地使DC上调表达协 同刺澈分子CD80、CD86并进而促进DC激发T细胞槽殖和活化的功能，但 在体外培养嫡中，sCD40L能有℃凶妨奇肮thlo的扔啼赔①宽，而TNF｛则明 显不如SCD40L舰。Q）激发型gp130单克隆抗体和人重组F’L可以显着地 促进DC的助洲，但是无明显地促进DC分 熟和促进DC激发T细胞 的功能。Q）经sCD40L和TNFa tX）8的DC均脐撇衅的IL－12， 抗原摄取删明显下降，对T淋巴细胞的趋化作用显着增强，以SCD40L的作 用强于TNFa。sCD40L在体外激发扩增DC以及以DC为主体的肿瘤免疫治 疗中具有独特的作用。 H．Y燃对DC生物学效应的作用 一定剂量的电离辐射可以对机体的多种器官和细胞产生损伤作用，而长期 4 摘 要 以来电离辐射对DC的损伤效应被人们所忽视，己有研究表明，电离辐射所 致恶性疾病的发生可能与DC数量或功能的改变有关。因此我们探讨了Y射 线对DC体外分化成熟及功能的影响，获得如下几个方面的结果：O）可射 线照射抑制DC M体外槽阻，显看地下调DC表这GM－CSFRm 和gP130分 子，但能上调＊C表达CD so、CD 86和＊L中＊R分于；Q）可射线照射增强 ＊C汲发T细胞的增殖；o）可射线照射能抑制＊C对抗原摄取的敝。在实 验中我们首次发现经过照射的DC上调性表达协同刺激分子，同时也可以相 应地提高DC对T细胞的激发作用。因此，电离辐射可以促进DC的成熟， 其在免疫应答中的作用及可能性机制值得进一步探讨。 叁．DC懒怖增的优化方案 通过对上述结果的综合分析，我们建立了在体外以GM（SF、IL＊、FL 和 SCD40L为组合的诱导扩增DC的优化方案，并在此基础上，进一步研究了 无血清培养基对DC分化发育的影响。实验结果表明，经无血清培养基诱导 扩增的DC的成熟度可能不够。鉴此，如何进一步优化无血清培养基条件： 如再添加一些必要的细胞因子如 Ah、PGEZ、IFN叶等或适量的自体血浆， 人AB型血清，值得进一步研究。 完善的DC诱导和培养体系是DC研究和应用的基础。为了有效地扩增DC 并增强其生物学功能，寻找合适的细胞因子配伍及应用顺序具有重要的应用 价值。本研究在探讨各种细胞因子及不同剂量的电离辐射对DC的生物学效 应的基础上，建立了人?
吴楠[2]2007年在《人外周血树突状细胞体外无血清诱导扩增的研究》文中指出目的：树突状细胞(dendritic cell，DC)是目前发现的功能最强大的专职抗原提呈细胞(antigen presenting cells，APC)，能摄取提呈抗原，强烈刺激初始型T细胞(naive T cell)增殖，促进细胞毒性T细胞(CTL)和T辅助细胞的生成，诱导高效特异的细胞免疫和体液免疫反应，是免疫反应的启动因子和调节因子。基于DC强大抗原提呈功能的主动特异性免疫治疗已逐渐成为肿瘤免疫治疗研究的主要方向。虽然DC在体内分布广泛，但数量少且分散，而未成熟DC主要分布在外周非淋巴组织内，直接分离、提纯十分困难，不能满足体内或体外研究及临床应用的需要。如何在体外大量扩增DC一直是DC研究的热点。目前大多数体外诱导DC的研究都使用了有血清培养基，但由于添加胎牛血清存在安全性低，不宜质控等缺点，无血清培养基正得到越来越广泛的应用，无血清培养基的使用也是DC疗法应用于临床的前提。本研究的目的是建立可用于临床治疗功能成熟的DC体外无血清扩增的优化培养方案，并比较无血清、替代血清和动物血清之间培养DC的效率。方法：本研究通过采用X—VIV020无血清培养基联合细胞因子rhGM-CSF(100ng/ml)和rhIL-4(50ng/ml)扩增人外周血分离的单个核细胞，细胞培养分别按5x10~6/ml、6x10~6/ml和7x10~6/ml的密度，加入6孔培养板(2ml/孔)。第6d加入rhTNF-a(100ng/ml)联合培养，分别于第6d，第9d和12d收获细胞。从形态学、细胞表面标志以及混合淋巴细胞反应(MLR)中对同种异体未致敏T淋巴细胞刺激能力等叁个方面进行鉴定。我们对DC体外诱导扩增的无血清条件下的细胞培养密度和培养时间进行了探索和优化。并比较无血清培养，替代血清培养和动物血清培养DC之间的效率差异。本研究分两部分进行：1、无血清培养基对人外周血来源DC的体外扩增和鉴定。2、无血清培养，替代血清培养和动物血清培养DC的效率比较。结果：1、形态学观察：倒置显微镜观察，经过9d诱导后，培养细胞悬浮生长，体积较前增大，可见有胞体拉长、表面可见毛刺状突起具有典型树突细胞外形。2、细胞表面标记分析：流式细胞仪分析，6x10~6/ml密度的细胞培养组培养到第9天最宜。培养细胞其表面共刺激分子CDla的表达率为36.57％+0.92％。3、MLR中，培养DC能刺激同种异体未致敏T淋巴细胞的增殖。4、无血清培养，替代血清培养和动物血清培养DC的效率之间存在统计学差异(P值＜0.05)。其中动物血清培养组，获得65.00％±5.27％CDla细胞；替代血清培养组，获得47.33％±5.46％CDla细胞；无血清培养组，能够获得36.57％±0.92％CDla细胞。结论：1、培养细胞具有典型的DC的形态特征，细胞表型及功能实验证实其DC的特性，说明本实验建立的无血清培养基联合细胞因子rhGM-CSF、rhIL-4和rhTNF-a体外诱导DC的方法是切实可行的。2、无血清培养，替代血清培养和动物血清培养DC效率之间存在差异。说明血清对DC分化发育存在影响。动物血清或替代血清的添加可能更有利于DC的获得。
吴林[3]2007年在《HPV-E6E7基因转染人树突状细胞抗食管癌体内外研究》文中研究指明目的：本研究旨在分离人脐带血来源的CD34~+干细胞并在体外分化扩增为成熟的功能性树突状细胞(dendritic cell，DC)的过程，并以HPV16E6／18E7基因转染DC制备DC疫苗，检测其生物学特性；观察并测定其在体外诱导的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicity T lymphocyte，CTL)活性，同时观察其对经免疫重建的SCID小鼠体内食管癌生长的免疫防治效应。方法：1．应用质粒提取试剂盒提取pcDNA3.1-HPV16E6／18E7质粒，分光光度计检测其浓度和纯度，然后通过阳离子脂质体DMRIE-C将质粒DNA转入经rhGM-CSF、rhTNF-α体外联合诱导12天的人脐血来源CD34~+干细胞，制备负载HPVl6E6／18E7基因的DC疫苗，倒置显微镜下观察并以流式细胞仪检测转染前、后其表面分子CD80、CD86、CD83及转染后E6／E7蛋白的表达情况。2．斑点杂交法测定食管癌细胞EC-109的HPV类型。3．体外抗肿瘤实验采用MTT法，检测HPV18E7-DC疫苗诱导的人外周血CTL对食管癌细胞EC-109的杀伤活性。4．HPV16E6／18E7-DC疫苗小鼠腹腔内注射2次，间隔3d，70d后检测疫苗是否具有致瘤性。5．按随机数字法将SCID小鼠随机分为免疫保护组和免疫治疗组。免疫保护组随机分成C、Im-T、Im-16D和Im-18D四小组，分别用PBS、T细胞、HPV16E6-DC+T细胞、HPV18E7-DC+T细胞免疫接种后，再接种EC-109细胞；免疫治疗组分成C、Tr-T、Tr-16D和Tr-18D四小组，分别以PBS、T细胞、HPV16E6-DC+T细胞和HPV18E7-DC+T细胞对EC-109荷瘤小鼠进行免疫治疗。以诱发小鼠肿瘤的潜伏期和肿瘤的体积、重量、生长速度等为观察指标，并进行统计学分析，以探讨HPV16E6／18E7-DC疫苗对食管癌细胞株EC-109体内生长的免疫保护和免疫治疗效应。结果：1.50ml脐带血可分离出CD34~+干细胞约1.0×10~6，台盼蓝染色95％以上不显色；在rhGM-CSF和rhTNF-α联合诱导下，14天后CD34~+干细胞约扩增10-20倍，DC的纯度达90％以上。CD34~+干细胞在培养过程中逐渐形成细胞集落，集落逐目增多增大，并在第8-9天达到最大，此后集落逐渐减少变小，并脱落成具有典型树枝状突起的成熟DC。表面分子CD80、CD86、CD83表达阳性率分别为65.5％、65.9％和80.7％。HPV16E6／18E7基因转染后DC生长良好，流式细胞仪检测发现表面分子CDSO、CD86、CD83表达阳性率分别为81.6％、80.5％和86.6％，目的基因蛋白E6、E7表达率分别为38.6％和47.5％。2．斑点杂交法检测发现食管癌细胞EC-109的病毒类型为HPV18型。3．HPV18E7-DC疫苗致敏的外周血CTL对食管癌细胞EC-109的杀伤活性明显高于DC组致敏的CTL及T组和C组(P＜0.01)，且随效靶比的增高而增强(P＜0.05)。DC致敏的CTL的杀伤活性与T组比较也有显着性差异(P＜0.05)。4．致瘤性研究显示腹腔注射HPV16E6／18E7-DC疫苗的小鼠均未发生肿瘤。5．在免疫保护组，Im-16D和Im-18D组肿瘤的生长速度减慢，肿瘤潜伏期较C组和Im-T组明显延长(P＜0.01)，肿瘤体积和肿瘤重量均明显小于C组和Im-T组(P＜0.01)，Im-16D和Im-18D组比较差异无统计学意义(P＞0.05)；在免疫治疗组，Tr-16D和Tr-18D肿瘤体积和肿瘤重量均明显小于C组和Tr-T组(P＜0.01)，Tr-16D和Tr-18D比较差异无统计学意义(P＞0.05)。结论：1．以免疫磁珠法从人脐带血中分离CD34~+干细胞，在体外经rhGM-CSF和rhTNF-α联合诱导14天，可分化扩增出大量高纯度、形态功能成熟的DC，此方法操作简便，分离细胞量大、纯度高，具有巨大的实用价值。2．使用阳离子脂质体将HPV-E6E7基因转入DC，细胞生长良好，并且目的基因在DC内高表达，说明DC疫苗构建成功，阳离子脂质体可以安全、有效的介导基因转入DC，为DC疫苗的构建做了有益探索。3．HPV18ET-DC疫苗在体外能诱导出高效的特异性CTL，对表达HPV18的食管癌EC-109细胞产生强大的特异性杀伤效应。4．HPVl6E6／18E7-DC疫苗无体内致瘤性，安全可靠。5．HPV16E6／18ET-DC疫苗能显着抵抗EC-109细胞对小鼠的攻击，并能显着抑制荷瘤小鼠体内肿瘤的生长，具有高效而显着的免疫保护和免疫治疗效应。
杨静悦[4]2007年在《腺病毒介导的基因修饰树突状细胞肝癌瘤苗的制备及其抗HBV相关肝癌的免疫实验的研究》文中进行了进一步梳理原发性肝癌是中国和部分亚洲地区最常见的恶性肿瘤之一,流行病学资料显示乙型肝炎表面抗原阳性人群肝癌发病率是其他人群的12-300倍。我国人群HBV的携带率在10%左右,而90%的原发性肝癌患者发现HBsAg阳性。尽管目前对原发性肝癌的治疗已取得一些进展,但对于晚期患者的治疗和预防复发及转移效果仍不理想[1～3]。因此,有必要探索一种新的、有效治疗途径。随着人类肿瘤抗原以及肿瘤抗原基因的发现和确认,为肿瘤的免疫治疗尤其是主动性免疫治疗提供了新的手段。直接作用于肿瘤特异性抗原或相关抗原的治疗性瘤苗是目前研究的热点。其抗肿瘤免疫的重要目的就是诱导针对肿瘤的特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytocoxic T lymphocyte,CTL)反应,而CTL的激活依赖于抗原提呈细胞(Antigen-presenting cell,APC)提供的抗原多肽和共刺激信号。在抗原提呈细胞中,尤以树突状细胞(Dendritic cell,DC)的抗原提呈功能最强,可启动并调节免疫应答,有效刺激T、B淋巴细胞活化,在抗肿瘤、抗感染、移植排斥以及自身免疫性疾病发病过程中起重要作用。目前DC在抗肿瘤免疫治疗方面的研究已经取得一些进展,并且在肿瘤的临床治疗上已显示其良好的治疗效果。但是由于大多数肿瘤来说,肿瘤组织中仅部分肿瘤细胞表达一种肿瘤相关抗原,针对单一肿瘤相关抗原的免疫应答无法清除所有肿瘤细胞。并且肿瘤细胞本身存在多种肿瘤相关抗原,针对单一抗原的免疫治疗有时并不能发挥其应有的作用,激发的免疫效应弱。故近来为使DC能够负载更多肿瘤抗原,发挥更大免疫治疗效应,人们研究了DC负载多种抗原的制备方法,包括:经照射的肿瘤细胞与DC共培养,肿瘤细胞来源的RNA转染DC,腺病毒介导多种肿瘤相关抗原感染DC以及多种肿瘤相关抗原肽冲击致敏DC等方法。在这些方法中以肿瘤细胞来源的RNA转染DC以及腺病毒介导多种肿瘤相关抗原感染DC最为有效,但肿瘤细胞来源的RNA具有生物活性不稳定等缺点。因此,在本研究中,我们根据中国人原发性肝癌独有的流行病学特点,应用HBV相关性肝癌中HBV病毒特异性抗原,联合肝癌相关抗原AFP作为免疫治疗靶点,制备AFP、HBsAg基因的腺病毒载体,体外转染人树突状细胞,比较HBsAg- DC、AFP-DC以及AFP / HBsAg-DC瘤苗体外对HBsAg表达的人肝癌细胞株的杀伤活性。探讨腺病毒介导的HBsAg、AFP基因共感染较单基因感染DC能否增强其体外诱导的特异性抗肿瘤免疫效应,以期选择更为有效的DC肝癌瘤苗,为原发性HBV感染肝癌的治疗寻求新的途径。第一部分:HBsAg、AFP基因重组腺病毒表达载体的构建及鉴定目的构建能高效转导HBsAg、AFP基因的重组腺病毒,进行病毒扩增和滴度测定,并检测HBsAg、AFP抗原表达,以用于DC基因治疗的实验研究。方法应用Adeno-XTM腺病毒表达载体系统分别构建表达AFP、HBsAg的重组腺病毒和对照载体Ad-GFP。目的基因首先克隆到pShuttle形成穿梭载体,用PI-SceⅠ和I-CeuⅠ双酶切后将所获HBsAg、AFP基因片段再与线性化的腺病毒载体Adeno-X连接,形成重组腺病毒质粒,再以PacⅠ酶切线性化,转染HEK293细胞包装为重组腺病毒。检测病毒滴度后,进一步对重组腺病毒分别感染HEK293和H1299细胞的结果进行IFA法检测目的基因在靶细胞中的有效表达。结果经酶切、PCR鉴定证实,穿梭质粒和重组腺病毒质粒插入片段为HBsAg、AFP基因。包装的腺病毒载体具有良好的感染性,可以在293细胞中形成病毒颗粒。滴度测定结果为Ad-S 2.65×109 PFU/ml;Ad-AFP采用同样方法测定的滴度为3.16×109 PFU/ml。重组腺病毒感染H1299细胞后IFA法检测结果显示目的基因表达于感染细胞中,表明腺病毒介导的HBsAg、AFP基因感染的有效性。结论成功构建了复制缺陷型AFP、HBsAg重组腺病毒及对照重组腺病毒Ad-GFP;重组腺病毒Ad-S、Ad-AFP能高效介导基因在被感染细胞内有效表达。第二部分:树突状细胞的体外诱导及其体外感染腺病毒效率的测定目的以经动员富集的肝癌患者外周血单个核细胞(Mono nuclear cell,MNC)为来源,建立体外诱导培养DC的方法;以健康供者MNC为对照,检测肝癌DC的形态、表型及功能;利用Ad-GFP作为研究对象,测定腺病毒介导的树突状细胞的体外转染效率。方法选择肝癌患者及正常人外周血,血细胞分离机分离富集外周血MNC,经淋巴细胞分离液梯度离心、聚苯乙烯细胞培养板贴壁纯化后,加入含GM-CSF和IL-4的X-VIVO 15培养液联合诱导DC分化,诱导d6加入TNF-α促进DC成熟。分别以倒置显微镜、电子显微镜观察DC形态变化,FCM检测细胞表型变化。利用Ad-GFP作为研究对象,测定腺病毒介导的树突状细胞的体外转染效率,MTT法检测DC刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力。取培养第7天的DC,按不同的MOI将重组腺病毒加入培养孔中,FCM检测细胞感染前后的表型变化以及腺病毒的感染效率。结果肝癌患者DC鉴定:诱导后,患者DC显示出典型的形态及表型特征。诱导d8(加TNF-α活化48h),各抗原表达量明显升高,分别为:CD1a( 71.45士4.39)%、CD11c( 89.68士3.16)%、CD86(91.17士4.43)%、CD80 ( 91.37士4.12)%、HLA-DR( 94.03士3.01 )%,为典型DC表型;健康对照DC各抗原表达量为CD1a( 68.45士5.02)%、CD11c( 91.09士2.01)%、CD86(92.19士4.36)%、CD80 ( 90.81士3.15)%、HLA-DR( 93.49士4.18 )%,二者间无显着性差异(P>0.05 )。混合淋巴细胞反应结果显示,患者DC具有高效地刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力,其刺激指数( SI)与健康对照DC的SI无显着差异(P>0.05 )。用Ad-GFP感染培养的DCs时,有较好的量效关系和时效关系。当感染增殖率(multiplicity of infection, MOI)为100时,感染24小时接近80.62%的DCs被转染。且转染后的DCs的形态与对照组相比无明显异常。当MOI为100,感染48小时后接近85.25%的DC被转染。并且DC经腺病毒感染DC 48小时后,FCM检测细胞表型为成熟DC表型特征。证明Ad-GFP能高效、安全感染培养的DC。结论以肿瘤患者经动员富集的外周血MNC为来源,联合应用GM-CSF、IL-4及TNF-α,在体外可诱导培养出具有典型形态、表型及免疫活性的DC。腺病毒介导的基因可感染人外周血MNC来源的DC可高效表达。第叁部分:重组腺病毒介导HBsAg和AFP基因修饰树突状细胞体外诱导抗HBV相关肝癌免疫实验的研究目的以腺病毒载体介导AFP基因与HBsAg基因修饰树突状细胞,使之作为抗原呈递细胞,同时呈递HBV肝癌相关抗原AFP和HBsAg,从而诱导更强的特异性CTLs,即可对恶性肿瘤细胞发挥杀伤效应,又可诱导抗HBV免疫的作用。并探讨AFP、HBsAg基因修饰树突状细胞较单基因修饰DC瘤苗作为HBV持续感染的肝癌免疫治疗是否更具优势。方法分别以Ad-S、Ad-AFP以及Ad-S和Ad-AFP转染DC,以IFA法检测叁组细胞抗原表达,以FCM检测感染后DC表型变化。以S-DC、AFP-DC与S/AFP-DC作为刺激细胞,取患者外周静脉血单个核细胞(PBMC )中非贴壁细胞(淋巴细胞,L),调整细胞密度为1×106/mL,以含1L-2,10%FCS的RPMI1640培养;将S-DC、AFP-DC与S/AFP-DC以5×104mL密度分别加入上述淋巴细胞中,共同孵育72h (设未致敏DC组和单独淋巴细胞组为对照),再次加入同剂量DC孵育72h,收获细胞分别称为S/AFP-DC-L、AFP-DC-L、S-DC-L、DC-L和L。以S/AFP-DC-L、AFP-DC-L、S-DC-L、DC-L和L作为效应细胞,肝癌细胞株HepG2.2.15,SMMC-7721和人肺腺癌H1299作为靶细胞,以不同效靶比接种于96孔板,4h后LDH法测定效应细胞对各肿瘤细胞的杀伤作用。结果IFA法检测结果显示目的基因均表达于转染的叁组细胞中。FCM结果显示共感染的DC细胞均高表达CD1a、CD11c、CD80、CD86和HLA-DR,表现为成熟DC表型特征。CTL结果显示S/AFP-DC-L、S-DC-L、AFP-DC-L组均显示对HepG2.2.15高效特异的杀伤活性,显着高于DC-L组和单纯L组,其杀伤能力与效应细胞数量成正比;在同一效靶比时S/AFP-DC-L对HepG2.2.15的杀伤率明显高于S-DC-L、AFP-DC-L组;而S-DC-L、AFP-DC-L组对HepG2.2.15的杀伤率无明显区别;S/AFP-DC-L、S-DC-L、AFP-DC-L刺激的T细胞组IFN-γ分泌显著高于DC刺激的L细胞组和L细胞组;但S/AFP-DC-L刺激组IFN-γ分泌显著高于S-DC-L、AFP-DC-L组;而S-DC-L、AFP-DC-L刺激组IFN-γ分泌无明显区别;对照组DC-L和L组IFN-γ分泌亦无明显区别。结论腺病毒介导AFP和HBsAg基因修饰DC,能够在体外诱导特异性CTL效应,对表达HBsAg的肝癌细胞有明显的杀伤作用,而且对HepG2.2.15细胞杀伤率大于单独转基因者。
胡茂志, 戴华, 焦新安, 张辉, 潘志明[5]2007年在《小鼠骨髓源性树突状细胞的体外诱导》文中进行了进一步梳理分离树突状细胞(DC)的原理是依据DC的低密度和半黏附特性,DC缺乏Fc受体,可对获得的DC进一步纯化。这种方法获取的DC数量有限。细胞因子诱生法是目前体外扩增DC常用的方法。其中,扩增效果最好的细胞因子是粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素4(IL-4)。通过诱导,每只小鼠可以获得107左右的未成熟DC。本
王茂鹏, 杜寿文, 李昌, 金宁一[6]2013年在《人树突状细胞分离与鉴定最新研究进展》文中指出树突状细胞(dendritic cell,DC)是最重要的抗原提呈细胞,在许多疾病过程中发挥免疫调节作用。DC的发现者Steinman对它在获得性免疫中的作用进行了深入研究,Beutler深入探讨了DC在固有免疫中的作用,2011年他们以此获得诺贝尔生理或医学奖,充分表明DC在免疫学领域的重大意义。DC的功能主要体现在叁个方面:"哨兵(sentinel)"作
马俊芬, 杨洪艳, 董子明[7]2003年在《人树突状细胞体外诱导分化扩增方法》文中提出目的 :探讨获得大量人树突状细胞的方法。方法 :采用密度梯度离心加细胞因子rhIL 4和rhGM CSF诱生法。结论 :用该方法可获得大量的人树突状细胞。
林洪羽[8]2015年在《人可溶性CD83在体外抑制人类单核细胞分化为树突状细胞的研究》文中研究指明人类CD83蛋白主要在成熟的树突状细胞(m DCs)中进行表达,它是I型免疫球蛋白超家族的成员。因此,一直以来,被人们认为是成熟树突状细胞的标记物。然而,通过越来越多的实验证明,CD83不仅是树突状细胞成熟的标记物,它也是一个免疫调节分子。在成熟的树突细胞(m DCs)表面存在两种形式的CD83:其一为存在于成熟树突状细胞膜的表面,属于膜结合型的CD83,我们称之为m CD83;其二是可从树突细胞表面释放,并且可溶解在体液中的形式,称之为可溶性CD83,即s CD83。有趣的是,经试验证实膜结合的CD83(m CD83)在免疫反应中具有免疫刺激能力,相反可溶性CD83(s CD83)在免疫调节过程当中却具有免疫抑制能力。然而s CD83对人类单核细胞分化成树突状细胞的过程中是否也起到了抑制作用尚不清楚。为了对这一机制进行探究,首先采集健康人类抗凝血,通过Ficall-Paque梯度离心分离淋巴细胞,将收集到的细胞培养2 h后,贴在培养瓶壁上的细胞就是人类单核细胞。用细胞因子GM-CSF和白介素-4诱导单核细胞(约6-7d),使其分化为树突细胞。另一方面,通过RT-PCR方法从人树突细胞扩增s CD83基因。扩增后的目的片段通过Kpn I和Age I酶切位点插入到pc DNA3.1A质粒中,构建成与His标签融合的人s CD83表达载体pc DNA-CD83-His。通过脂质体转染法将pc DNA-CD83-His及空载体(pc DNA3.1A)分别转染到人HEK293T细胞。转染pc DNA-CD83-His的细胞一部分加入衣霉素(抑制s CD83糖基化作用)。转染48-72h后,收集培养基,经过Ni-NTA琼脂糖凝胶纯化重组s CD83,用Western-Blot进行鉴定。用s CD83处理在体外诱导培养的单核细胞,用流式细胞仪分析细胞面标记物的变化,分析s CD83对单核细胞分化树突细胞的影响。结果显示,s CD83可明显抑制CD14的下降(P<0.01),促进CD1a,CD80,CD86和MHC II表达(P<0.01或P<0.05),表明s CD83对单核细胞分化成树突状细胞有抑制作用,并且表现糖基化s CD83的抑制作用高于非糖基化s CD83。
尹学亮[9]2007年在《树突状细胞基因表达与动脉粥样硬化斑块不稳定关系的研究》文中进行了进一步梳理冠心病(coronary heart disease,CHD)作为进入二十世纪以来,威胁人类生命健康的主要疾病,其有效防治一直成为整个社会关注的重点和难点。但是CHD的发病机制至今仍不明了,成为阻滞其治疗进展的主要难题。动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是心脑血管疾病的发病的主要病理基础。以往关于AS形成的机制主要围绕叁种学说,脂质沉淀学说、损伤修复学说和血栓形成学说。因而,高龄、血脂升高、吸烟、血压升高、血糖升高、高半胱氨酸血症以及高尿酸血症等导致血管内皮损伤和脂质沉积的内在因素,被界定为CHD发病的高危因素。远离这些危险因素,或者控制这些因素的恶化,在一定程度上取得了预防AS发生发展的成果。然而,随着CHD发病的逐渐年轻,进展逐渐加快,使得人们对危险因素的预防治疗提出了疑问。近年来,随着急性冠脉综合症(acutecoronary syndrome,ACS)这个CHD的急性进展阶段的界定,使得人们重新认识了CHD发展阶段的病理和病理生理特点。研究发现ACS的病理基础是易损斑块,并且发现易损斑块伴随着大量炎症细胞和免疫细胞的介入,是斑块不稳定和容易破裂的主要原因;ACS患者存在全身炎症因子和炎症反应活化的情况。进而,发现AS的所有阶段都有免疫细胞的介入,提出CHD是一种慢性炎症和自身免疫性疾病这一新观点,认为内在或外在危险因素导致的炎症和免疫反应是AS发病的基础。树突状细胞(Dendritic cells,DCs)是免疫过程中起负责抗原呈递的细胞,是机体内功能最强的专职抗原呈递细胞。极少量的DCs即可强烈激活T淋巴细胞启动特异性细胞免疫反应,其激活T淋巴细胞的能力是巨噬细胞或B细胞的100～1000倍,在免疫应答的诱导和调节中起重要作用。最近研究证实在动脉壁中有引起免疫反应发生的微环境,正常动脉内膜存在一种血管相关淋巴组织(Vascular-associated lymphoid tissue,VALT),类似于呼吸道和胃肠道中的粘膜相关淋巴组织,散在分布着一些由免疫活性细胞和抗原呈递细胞组成的细胞群,对血管组织中可能有害的内源性或外源性抗原进行监视和筛查。VALT中发现有血管树突状细胞(Vascular dendritic cells,VDCs)的存在,正常的动脉壁中VDCs较少,属未成熟形式,主要分布在血管的内膜和外膜。VDCs在AS病变中聚集明显增加,在炎症浸润区域往往与T淋巴细胞和巨噬细胞聚集在一起。DCs与T淋巴细胞共同出现在AS的病变薄弱部位,使得人们推测DCs在AS的发生发展中可能同样起着启动炎症和免疫反应的作用。最近的研究显示氧化修饰的低密度脂蛋白和尼古丁可通过激活DCs介导的获得性免疫反应,促进AS病变的进展。说明DCs可能参与了AS的病理发生,在触发和放大AS炎症免疫反应中起重要的调节作用。然而,从DCs的发现和研究历史来看,DC仍是一种新型免疫细胞。不仅在不同的种群和不同个体DCs的成熟程度、功能状态和分型存在较大的差异,甚至同一个体的不同发育阶段,不同的组织环境下,其成熟、功能状态和亚组分型差别很大。目前公认,DC可以根据造血干细胞谱系划分为髓样DC和淋巴样DC,分别与DC1和DC2相对应。DC1亚群的表型为CD1a~+、CD1b~+、CD1c~+、CD1d low、CD4 low、CD11b~+、C D11c~+、CD13~+、CD 33~+、CD 45RA~-、CD 45RO~+、GM-CSFRa~+、IL-3Ra low,表达高水平的MHC-1、Ⅱ分子、CD40,B7分子,能诱导Th0向Th1分化,诱导Th1样的免疫应答;而DC2亚群的表型为CD1a~-、CD1b~-、CD1c~-、CD1d~-、CD4~-、CD11b~-、C D11c low、CD13 low、CD 33 low、CD 45RA~+、GM-CSFRa low、IL-3Ra~+,相对低水平地表达MHCⅠ、Ⅱ分子、CD40、B7等分子,能诱导Th0细胞向Th2亚群分化,诱导Th2样的免疫应答,DC2主要分布于小肠粘膜下Peyer's淋巴结、肺、胸腺和肝脏。不仅在不同的亚群,DCs的功能不同,在其不同成熟状态的DCs功能状态不同。未成熟的DCsⅠ、Ⅱ类MHC、共刺激因子及粘附分子表达量低,不能够激活T淋巴细胞,但有强大的捕获及加工处理抗原的能力,一旦捕获抗原后会转化为成熟形式,此时它的Ⅰ,Ⅱ类MHC、共刺激因子及粘附分子表达量增高,捕捉抗原的能力下降,而加工、递呈抗原、激活T淋巴细胞的能力则增强。DCs这种转化与免疫调节分子如CD40,CD80,CD83等表达的上调密切相关。如果AS的发病是以免疫系统的激活和炎症的介入为基础。那么这其中具有抗原呈递功能的DCs功能状态如何,正常人与CHD患者之间是否存在其功能蛋白和免疫调节分子的分泌不同,这些蛋白的基因表达是否发生变化。这些问题中,研究DCs的基因变化是问题关键。本课题分为叁个部分,将分离的临床病例外周血单核细胞(peripheral bloodmononuclear cell,PBMC)和血清为研究对象,以研究外周血PBMC源性DCs基因表达和功能变化是否介入冠心病发生发展为切入点,通过免疫荧光、流式细胞术、基因芯片、RT-PCR和ELISA等方法,重点观察外周血PBMC源性DCs的成熟状态、免疫功能和其他基因表达的差异与AS发生发展的关系,深入探讨抗原呈递细胞功能变化在AS演变不同阶段的地位和作用。旨在为AS发生发展的免疫介导学说提供实验依据和免疫治疗途径,为心脑血管疾病的防治提供新的理论平台和技术手段,具有长远的经济价值和重要的社会意义。结果分述如下:1.ACS患者外周血来源的DCs处于成熟状态,并具有诱导T细胞增殖的能力1.1各组患者一般临床资料情况比较无显着性差异临床入选病例总共81例,其中AMI组20例、UAP组20例、SAP组20例、CPS组11例、对照组10例)一般临床资料的比较显示:各组的年龄、性别比例相比差异无显着性意义(P＞0.05)。各组中主要的心血管病危险因素,如:吸烟(Smoking)、高血压(Hypertension)、糖尿病(Diabetes mellitus)、总胆固醇(Totalcholesterol)、甘油叁脂(Triglyceride)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL cholesterol)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL cholesterol)等,相互之间的比较差异无显着性意义(P＞0.05);1.2体外诱导PBMC来源的DCs,流式细胞仪鉴定DCs细胞表型:倒置相差显微镜下的形态:培养第3天可见细胞贴壁生长,由圆形变为不规则形,并长出一些小刺状结构,细胞质变得丰富。培养第5天,树突样结构更加明显,胞质更加丰富,细胞逐渐悬浮或半贴壁。培养到7天后,细胞形态无明显改变,细胞开始聚集成细胞团,大部分悬浮或半贴壁,少数贴壁。台盼蓝染色细胞活力大于96%。流式细胞仪检测人外周血PBMC来源的DCs表型为CD1α~+,CD80~+,CD83~(low),CD86~+,HLA-DR~+:1.3与自身血浆共同培养DCs上清液细胞因子IL-12检测结果:正常对照组、CPS组、SAP组、UAP组和AMI组上清液的IL-12表达量12小时样本测的分别为19.46±6.83,27.96±9.16,24.23±7.72,59.9±24.00和68.5±16.5pg/ml,24小时样本测的分别为45.84±17.64,49.04±16.62,52.1±16.55,129.41±46.60和130.86±30.68pg/ml和48小时测的分别为50.68±16.7,59.93±16.37,57.84±16.36,151.43±43.79和153.95±27pg/ml,IL-12在五组间差异有显着性意义(均P＜0.001)。LSD比较分析表明,UAP组和AMI组比正常对照组、CPS组和SAP组DCs上清培养液中IL-12浓度在12小时、24小时和48小时都升高;1.4各组DCs与自身血浆共孵育后FACS分析DCs表型变化情况:正常对照组、CPS组、SAP组、UAP组和AMI组PBMC来源的DCs细胞表面CD1α表达比例分别为11.08±3.82%,12.28±3.91%,13.71±5.53%,20.09±4.9%和20.57±4.75%。CD80比例分别46.78±16.86%,48.51±14.75%,46.81±15.92%,61.39±11.49%和60.91±17.77%。CD83比例分别为47.57±12.34%,46.59±10.22%,45.76±14.11%,54.17±16.41%和51.31±18.8%。CD86比例分别为46.83±7.45%,46.08±10.25%,45.76±17.75%,62.27±14.01%和67.98±17.03%。HLA-DR比例分别为79.01±11.05%,73.77±13.55%,72.16±17.11%,74.13±12.27%和79.23±9.79%。其中,CD1α、CD80和CD86等表型五组间比较差异有显着性意义(F_(CD1α)=13.4、F_(CD80)=4.138和F_(CD86)=8.672,均P＜0.05)。LSD比较分析表明,UAP组和AMI组比正常对照组、CPS组和SAP组CD1α、CD80和CD86表型表达细胞比例增加(均P＜0.05);1.5各组患者DCs的同种混合淋巴细胞反应:正常对照组、CPS组、SAP组、UAP组和AMI组PBMC来源的DCs细胞与同种T淋巴细胞共孵育,在DCs细胞数与T细胞比例为1∶50时各组~3H-TDR掺入率分别为1035.8±280.9,1054±247.39,1112.4±319.9、2633.6±426.1和2660.4±316.02cpm/2000cells;在DCs细胞数与T细胞比例为1∶20时各组~3H-TDR掺入率分别为2043.8±303.5,2169.55±311.6,2139±295.1、5122.3±640.4和5069.1±748.9cpm/2000cells。~3H-TDR掺入率在五组间存在显着性差异(F_(1∶50)=110.06和F_(1∶20)=155.2,P＜0.001)。LSD比较分析表明,UAP组和AMI组在~3H-TDR掺入率较其他叁组差异有显着性意义(P＜0.001);而正常对照组、CPS组和SAP组之间~3H-TDR掺入率差异无显着性意义(P＞0.05);而且,DCs在与T淋巴细胞1∶50混合时UAP组和AMI组~3H-TDR掺入率都明显增加;2.基因芯片检测外周血PBMC来源的DCs基因表达不同芯片检测的结果显示,ACS患者组功能蛋白表达基因中有5个基因呈明显上升,分别是G1P2、G1P3、IFIT4、IL-1β和MX1,这些都是高度相关的干扰素诱导蛋白基因。有17个基因呈明显下降表达,分别是ACPP、AIM2、ATM、CCR1、CCR5、CD1C、FCGR3A、IFI16、IL-16、IL-18、LY75、MAP4K3、TAP1、TAP2、TLR1、TNFRSF6和VCL等,分别属于抗原识别受体、细胞趋化因子受体、细胞因子和细胞内信号传导系统。如前所述,成熟的树突状细胞其抗原识别和摄取功能下降,而抗原提呈功能增强;最初为有关抗原加工的亚细胞结构蛋白的表达减少;而与抗原呈递相关的蛋白表达应该增多。我们的研究表明ACS患者外周血PBMC来源的DCs分别在抗原识别方面的受体如TLR1和FCGR3A等表达减低;而负责传输特异性抗原肽结合到MHC分子的TAP1和TAP2蛋白基因表达也同样下降;而CCR1和CCR5这两个趋化因子受体同样是具有趋化DCs迁徙到抗原所在区域的作用,在DCs成熟时则表达下降;而与细胞内信号传导系统高度相关的蛋白(如:MAP4K3)和某些细胞因子(如:IL-16和IL-18基因)表达下降则可能与DCs细胞信号自身传导和细胞间信号传导变化相关。而作为升高的表达基因,多为INF诱导蛋白,该组蛋白的结构和功能的研究尚处于起步阶段,仍未见报道IFIT等蛋白与DCs成熟型之间的关系报道;3.荧光定量PCR检测基因芯片结果,显示DCs基因芯片检测有较好的可信度应用荧光定量PCR检测芯片检测表达上调的基因MX1和IL-1β,以及表达下调的基因FIF16表达情况显示,ACS患者MX1和IL-1β基因表达较对照组增加幅度与基因芯片检测相似;而FIF16基因表达较对照组降低加幅度与基因芯片检测相似。通过上述叁个部分的实验,我们能够得出以下结论:①ACS患者外周血PBMC源的DCs细胞表型表达处于成熟状态,ACS患者体DCs处于成熟活化状态:②ACS患者外周PBMC来源的DCs,分泌IL-12水平较对照组明显升高,且具有诱导同种T淋巴细胞增殖的能力;③ACS患者组功能蛋白表达基因中有5个基因呈明显上升,分别是G1P2、G1P3、IFIT4、IL-1β和MX1,这些都是高度相关的干扰素诱导蛋白基因。有17个基因呈明显下降表达,分别是ACPP、AIM2、ATM、CCR1、CCR5、CD1C、FCGR3A、IFI16、IL-16、IL-18、LY75、MAP4K3、TAP1、TAP2、TLR1、TNFRSF6和VCL等,分别属于抗原识别受体、细胞趋化因子受体、细胞因子和细胞内信号传导系统:④荧光定量PCR检测芯片检测表达上调的基因MX1和IL-1β,以及表达下调的基因FIF16表达情况,验证了芯片检测的结果。
韩澍[10]2003年在《吲哚胺2，3-过氧化酶基因修饰的骨髓树突状细胞诱导移植免疫耐受的作用及其机理》文中进行了进一步梳理器官移植目前已成为许多终末疾病的首选治疗方法，在过去的半个世纪中取得了巨大的成功，使病人的生活质量有了很大提高。随着免疫学和遗传学的发展，对器官移植中的移植排斥的免疫机理有了较深刻的认识，尤其是新型免疫抑制剂环孢霉素A(CsA)的临床应用，明显降低了器官移植排斥反应的发生率。然而，终身免疫抑制所带来的毒性、机会感染及肿瘤的高发病率成为临床器官移植所面临的重要问题。供体特异性器官移植免疫耐受即在接受组织配型不相容的器官移植或加短效疗程治疗后达到不用药(常规免疫抑制剂)，不排斥，不感染的“叁不状态”是器官移植发展的方向。由于器官移植本身的特点，基因治疗技术在器官移植领域具有巨大的潜在应用价值。对供器官或者受者进行基因修饰以诱导供者特异性的移植耐受是非常现实和有前途的方案。尽管这类研究还远未能进入临床，但近年来这类研究报道相当丰富，尤其对于树突状细胞相关的研究成为移植领域研究的热点。 树突状细胞(dendritic cells,DC)作为一类具有最强抗原提呈功能的细胞群体，在识别和递呈抗原启动免疫应答、诱导移植排斥中起重要的作用。人们一直认为，DC是抗原提呈能力最强的抗原递呈细胞(APC)，是唯一能够激活初始型T细胞的APC，具有激活移植排斥反应的作用。由于激活排斥反应的DC可以是供者的DC，也可以是受者体内的DC，而存在于供体器官之中的DC，被称为“过客白细胞”(passenger leucocytes)对受体T细胞的直接激活作用，IDO基因修饰的骨髓树突状细胞诱导移植免疫耐受的作用及其机理第二军医大学博士论文往往是导致急性排斥反应发生的主要原因。因此长期以来，去除移植物中的DC，减少移植物的免疫原性，被认为是克服移植排斥反应最有效的方法之一。但是，近年来的研究表明，DC是一类异质性细胞群体，具有不同的亚群和不同的功能状态，不但在增强免疫反应上具有特别重要的作用，也具有诱导特异性的免疫耐受的作用。DC在成熟过程中表型特征和功能上均发生了很大的变化，非成熟型DC显示出较强的致耐受活性，但是通常这种活性随着DC的成熟而转变为强大的免疫原性。1992年，Starzl等在同种异体肾或肝脏移植存活30年以上的病人的血、皮肤、淋巴结中发现了微量的供体白细胞，这表明存在于移植器官中的供体干细胞在受者体内一直存活，提示这种细胞嵌合或微嵌合可以引起免疫耐受和移植器官长期存活。由于发现DC是嵌合细胞的主要成分，从而进一步证实DC具有引起特异的中枢性耐受、也可引起特异的外周性耐受的作用。1995年，LuL等报道表面缺乏共刺激分子，特别是缺乏CDSO(B7一1)和CD86(B7一2)的非成熟型DC能在体外诱导同种抗原特异性的T细胞无能，但在输入到机体后，在机体内复杂的环境下会逐渐成熟，不能保持其原有的耐受性，因此我们考虑利用成熟的树突状细胞移植前激活同种异体反应性T细胞，再利用某种手段来杀伤活化的T细胞，诱导活化的T细胞凋亡来诱导机体的免疫耐受，使树突状细胞在诱导免疫耐受中进一步发挥潜在的作用。 叫睬胺2，3一过氧化酶(IndoleamineZ，3一dioxygenase IDO)，是一个单体亚红素单体蛋白，可通过氧化色氨酸的毗咯环降解色氨酸，是色氨酸沿犬尿氨酸代谢途径降解的限速酶，其最终产物是哇琳酸。在工FN一Y的作用下，机体内的多种细胞如成纤维细胞、上皮细胞、巨噬细胞均可产生IDO，在胎盘、肺、小肠等组织，IDO的活性较高。色氨酸是一些细胞(如T细胞)及病原体生长所必需的氨基酸。因而工DO通过降解色氨酸从而抑制T细胞增殖及抑制病原体、肿瘤细胞、寄生虫、病毒等的生长。近来，人们对小鼠母胎界面滋养层细胞中IDO的研究发现，其在避免胎儿排斥，诱导胎儿免疫耐受中具有重要作用。利用1一甲基色氨酸(IDO的抑制剂)注入孕鼠，同基因的胎鼠未受影响，但却可导致异基因的胎鼠流产。也有研究表明，孕鼠注入1一甲基色氨酸后可导致母胎IDO基因修饰的骨髓树突状细胞诱导移植免疫耐受的作用及其机理第二军医大学博士论文界面有大量的T细胞浸润、广泛的炎性反应，也可导致出血坏死及补体C3的沉积。近来对人胎盘绒毛中，M一CSF作用的巨噬细胞及IFN一Y作用后的人树突状细胞的观察发现，它们均有IDO的表达，并可通过降解色氨酸抑制T细胞的增殖。抗原递呈细胞尤其是树突状细胞具有增强免疫和诱导耐受的双重作用，因而我们认为抗原递呈细胞可能通过IDO作用的色氨酸代谢途径来调节T细胞的作用。 本文通过体外培养，扩增骨髓来源的DC，分析DC及IFN一Y、CD40L、LPS作用下DC中工DOmRNA的表达，以及介导同种混合淋巴细胞增殖反应的变化;并研究IDO基因转染DC后，DC的表型及功能变化，以及在诱导机体同种抗原特异性的免疫耐受的作用和效果，通过建立小鼠血管化的同种异体异位心脏移植模型，观察IDO基因修饰的DC在诱导同种抗原特异性的心脏移植免疫耐受的体内效果，并探讨了工D0基因修饰DC诱导免疫耐受的体内外机制。第一部分.树突状细胞中IDO的表达及其调控的相关研究 树突状细胞是非常重要的专门性?
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