苏涛[1]1997年在《人食管癌相关基因的cDNA片段的克隆与鉴定》文中研究表明食管癌是我国的一种常见病，多发病，其死亡率位于全国恶性肿瘤的前列，因此，食管癌一直是我国肿瘤防治的重点研究领域之一。多年的研究表明，多种抑癌基因及癌基因与该肿瘤的发生和发展有关，但尚未发现某个基因与食管癌的发生有高度相关性，即该基因的失活或缺失将在食管中发生肿瘤。对这种基因的探索，在食管癌的基础理论研究、临床诊断与治疗中均有十分重要意义。 我们选用高效、灵敏的mRNA差异显示技术，并在本实验中将其加以改进，用自己设计的长引物替代了该方法中使用的短引物，以2例正常食管上皮、1例癌旁上皮、2例高癌家族的食管癌组织互为对照，通过对其基因表达的比较，找出差异条带，进行RT-PCR、Northern印迹杂交鉴定和DNA序列分析，并以5’RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)方法探索其全长基因，期望分离出与食管癌的发生高度相关的基因。研究结果如下： ① 在实验中，分离、鉴定了18个差异片段，其中包括正常组织表达而肿瘤不表达的正常食管基因(Normal Esophageal Gene，NEG)13个，肿瘤表达而正常组织不表达的突变食管基因(Mutated Esophageal Gene，MEG)5个。 ② 4个NEG片段在GenBank数据库中没有发现同源的已知基因或片段，可能是未知的新基因，将其分别命名为食管癌相关基因1-4(Esophageal Cancer Related Gene，ECRG 1-4)。 ③ 其他14个cDNA片段分别与GenBank中的12个已知基因或片段同源，
苏涛, 刘海玲, 陆士新, 赵新吉, 周春晓[2]1998年在《人食管癌相关基因cDNA片段的克隆与初步鉴定》文中研究说明目的分离人原发性食管组织中新的相关基因，揭示食管癌的易感性与癌变原理。方法用高效、灵敏的ｍＲＮＡ差异显示技术，以２例正常食管上皮、１例癌旁上皮、２例高癌家族的食管癌组织互为对照，通过对其基因表达的比较，找出差异条带，进行ＲＴＰＣＲ鉴定和ＤＮＡ序列分析。结果（１）在实验中，分离、鉴定了１８个差异片段，其中包括正常组织表达而肿瘤不表达的正常食管基因（ｎｏｒｍａｌｅｓｏｐｈａｇｅａｌｇｅｎｅ，ＮＥＧ）１３个，肿瘤表达而正常组织不表达的突变食管基因（ｍｕｔａｔｅｄｅｓｏｐｈａｇｅａｌｇｅｎｅ，ＭＥＧ）５个。（２）４个ＮＥＧ片段在ＧｅｎＢａｎｋ数据库中没有发现同源的已知基因或片段，将其分别命名为食管癌相关基因１～４（ｅｓｏｐｈａｇｅａｌｃａｎｃｅｒｒｅｌａｔｅｄｇｅｎｅ，ＥＣＲＧ１～４）。（３）其他１４个ｃＤＮＡ片段分别与ＧｅｎＢａｎｋ中的１２个已知基因或片段同源，这些基因在食管癌中的作用还有待于进一步研究。（４）通过ＲＴＰＣＲ鉴定，已初步证明上述４个ＥＣＲＧ片段在正常食管上皮组织和食管癌中的表达有差异。（５）通过对７个人正常组织的ｃＤＮＡ文库检测表明，这４个ＥＣＲＧ片段在胎脑、成人脑、肝、肾、睾丸、骨髓及骨胳肌?
周津[3]2000年在《食管上皮癌变不同时期差异表达基因与基因表达概况的分析》文中研究指明为了解食管癌发生的分子遗传学机理，分离食管癌中差异表达的基因，本研究应用抑制消减杂交并与PCR合成双链cDNA、反Northern筛选SSH克隆相结合，自微克级总RNA中分离出多个食管癌中差异表达的基因，其中表达明显下调的Lipocortin I、Cystatin A、Cystatin B、Cytokeratin 13等可能与食管癌的去分化、恶性增殖转化有关。应用RACE等方法，获得了一个全长866bp的新基因，命名为NMES1(Normal mucosa of esophagus specific 1)，编码一个含83个氨基酸的蛋白质。Northern及RT-PCR分析显示该基因在食管癌中表达明显下调，应用RH定位的方法，NMES1定位于15q21.1。蛋白质序列同源分析显示可能与NADH：泛醌氧化还原酶MLRQ亚基(CI-MLRQ)功能相关，但不属于氧化还原呼吸链的组分，以NMES1转染人食管癌细胞系9706,可导致细胞生长减缓，显示该基因可能在食管、胃、小肠、结肠等消化道粘膜具有特殊的功能，且与食管癌的发生发展有关。 为全面了解癌与癌旁组织以及从正常食管粘膜、癌变过程中的各个阶段到食管癌发生基因表达谱的改变，应用近年来发展的微阵列技术，分析和比较了588个肿瘤相关基因在食管癌和对应癌旁组织，以及在正常成人食管粘膜、基底细胞增生Ⅱ级、重度不典型增生、原位癌、早期侵润癌组织中的表达状况，结果发现从正常食管粘膜发展成食管癌的各个阶段都有上百个基因表达发生变化，而且基因表达谱在癌变过程中随着细胞表型的演变而变化。这些基因及其在一定时期、一定组织中的表达变化组成了癌与癌旁组织，及各
牛永东[4]2003年在《从食管癌细胞系SHEEC中克隆调控NGAL基因的NF-κB因子的初步研究》文中研究说明近年来，有研究发现NGAL(neutrophil gelatinase—associated lipocalin)可能是人类的一种新的癌基因，在食管上皮细胞癌变等过程中显著过表达，但表达调控机制不清。序列分析发现，在NGAL基因5’侧翼转录调控区有典型的转录激活因子NF-κB(nuclear factor kappa B)的结合元件(GGGAATGTCC，-180～-171bp)，提示NF-κB因子可能参与食管上皮细胞癌变等过程中NGAL基因表达的调控。 NF-κB是一类普遍存在的转录因子家族，目前已从中鉴定出了十几个成员，分别在不同的组织或阶段，依时空特异性参与着150余种基因的转录调控，主要涉及免疫炎症反应、细胞凋亡以及肿瘤的发生、浸润、转移和耐药等。那么在食管上皮细胞癌变等过程中，究竟有哪些NF-κB因子参与作用，其中是否有一些尚未被鉴定的新NF-κB因子存在?为此，本研究通过酵母单杂交等技术手段在食管癌细胞cDNA酵母杂交文库中对NF-κB因子进行了初步的筛选与鉴定，以期为阐明NGAL基因在食管上皮细胞癌变等过程中显著过表达提供理论依据。 主要研究内容与方法： 一、设计并合成诱饵片段，定向插入DNA-BD载体，通过限制性内切酶酶切和DNA测序的方法鉴定正确重组子。 二、将携带正确诱饵片段的重组子转入酵母细胞株YM4271中，通过严格的3-AT抑制试验获得酵母单杂交宿主细胞，为筛库做准备。 三、筛选食管癌细胞系SHEEC的cDNA酵母杂交文库，通过反复营养缺陷培养和3-AT加压的方法收获启动报告基因表达的阳性候选克隆。 四、抽提酵母阳性候选克隆的质粒，转化大肠杆菌后获得单一文库质粒；将纯化的单一文库质粒再次转入酵母单杂交宿主细胞，在酵母体内一对一验证激活报告基因的作用。 五、对酵母体内一对一验证的阳性克隆进行DNA测序。 六、对DNA测序结果进行鉴定和初步的生物信息学分析。 研究结果： 一、合成了三重NF-κB位点寡核苷酸串正反链，退火后，定向插入DNA-BD载体，筛选鉴定，获得了携带诱饵片段的重组子。 二、将携带正确诱饵片段的重组子转入酵母细胞株YM4271中，在严格的3-AT汕头大学医学院硕士学位论文压力下获得了基因组上整合有诱饵片段的酵母单杂交宿主细胞。 三、在SHEEC人食管癌细胞系cDNA酵母杂交文库中进行筛查，获得了阳性候选克隆351个。 四、对上述阳性候选酵母细胞克隆进行了质粒的提取与酶切鉴定，获得真正插入外源片段的阳性克隆37个。 五、对上述37个阳性克隆在酵母细胞体内进行一对一验证，其中31个被证实有激活报告基因的作用。 六、对上述31个阳性克隆进行了DNA测序，并给予鉴定分类;在此基础上，对部分结果进行了初步的生物信息学分析，发现与以往的p50或p65等NF一KB因子的结构不同。 结论: 一、成功建立了酵母单杂交实验技术平台。 二、从设计合成诱饵片段开始，经过诱饵载体构建、与宿主酵母菌细胞染色体整合、筛库、质粒提取与酶切鉴定、酵母细胞体内一对一验证以及DNA测序鉴定分类和初步的生物信息学分析等，结果提示，在食管癌细胞中可能存在着某种结构的NF一KB因子，而且可能是新结构。 三、有关NF一KB因子家族在相关基因表达调控中发挥作用是一个复杂的问题。通过本研究，在食管癌细胞中针对NGAL基因表达调控这一侧面获得了一些初步结果。今后拟采取诸如凝胶阻滞等多种实验手段，围绕进一步验证结果、排除假象开展研究。 然而，无论如何，上述结果所展示出来的实验事实都将提示我们NF一KB因子途径在食管上皮细胞癌变等过程中调控NGAL基因表达值得深入研究。
熊兴东[5]2003年在《食管癌细胞差异表达核基质蛋白的分离与鉴定》文中研究说明食管癌是我国常见的恶性肿瘤，其发病机制至今不甚明了。有研究发现与正常的食管上皮组织相比食管癌中的核基质蛋白(NMPs)有明显改变，提示某些核基质蛋白可能参与了食管癌的发生与发展，但究竟是哪些核基质蛋白有变化尚不清楚。为此，本研究联合运用双向电泳、基质辅助激光解吸附飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)、RT-PCR、cDNA克隆测序和生物信息学分析等技术手段对食管癌细胞差异表达核基质蛋白进行了研究，以期为进一步研究食管癌的发病机制提供新线索。 主要研究内容与方法： 1．应用硫酸铵沉淀法提取SHEE和SHEEC细胞的NMPs，通过Western blotting对SHEE和SHEEC细胞的NMPs进行检测分析。两种细胞的NMPs经双向凝胶电泳—银染后，利用PDQuest6.2软件分析SHEE和SHEEC细胞NMPs的双向电泳结果，并对其中三个差异表达NMPs进行MALDI-TOF-MS分析。 2．通过RT-PCR、cDNA克隆和测序等技术进一步验证食管癌差异表达NMPs—STRBP8：分别提取SHEE和SHEEC细胞的总RNA，运用RT-PCR扩增STRBP8 cDNA片段，插入pGEM-T easy载体，转化TOP10F'大肠杆菌感受态细胞，在Amp下筛选阳性克隆，DNA序列测定后进行BLAST比对。 3．利用生物信息学手段对STRBP8的结构和功能进行初步预测。 主要研究结果： 1．Western blotting分析结果显示在所提取的NMPs中组蛋白等非NMPs组分已被基本去除，而DNA拓扑异构酶Ⅱα和PCNA等主要NMPs组分被保留下来，表明NMPs的质量是可靠的，利用双向电泳和MALDI-TOF-MS技术初步鉴定出了3个食管癌差异表达NMPs—Cytoskeletal tropomyosin，FKBP6和STRBP8。 2．利用RT-PCR成功扩增出STRBP8 cDNA。将其cDNA序列插入pGEM-T easy载体后，转化TOP10F'大肠杆菌感受态细胞，经筛选获得含STRBP8的阳性克隆。测序结果显示，克隆得到的STRBP8的cDNA片段与Genebank数据库上的序列是完全一致的。 3．利用生物信息学对STRBP8的结构和功能进行了初步的预测，发现STRBP8存在多个糖基化和磷酸化位点，其二级结构以无规线团为主并有部分α-螺旋和β-折叠结构。 结论与意义: 1.在我们实验室建立了双向凝胶电泳一银染技术并优化了部分实验条件;利用PDQuest6.2软件建立了一套成熟的双向电泳凝胶图像分析方法。 2.通过双向凝胶电泳和MALDI一TOF一MS等技术对SHEE和SHEEC之间的NMPs的差异性进行研究，初步鉴定出3个差异表达NMPs，提示可能与食管癌相关。 3.利用RT一PCR、cDNA克隆与测序分析发现STRBPS mRNA只出现在食管癌细胞SHEEC中，进一步验证了质谱分析结果。 4.利用生物信息学手段对STRBPS的结构与功能所进行初步预测，为深入研究STRBPS在食管癌中的功能提供了理论依据。
刘海玲[6]1998年在《人食管癌相关基因的克隆及其在食管癌中的表达》文中研究表明食管癌的发生发展与多种癌基因、抑癌基因有关，但尚未发现与食管癌有高度相关的基因，因此，探索食管癌相关基因在基础理论研究、临床诊断与治疗方面均具有十分重要的意义。本实验采用5’-RACE技术钓取ECRG1与ECRG2的cDNA基因全长：并应用RT-PCR技术检测各种器官的癌和癌旁组织ECRG1及ECRG2基因的表达。研究结果如下： 1．经5’-RACE方法三次钓取和DNA测序，证明ECRG1cDNA序列全长为1376bp，有完整的阅读框架包含1176bp，可翻译出392个氨基酸，编码蛋白质的分子量为45KD。经核酸／蛋白质数据库进行同源性检索，无明显同源性的cDNA和氨基酸序列，表明ECRG1是一个新的基因。ECRG2部分序列正在测序过程中。 2．ECRG1、ECRG2在7例正常组织cDNA文库中均有表达，在8例胎儿器官组织中，ECRG1均有表达，而ECRG2仅在胎脑组织中有表达。 3．ECRG1、ECRG2在7例正常的食管粘膜上皮中100％表达，在44例食管癌和26例癌旁组织中ECRG1基因的阳性表达百分率分别为4.55％和46.14％；而ECRG2基因的阳性表达分别为31.86％和65.38％，并且ECRG2基因在癌中的表达量明显低于在癌旁组织中的表达量。经x~1检验。P值分别小于0.001和0.05；从而说明ECRG1可能是与食管癌的发生发展有高度相关性的抑癌基因。 4．在22例肝癌和其相对应的癌旁组织中ECRG1的阳性表达百分率分别为36.36％和40.9％；而ECRG2分别为45.45％和50％，P值均大于0.05。
陈东, 张云汉, 殷智榕, 高冬玲, 姜国忠[7]2001年在《人食管癌相关基因cDNA片段的克隆、筛选与初步鉴定》文中认为目的 :筛选和鉴定人原发性食管癌组织的相关基因 ,揭示食管癌的癌变机理。方法 :用高效、灵敏的荧光mRNA差异显示技术 ,以食管癌及相应的正常食管粘膜组织为对照 ,通过对其基因表达的比较 ,找出差异条带 ,利用ReverseNorthernDotBlot、DNA序列分析和NorthernBlot,并结合mRNA原位杂交技术对被筛片段进行鉴定。结果 :①在实验中分离、鉴定了 74条差异片段 ,其中包括正常组织表达而癌组织中不表达的差异片段 5 4个 ,癌组织中表达而正常组织不表达的差异片段 2 0个。②其中 1个片段C5 7(337bp)在GenBank数据库中没有发现同源的已知基因或片段 ,推测其可能为食管癌相关基因。③经NorthernBlot检测C5 7在癌组织中有表达信号。④原位杂交技术检测C5 7在癌组织中具有较高的阳性表达率 (74% )。结论 :食管癌组织中C5 7可能是新的食管癌相关的候选癌基因 ,它与食管癌的发生发展可能有关
李峰[8]2008年在《mRNA荧光差异显示筛选食管癌中高表达基因的研究》文中指出食管癌(esophageal carcinoma)是一种常见的消化道恶性肿瘤。我国是世界上食管癌的高发地区之一,每年平均病死者约15万人。目前食管癌的手术切除或放射性治疗或化学治疗尚无显著成效,重要的原因之一就是对食管癌的发病机理不甚清楚。随着分子生物学的迅猛发展,人们已经意识到从分子水平上研究食管癌机理的重要性。目的:本研究应用mRNA荧光差异显示技术筛选食管癌组织中差异表达的基因,初步探讨其在食管癌中的生物学行为。方法:采用mRNA荧光差异显示的方法筛选手术切除的食管癌组织及癌旁组织中差异表达的基因片断;运用RT-PCR(Real-time PCR)技术对荧光差异显示得到的食管癌差异片段进行验证;对其中高表达的差异基因片断进行全长克隆与测序。结果:1、荧光差异显示技术进行FDD-PCR反应,获得有明显差异的条带6个,对这6个差异条带进行PCR二次扩增,其中4个条带获得阳性结果,对阳性条带进行TA克隆和测序得到可信度较高的3个cDNA片段,它们大小在144bp-227bp之间,分别命名为16-0(144bp)、16-2(216bp)和16-3(227bp)。2、荧光定量PCR对这3个片段验证结果表明,它们在癌组织中表达量均明显高于其相对应的癌旁组织。在NCBI中用discontiguous megablast方法进行同源比较,16-0与人类omega蛋白(Igll3)mRNA(accessionnumber NM_001013618)3'端高度同源;16-2与人类信号转导和转录激活因子2(STAT2)mRNA(accession number NM_005419)3'端高度同源;16-3与人类第10染色体上开放阅读框99(C10orf99,accession number NM_207373)高度同源。3、对其中高表达基因片段16-0克隆得到了该基因的全长,序列分析显示,其读码框长为711bp,编码236个氨基酸。结论:mRNA水平上筛选出来的3个cDNA差异片段是食管癌组织中的高表达基因片断。结合其中主要差异基因片段16-0全长的克隆、测序及同源性比较结果,推测16-0(Igll3)可能是与食管癌相关的免疫球蛋白超家族成员,为进一步阐明其在食管癌发生、演化中的相关机制奠定了理论基础。
杨扬[9]2006年在《食管癌相关基因ECRG4的研究》文中研究指明背景和目的： 食管癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其五年生存率低于10％，发病率分别位居我国和世界的第四位和第八位，每年全世界新发食管癌病例的一半都发生在我国。食管癌是严重威胁人类健康的疾患之一，但是迄今为止，人们仍然不清楚食管癌发生发展的分子机制。目前，食管癌研究的主要方向之一就是找到影响食管癌发生发展的关键基因或比较特异的生物分子标志物，确定食管癌的遗传易感因素，并阐明其作用的分子机理。所以，食管癌相关新基因的克隆和鉴定对于食管癌易感个体的预警、临床早期诊断、治疗、预后监测以及新的抗肿瘤药物的研制都具有重要的意义。 ECRG4(GeneBank AF 325503)是中国医学科学院肿瘤研究所利用差异显示PCR(DD-PCR)法，从正常食管组织和高癌家族中分离出的一条差异表达序列，其在正常组织表达，在食管癌组织和肿瘤细胞系中表达下调。且该基因核心启动子区分布有大量的CpG岛，其甲基化状况与ECRG4在食管癌中的表达下调具有正相关性，推测其可能是新的候选抑癌基因的片段。 本课题通过生物信息学分析，对ECRG4的基本结构特征和功能进行了预测，并且从原核表达和真核表达两方面对ECRG4进行了初步功能研究，以期为食管癌的基因治疗提供新的实验依据。 方法： 1．建立和改善了ECRG4蛋白的原核高效表达体系及纯化方法。通过生物信息学分析：ECRG4蛋白N端有30个氨基酸组成的信号肽，具有极强的疏水性。在表达过程中极易形成包涵体，且在复性的过程中容易析出，从而增大了活性蛋白获取的难度。我们截去ECRG4前端的疏水性跨膜区的28个氨基酸，通过DNA
许智雄[10]1999年在《人食管癌表达下调基因的克隆及其结构分析》文中研究指明食管癌是人类常见恶性肿瘤之一，其发病率位居我国恶性肿瘤发生的第四位。我国是食管癌高发区，世界上一半以上的食管癌发生在我国。食管癌遗传流行学调查显示遗传因素在食管癌发生中起着重要的作用。但是，至今尚未发现食管癌的易感基因，食管上皮的癌变分子机理仍未明确。当前肿瘤分子遗传学的研究重点已逐渐向基因表达研究转变，即从着重质(结构)的改变转向质和量(表达)的改变并重。研究基因表达的外遗传学(epigenetics)亦己成为目前肿瘤分子遗传学研究的一个重要内容。其中，肿瘤表达下调基因分离是筛选侯选肿瘤抑制基因的一个有效途径而倍受重视。目前，国内外对食管癌表达下调基因了解甚少。鉴别和克隆更多的食管癌表达下调基因并了解其在不同个体食管癌组织与正常食管粘膜的基因表达差异状况，不仅可以加强对食管癌发生发展分子机制的阐明，而且有助于食管癌的早期诊断、有针对性的个体治疗以及设计新的抗食管癌药物。 1．应用改进的uRNA差异显示技术分离食管癌组织表达下调cDNA片段 本文首次应用三条锚定引物等摩尔混合物(GT_(15)N，N代表A，G和C)进行mRNA差异显示。采用40个10-mer随机引物(OPA-1至OPA-20，OPB-1至OPB-20)与3条锚定引物的等摩尔混和物(GT_(15)N，N为A，G和C)组合，共获得同时在三对人食管癌组织中均不表达或低表达而在同一病人癌旁食管粘膜都高表达的差异表达带30个。经Northern杂交和PCR分析证实，我们已获得在食管癌组织中表达下调的基因9个，其中有4个是新基因片段。本文主要介绍其中的三个即已知基因Ma1和新基因DRC1和DRC2。本文结果显示此方法重复性较好而且可以加快筛选差异表达基因的速度。 2．两个食管癌表达下调新基因DRC1和DRG2全长cDNA的分离和克隆 应用Marathon RACE技术，以食管癌旁cDNA为模板，分别经过两次和三次RACE反应扩增出DRC1和DRC2基因的5'cDNA末端，从而拼接得到新基因DRC1和DRC2初步的全长cDNA。最后，应用PCR技术从胎儿食管cDNA扩增而得到新基因DRC1和DRC2的全长cDNA。DRC1基因全长cDNA具有51bp
参考文献：
[1]. 人食管癌相关基因的cDNA片段的克隆与鉴定[D]. 苏涛. 中国协和医科大学. 1997
[2]. 人食管癌相关基因cDNA片段的克隆与初步鉴定[J]. 苏涛, 刘海玲, 陆士新, 赵新吉, 周春晓. 中华肿瘤杂志. 1998
[3]. 食管上皮癌变不同时期差异表达基因与基因表达概况的分析[D]. 周津. 中国协和医科大学. 2000
[4]. 从食管癌细胞系SHEEC中克隆调控NGAL基因的NF-κB因子的初步研究[D]. 牛永东. 汕头大学. 2003
[5]. 食管癌细胞差异表达核基质蛋白的分离与鉴定[D]. 熊兴东. 汕头大学. 2003
[6]. 人食管癌相关基因的克隆及其在食管癌中的表达[D]. 刘海玲. 中国协和医科大学. 1998
[7]. 人食管癌相关基因cDNA片段的克隆、筛选与初步鉴定[J]. 陈东, 张云汉, 殷智榕, 高冬玲, 姜国忠. 河南医科大学学报. 2001
[8]. mRNA荧光差异显示筛选食管癌中高表达基因的研究[D]. 李峰. 江苏大学. 2008
[9]. 食管癌相关基因ECRG4的研究[D]. 杨扬. 郑州大学. 2006
[10]. 人食管癌表达下调基因的克隆及其结构分析[D]. 许智雄. 中国协和医科大学. 1999
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