吴非1,2 罗涛2 郭远瑾2 黎红华1 梅元武2
（1.广州军区武汉总医院神经内科 湖北 武汉 430070）
（2.华中科技大学协和医院神经内科 湖北 武汉 430022）
【摘 要】目的：观察BV2小胶质细胞经典激活及替代激活后代谢分子的变化，判断鉴别M1及M2极化型小胶质细胞的方法。方法：小胶质细胞以100ng/ml的LPS及20ng/mL的IL-4分别经典激活及替代激活24小时，以ELISA方法检测IL-12、IL-10、TNF-α的分泌量，以实时荧光定量聚合酶链反应检测iNOS、Arg-1、IL-10、IL-12的mRNA表达，以流式细胞术检测细胞膜MMr蛋白表达。结果：小胶质细胞被LPS经典激活后呈M1型极化，IL-12、TNF-α分泌量、iNOSmRNA、IL-12mRNA表达量明显升高，与生理对照组比较有统计学差异（p<0.05)。小胶质细胞被IL-4替代激活后呈M2极化， IL-10分泌量、Arg-1mRNA及IL-10mRNA表达量显著升高，流式细胞术检测MMr蛋白荧光强度较生理对照组显著上升（p<0.05)。结论：小胶质细胞的能够被LPS经典激活呈M1型极化，IL-4替代激活呈M2型极化，M1/M2极化状态的小胶质细胞能够通过检测炎性相关因子、精氨酸代谢分子及细胞膜特异性蛋白三个方面得到鉴别。
【关键词】小胶质细胞；经典激活；替代激活；M1/M2型极化；脂多糖；白介素-4
【中图分类号】R741 【文献标识码】B 【文章编号】1003-5028（2015）8-0651-02
The Identification of Classical or Alternative Activation on BV2 Microglia
Wu Fei1,2,Luo Tao2,GuoYuan-jing2,Li Hong-Hua1, Mei Yuan-wu2
（1 Department of neurology, Wuhan General Hospital of Guangzhou Military 430070）
（2.Department of neurology, Wuhan Union Hospital, HuaZhong University of Science and Technology 430022)
【Abstract】Objective：To observe the changes in metabolic molecule of BV2 microglia after it is classical or alternative activated, and judge the methods to identify the M1 or M2 -type polarized microglia cells. Methods：BV2 microglia cells were classical activated by LPS in the concentration of 100ng/ml and alternative activated by IL-4 in the concentration of 20ng/mL for 24 hours, then ELISA was used to measure the levels of IL-12, IL-10, TNF-α , and Real-time PCR was used to detect the mRNA expression of iNOS,Arg-1, IL-10 and IL-12. Flow cytometry(FCM) was used to measure the levels of MMr membrane protein . Results：Microglia presented M1-type polarization state after it were classical activated, the secretion of IL-12 and TNF-α, the expression of iNOS mRNA and IL-12mRNA were significantly increased , and the difference were significant compare with that of in normal control group（P<0.05）. Microglia presented M2-type polarization state after it were alternative activated, and the secretion of IL-10, the expression of Arg-1mRNA and IL-10mRNA were significantly increased, and the difference were significant compared with that of in normal control group（P<0.05）. The levels of MMr were also increased significantly measured by Flow cytometry(FCM). Conclusion： BV2 microglia could present M1-type polarization state after it were classical activated, M2-type polarization state after alternative activated. The two type polarization could be identified detected from three aspects including inflammatory factors , arginine metabolic molecular and specific cell membrane proteins.
【Keywords】microglia，classical activation，alternative activation，M1/M2 type polarization， lipopolysaccharide，interleukin-4
小胶质细胞是中枢神经系统内重要的固有免疫细胞，也是介导免疫反应的主要效应细胞[1]。目前研究证实小胶质细胞来源于单核吞噬细胞系统，因此能够表现出巨噬细胞的很多生物学特征，比如被各种内源性及外源性病理刺激所激活、具有特异性的巨噬细胞表面抗原等等。巨噬细胞的激活途径主要包括经典激活途径和替代激活途径[2], 经典激活的巨噬细胞为M1型巨噬细胞，主要分泌大量促炎因子参予对病原体清除及疾病的炎性损伤过程，而替代激活的巨噬细胞为M2型巨噬细胞，它主要干预炎症的进展、修复损伤组织等。小胶质细胞受到不同的刺激后亦可表现为促炎和抗炎的双重作用，在老年性痴呆、帕金森病、多发性硬化等等神经系统疾病免疫反应中即能分泌具有神经毒性的炎性因子，又能分泌神经营养因子及抗炎因子[3, 4]，它的也因些被区分为M1型或M2型小胶质细胞，但小胶质细胞极化后是否能通过鉴定巨噬细胞的方法来进行鉴别目前仍无明确阐述，研究小胶质细胞极化状态对于通过其干预神经系统免疫性疾病具有重要意义。
1 材料与方法
1.1材料与试剂
BV2小胶质细胞购北北京协和医院基础所细胞中心，DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶购于Gibcol公司，脂多糖及白介素-4购于Sigma公司、小鼠 TNF-α、IL-10、IL-12ELISA检测试剂盒购于Biolegend公司，FITC标记Anti-MMr抗体购于北京雅吉生物公司，Real-time PCR （实时荧光定量）相关试剂盒购买于大连TaKaRa公司。
1.2 RT-PCR引物设计
iNOS、Arg-1、IL-10引物南京金斯瑞生物科技有限公司合成，引物序列如下：
1.2 BV2细胞的培养
BV2小胶质细胞系作为研究载体，复苏后将细胞置于含10%胎牛血清的DMEM完全培养基培养，以5%CO2、37℃培养箱内培养至细胞贴壁，每隔2－3天传代，当细胞贴壁生长且状态良好后按1×106/ml接种于6孔板。
1.3 BV2细胞分组及给药
细胞分组给药。A组为生理对照组（DMEM）、B组为经典激活组（100ng/ml的LPS诱导24小时）、C组为替代激活组（20ng/mL的IL-4诱导24小时）、 D组为M1向M2转化组（100ng/ml的LPS 刺激24小时后洗脱换液用20ng/mLIL-4再培养24小时）；E组为M2向M1转化组（20ng/mLIL-4刺激24小时后洗脱换液用100ng/ml的LPS再培养24小时）。
1.4 ELISA 测定各组TNF-α、IL-12、IL-10组织含量
将结束诱导后的各组细胞培养上清收集，按ELISA试剂盒说明书检测各组TNF-α、IL-12、IL-10水平，显色结束后用酶标仪450nm波长检测各组吸光度( D值) ，利用标准品建立标准曲线，根据标准曲线对照各组OD值计算TNF-α、IL-12、IL-10含量。
1.5 实时荧光定量PCR测定iNOS、Arg-1、IL-10mRNA的表达
按TaKaRa公司RNA提取试剂盒说明书及反转录试剂盒说明书操作，分别提取各组细胞总RNA，NanoDrop1000检测RNA的浓度，采用TAKARA逆转录及实时荧光定量试剂盒检测iNOS，Arg-1，IL-10mRNA的表达，内参对照为三磷酸甘油醛脱氢酶( GADPH)，PCR反应设置参数：95℃变性4 min；95℃ 30 s，55℃ 1 min，72℃ 1 min，35 个循环；72℃ 延伸 5 min。分每个待检样本设3个复孔检测。CT值代表RT-PCR的检测结果,待检目的基因的表达通过计算所得，计算公式为ΔCT=CT（目的基因）—CT（内参基因），ΔΔCT=ΔCT（实验组）—ΔCT（对照组），2-ΔΔCT=待检目的基因表达/对照组细胞中目的基因表达。
1.6 流式细胞仪检测BV2膜蛋白甘露糖受体MMr的表达
各组BV2细胞以用PBS洗净后以1ml胰酶消化成细胞悬液，以DMEM中止消化，以1000rpm离心5分钟，以PBS洗涤细胞2次并重悬调整细胞浓度为约1×105/ml， 100ul PBS 再次重悬，此时细胞浓度调整为1×105/ml，每管中加入0.125μl FITC-Anti-MMr(甘露糖受体)，4℃孵化0.5 h，然后用PBS洗两次。最后,各组体积为300?l的单细胞悬液在流式细胞仪 FACS Calibur(BD公司）测量各组细胞表面MMr表达的平均荧光强度。
1.7 统计学分析
实验结果计量资料用 _x ± s表示，采用SPSS 13.0软件进行单因素方差One-way ANOVA法分析多组间差异，采用Dunntt-t检验进行组间两两比较，率采用卡方检验，P＜0.05视为差异具有显著性统计学意义。
2 结果
2.1 ELISA方法检测炎性相关因子鉴定BV2小胶质细胞的经典激活及替代激活
如图1所示：BV2小胶质细胞经LPS刺激培养后，经ELISA检测细胞上清液中的促炎因子TNF-α、IL-12含量及生理对照组显著提高（p<0.05) ，抗炎因子IL-10无特别变化，显示小胶质细胞被经典激活呈现M1型极化。而BV2细胞经IL-4刺激培养后，炎性因子TNF-α、IL-12较生理对照组无显著变化，但抗炎因子IL-10分泌量较生理对照组显著提高，显示小胶质细胞被替代激活呈M2型极化
图1 BV2细胞M1/M2极化后炎性相关因子的表达检测
2.2 RT-PCR 方法检测精氨酸途径代谢分子及炎性相关因子鉴定BV2细胞的经典激活及代谢激活
如图2所示：经RT-PCR方法检测，LPS经典激活小胶质细胞后， iNOS及IL-12 mRNA基因表达较生理对照组显著提高（P＜0.05），二者均是经典途径激活的M1型小胶质细胞生物学标志，标志小胶质细胞向炎性损伤的方向极化。同时，以IL-4诱导细胞后， 与对照组比较Arg-1表达显著增加，抗炎因子IL-10含量明显增加，而Arg-1能够竞争性抑制炎性因子NO的产生，同时IL-10亦是主要抑炎因子，提示小胶质细胞能够象巨噬细胞一样被IL-4向M2型极化的抑制炎症的方向替代激活。
2.3 流式细胞仪检测BV2细胞特导性分子甘露糖受体MMr鉴定BV2细胞的替代激活。
甘露糖受体MMr是经替代激活的M2型巨噬细胞表面标志分子，可通过PCR或流式细胞仪检测，本研究以它作为研究目标检测经诱导的BV2小胶质细胞。如图3所见，A图为阴性对照组无明显阳性表达；B图为生理对照组，可见阳性表达，平均荧光强度mean值仅为19.78，显示表达量较低；C图为LPS激活组，表达量与生理对照组相似，平均荧光强度值仅18.29；D图为IL-4激活组，阳性表达97.25%，并且平均荧光强度增强至70.25，显示MMr阳性表达明显增强，提示IL-4能够诱替代激活小胶质细胞向M2型极化，促强细胞抑炎及促进组织修复。
3 讨 论
小胶质细胞是中枢神经系统内固有的免疫细胞和效应细胞，约占颅内胶质细胞的10%-20%，主要发挥营养支持、保护、组织修复的生理功能，同时也是神经系统内介导、调节免疫应答的功能细胞，影响各种炎性因子及细胞因子的释放水平，直接调整中枢神经细胞生存的微环境，在各种神经系统的损伤及疾病发生发展过程中均起到了重要作用[4-6]。因此，对于小胶质细胞的研究，包括对其激活方式及极化状态的研究，以于中枢神经系统包括炎症、退行性疾病、免疫性疾病等各种病理状态的研究均有重要意义。
关于小胶质细胞的起源，目前研究基本确定其来源于单核吞噬细胞系统，即巨噬细胞系统，是处在不同部位而功能均一的细胞群体[7]。巨噬细胞最重的特征即对环境信号的应答，针对不同的诱导因子及微环境，巨噬细胞可表现不同的活化类型 ，执行不同的功能。巨噬细胞的经典活化后称巨噬细胞M1型级极化，是机体宿主免疫的主要组成，分泌多种炎性因子如TNF-α、IL-6、IL-2等等并参予抗原递呈，参予炎性反应及致病微生物的清除。M2型巨噬细胞低表达IL-12及IL-23，但高表达IL-10、TGF-β、甘露糖受体MMr、精氨酸酶等，主要起促进组织及血管的修复、抑制炎性损伤的发展、缓解病理损伤等作用。因此，目前对于M1及M2型巨噬细胞的鉴定主要通过炎性相关因子、精氨酸途代谢酶及代谢物、特征性的细胞表面抗原分子如MMr、CD206、CD16/32三个方面作为鉴定方法[8-10]。
小胶质细胞在多种神经系统疾病的病理生理过程中亦能起到抗炎及抑炎、损伤及组织修复的双重作用[3]，类似于外周巨噬细胞一样根据微环境中诱导因子的不同表现为M1及M2不同极性，并且神经系统的小胶质细胞也不是单一均质的，在不同区域或相同区域的不同部分，可能同时存在多种细胞表型的细胞群，通过复杂的反馈调节机制共同调节细胞的功能，在中枢神经的损伤、炎症、多发性硬化、癫痫、老年性痴呆等疾病中均有表现出重要作用[11-13]。本实验研究以小鼠胶质瘤细胞株BV2细胞作为小胶质细胞的霍替代，分别给予LPS及IL4后，通过检测炎性相关因子IL-12、IL-10、TNF-α、精氨酸途径代谢酶iNOS、Arg-1以及检测特异性膜蛋白MMr，可见小胶质细胞分别向不同的极化方向发展，证实了小胶质细胞的经典激活途径和替代激活途径，LPS诱导BV2细胞经典激活，M1极化后小胶质细胞能够分泌炎性因子，促过炎性损伤进行，有利于机体杀伤致病病原体，但同时会产生神经毒性造成组织损伤；IL-4则替代激活BV2细胞向M2极化方向发展，抑炎因子IL-10表达增加，特异性MMr蛋白表达加强，有利于组织的修复及炎性损伤的减轻。同时，对于M1及M2型极化状态的小胶质细胞，可以通过类似于辨别巨噬细胞的炎性相关因子、精氨酸途代谢酶及代谢物、特征性的细胞表面抗原分子三个方面进行鉴定。
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论文作者:吴非1,2,罗涛2,郭远瑾2,黎红华1,梅元武2
论文发表刊物:《河南中医》2015年8月
论文发表时间:2016/6/1
标签：细胞论文; 胶质论文; 因子论文; 巨噬细胞论文; 经典论文; 对照组论文; 损伤论文; 《河南中医》2015年8月论文;