（2福建医科大学基础医学院人体解剖与组织胚胎学系 福建 福州 350004）
【摘要】目的：比较过氧化氢诱导对小鼠1-细胞和8-细胞胚体外发育的影响。方法：用过氧化氢处理小鼠1-细胞胚和8-细胞胚30分钟，观察并比较其体外发育至囊胚的数量。结果：以0、20、30、40和60 μM过氧化氢处理1-细胞胚，其囊胚发育率分别为84.93%、69.23%、25.35%、7.69%和0%；以0、30、60、100和200μM过氧化氢处理8-细胞胚，其囊胚发育率分别为96.88%、91.25%、68.52%、12.87%和0%。结论：小鼠1-细胞胚较8-细胞胚对过氧化氢诱导的氧化损伤更为敏感。
【关键词】过氧化氢；小鼠；早期胚胎
【中图分类号】R3 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2018）30-0201-02
活性氧自由基（ROS），包括超氧阴离子自由基（O2·-）、过氧化氢（H2O2）和羟基自由基（·OH）等。在各种哺乳动物的早期胚胎发育过程中各种代谢和培养环境中都有可能产生过量ROS，导致氧化应激现象发生，可严重影响早期胚胎的发育[1]。我们选择最常研究的1-细胞胚和8-细胞胚为研究对象，以H2O2诱导小鼠体外培养的早期胚胎的氧化损伤，探讨哪个阶段的早期胚胎对氧化损伤更为敏感，为后续优化培养体系、提高囊胚获取率提供理论基础。
1.材料与方法
1.1 实验动物
昆明（KM）小鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司（雌鼠4～6w，雄鼠8w以上），继续饲养3～5d，调节生理周期，使其适应环境供实验处理。
1.2 实验方法
KM雌鼠腹腔注射10IU PMSG，48h后注射10IU hCG，随后与KM雄鼠1:1合笼，次日清晨检查阴栓判断是否受精。分别于hCG注射后27h，从有阴栓雌鼠输卵管中收集1-细胞胚；于hCG注射后66h，从有阴栓雌鼠输卵管和子宫中收集8-细胞胚。经M2洗涤，KSOM培养液漂洗3次，挑取形态完好的1-细胞胚和8-细胞胚移至KSOM和H2O2处理微滴中，置于37℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中继续培养30min，而后将早期胚胎细胞从微滴中移出，KSOM培养液分别洗涤3次，再移入预平衡好的KSOM培养微滴中继续培养，于hCG后42h、66h（体外培养相对较体内发育速度慢，hCG后66h体外培养的多数处于4-细胞期，体内发育的多数为8-细胞期）、96h和120h观察和记录早期胚胎发育情况，每组重复3次以上。
1.3 统计学处理
采用SPSS17.0对实验数据进行卡方检验统计分析，以P＜0.05为具有统计学意义。
2.实验结果
表1 H2O2对KM小鼠1-细胞胚体外发育的影响
注：以上百分比以8-细胞胚为基数，不同组之间采用卡方检验。与对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。
KM小鼠1-细胞胚和8-细胞胚经不同浓度的H2O2（1-细胞胚处理浓度为20、30、40和60μM；8-细胞胚处理浓度为0、30、60、100和200μM）处理，与对照组相比，1-细胞胚处理组结果：20μM处理组，发育到2-8细胞阶段的发育率差别无统计学意义，但囊胚发育率有统计学意义，其他组各阶段发育率均有显著差别，60μM处理组则发育完全阻滞；8-细胞胚处理组结果：30μM处理组其囊胚发育率差别没有统计学意义，60μM处理组囊胚发育率仍有68.52%，200μM处理组发育完全阻滞。
3.讨论
少量ROS在配子成熟、受精和胚胎发育过程中发挥着重要作用[4]。但是，ROS的过量产生，这可能诱导脂质过氧化，核DNA断裂和线粒体改变等，从而影响植入前胚的发育。例如，Liu等研究显示ROS蓄积使线粒体活性和结构改变而诱发胚胎发育阻滞[2]。在小鼠1-细胞胚中加入H2O2可诱导建立胚胎氧化损伤模型。本研究结果显示：在1-细胞胚中加入20μM H2O2可引起囊胚发育率下降，60μM导致发育完全阻滞，也验证了H2O2可诱导建立胚胎氧化损伤模型。
在8-细胞胚中，30μM处理组其囊胚发育率差别没有统计学意义，60μM处理组囊胚发育率仍有68.52%，对桑椹胚的形成则几乎没有影响。实验结果表明：体外培养小鼠早期胚胎对H2O2造成的氧化应激在1-细胞期比8-细胞期更为敏感。小鼠体外发育阻滞与小鼠合子型基因组激活紧密相关，1-2细胞胚正处于合子基因组激活时期，因而体外培养1-细胞胚只需较低浓度的H2O2即可引起细胞发育阻滞，而8-细胞胚时期，已完成母型-合子型过渡，这段时间内敏感性下降，因此需较高浓度的H2O2才会引起细胞发育阻滞。另外，有研究显示多种抗氧化酶基因表达水平在小鼠胚胎2-细胞期均较低[3]，而在体外培养的小鼠早期胚胎发育过程中产生的ROS在2-细胞期时却大幅度升高[4]，体外培养的1-2细胞胚承受较高的ROS而自身的清除能力却不足，所以本研究增加少量H2O2即可诱发发育阻滞。本研究还发现随着H2O2浓度的提高，发育阻滞主要发生于1-细胞到2-细胞的过渡，以及2-细胞到4-细胞的过渡，进一步证实小鼠早期胚胎发育阻滞可能与氧化损伤有关。因此，为了提高获取率，我们可以对氧化损伤敏感的1-细胞胚和2-细胞胚为研究对象，进一步研究如何减少小鼠体外培养早期胚胎的氧化损伤以及如何抵抗氧化损伤，提高体外培养的囊胚获取率。
【参考文献】
[1] Kovacic B, Influence of atmospheric versus reduced oxygen concentration on development of human blastocysts in vitro: a prospective study on sibling oocytes[J]. Reproductive biomedicine online, 2008,17(2).
[2] Liu L, Keefe D L.Involvement of mitochondria in oxidative stress-induced cell death in mouse zygotes[J]. Biology of reproduction, 2000,62(6).
[3]井洋洋,活性氧对鼠早期胚胎抗氧化酶基因表达的影响[J].中国兽医学报,2017,37(2).
[4] Nasr-Esfahani MH, Hydrogen peroxide levels in mouse oocytes and early cleavage stage embryos developed in vitro or in vivo [J]. Development, 1990,109(2).
论文作者:史河秀1,刘玥2,许颂华2,王世鄂2（通讯作者）
论文发表刊物:《医药前沿》2018年30期
论文发表时间:2018/12/6
标签：细胞论文; 胚胎论文; 小鼠论文; 囊胚论文; 体外论文; 过氧化氢论文; 损伤论文; 《医药前沿》2018年30期论文;