杨俊晔 张亚斌 王福喜
(协和干细胞基因工程有限公司 300384)
【摘要】目的：探讨临床移植有效冷冻保存和分离造血干细胞方法。方法：采取普通、改进两种不同采血袋，采取两步离心法将脐带血的有核细胞分离、浓缩，采取常规程控降温进行冷冻，温度为-196℃的液氮之中，使用细胞培养法、流式细胞术对脐带血里CD34+细胞、造血组织分别进行检测。结果：使用改进采集方法分离，红细胞、有核细胞的回收率为86.6%、45.2%，普通采集袋中为78.5%、50.2%；可见其方法可有效提高红细胞、有核细胞回收率。结论：改进采集袋可有效将有核细胞的回收率提高。两步离心法、两种冷冻保存方法，可有效将保存脐带血的造血干细胞。
【关键词】脐带血 分离 冷冻保存
【中图分类号】R329.2 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2013）36-0218-02
目前，脐带血中造血干细胞的移植已经成功。然而，无关供者得造血干细胞移植，必须要有保存规模的血库，并将其有效的保持和分离[1]。采集脐带血未实施分离，便直接冷冻保存，会增加存在成本与空间，在融化后会出现较多红细胞溶解后产物，在注输时，会对患者的身体造成严重的损害。为了能够有效的保持脐带血，并节约成本与存储空间，借鉴于其他成功经验，本院也建立了脐带血中造血干细胞血库，实施有效分离、保存方法。
1 资料与方法
1.1脐带血标本
符合本市脐带血血库标准的共有4865分脐带血，使用二联采集袋，采集袋中含28mlCPDA。
1.2方法
脐带血的浓缩、分离，皆采用基本按方法进行。在解决条件下，将脐带血均匀取样，用于对其中血型、细胞计数、CD34+细胞等各种检测。将采集的脐带血按照5:1的比例，加入浓度为5%的HES，摇匀后10min，离心8min。从而对包细胞富含部分手机，以HES加入量，收集15～30g红细胞。
将包细胞血浆放入离心杯，756g，离心14min。将过量上层血浆去除，降温系统中留31ml包细胞血浆，生物档案留20ml即可。随后将其放入冰箱，在温度下降70℃时，立即取出放置于-196℃的液氮中。
1.3统计学分析
将本次研究数据均录入SPSS17.0软件包中采取统计学分析，（P＜0.05)差异有统计学意义。
2 结果
采用的采集袋不同，在采集的效果也各有不同。采集袋改进后，其有核细胞的回收率为86.6%，显效由于普通采集袋，结果见表1。
表1 不同采集袋的细胞回收率比较
生物档案中的保存袋容量为26ml，浓缩脐带血为20ml。常规降温系统中冷冻袋可选择不同规规格，其体积可为50ml，浓缩脐带血可为35ml。从此次研究中可表明，浓缩体积对NC、RBC的回收率有影响，但是对CFU-C、CD34+无影响。
脐带血分离前的体积为91.2ml，离心后为33.1ml，平均下降了65%左右。单核细胞的回收率为83.2%，可相比分离前却又下降不少，然而单核细胞、CD34+的回收率却有明显上升，皆无统计学变化（P＞0.05）有核细胞分离前后无明显的变化。
采取两步冷冻方法保存脐带血，通过将降温程序优化，能克服在变相点中的升温，降温率也可保持平衡。通过对其进行升温、降温时间的控制，取得的冻存效果极为良好[2]。在此次试验中，可知融化后有核细胞的回收率为85.2%，相比冷冻前有些许降下，而祖细胞、CD34+无明显变化。
3 讨论
将脐带血的造血干细胞有效浓缩、分离，可更加满足临床需要，从而降低脐带血的存储费用与空间。国外做了许多相关试验，采取淋巴细胞的分离液，分离单核细胞，可将脐带血中中性细胞有效去除，可减少脐带血的保持体积。然而分离液中却存在毒性，细胞需经过洗涤后方能保存，期间程序繁琐，易导致细胞污染、丢失。离心白膜，虽然操作简单，但细胞回收率不到70%[3]。在国际上，都采用两步离心法去除脐带血中的过量血浆，浓缩体积，其中的造血干细胞可保留。
造血干细胞的分离，影响到回收率的因素较多。在此次试验中，对不同的采集袋、体积对回收率做了比较。结果显示，二联采血袋不适宜脐带血分离，改进的采集袋，在操作过程中，不仅适用简单，也可将脐带血中有核细胞的回收率大大降低，避免在分离过程中造成细胞丢失。
程控降温是目前细胞冷冻常用方法，在FormaScientific系统中，通过对冷冻不断的摸索和探究，终于将样品相变点升温的问题克服，可保持在将为理想的降温过程中[4]。从研究结果中显示，融化后的有核细胞回收率相比之前有所降低，可造血干细胞的回收率却毫无下降趋势，结果与国外研究结果相似，虽然冷冻方法大相径庭，但是效果却无差异。结合上述，两种冷冻方法的效果皆无统计学意义（P＞0.05）。
参考文献
[1] 刘忠,孙自敏,吕蓉等.脐带血造血干细胞采集、分离和冷冻保存研究[J].中国科技成果,2009,(1):47-49.
[2] 鲁瑞周,贺雪萍,王丹丹等.DMSO联合HES冷冻保护剂对脐血造血干细胞冷冻影响研究[J].现代诊断与治疗,2012,23(12):2098-2099.
[3] 吴洁莹,廖灿,许遵鹏等.广州脐血库造血干细胞保存及临床应用[J].中华生物医学工程杂志,2010,16(5):438-443.
[4] 刘忠,周学勇,吕蓉等.脐带血单个核细胞分离及保存的优化研究[J].临床输血与检验,2011,13(3):193-196.
论文作者:杨俊晔,张亚斌,王福喜
论文发表刊物:《医药前沿》2013年第36期供稿
论文发表时间:2014-3-12
标签：细胞论文; 回收率论文; 脐带血论文; 造血干细胞论文; 方法论文; 脐带论文; 血库论文; 《医药前沿》2013年第36期供稿论文;