易甫, 吕安林, 贾国良, 贺建国, 张海滨[1]2004年在《血管内皮生长因子基因经心肌直接注射治疗犬心肌缺血模型的疗效观察》文中指出目的了解血管内皮生长因子基因经心肌直接注射治疗犬心肌缺血模型后新生血管和侧枝循环形成以及心功能改善情况。方法取实验用犬24只,结扎左冠状动脉前降支近、中段,模型建造成功后,通过直接心肌注射将hVEGF165基因转染缺血部位心肌细胞,应用超声检查以及冠状动脉造影进行监测,3个月后处死,组织学切片观察心肌组织中毛细血管生成情况。结果术后3个月,冠状动脉造影显示,治疗组新生血管数目和侧枝血管形成较对照组明显增加,TIMI血流也较对照组明显改善(P<0.05);超声检查显示,治疗组射血期及舒张早期局部心肌运动速度和二尖瓣环舒张早期平均运动速度均较对照组显着增加;组织学检查显示,治疗组心肌内毛细血管数为(133±34)/Hp,而对照组为(69±26)/Hp(P<0.01)。结论在犬心肌缺血模型经心肌直接注射pcDNA3.1(-)/VEGF165,能够促进心肌血管新生,加速侧枝循环建立,达到改善心功能的目的。
易甫[2]2003年在《血管内皮生长因子基因经心肌直接注射治疗犬心肌缺血模型的疗效观察》文中研究指明实验背景 随着冠状动脉成形术和冠状动脉搭桥术的广泛开展，许多缺血性心脏病患者能够得到有效的治疗，但仍有一部分患者由于血管病变过重、病变范围长且弥漫等原因不适宜接受介入或手术治疗，而且如果血运重建有所延迟的话，心脏功能也不能完全恢复。为了使这些患者能够得到有效的治疗，基因治疗成为研究的热点。通过输入外源性促血管生长因子，利用血管组织内在的生长潜能，在生长因子的影响下产生新的血管，达到治疗心肌缺血的作用。这种新兴的治疗方法被称为“治疗性血管生成”或形象的称为“分子搭桥”或“微搭桥”。血管内皮细胞生长因子因为其强大的促进新血管形成的作用，使其在“治疗性血管生成”中成为研究热点。 目的与方法 第一部分：目的是合成VEGF真核表达载体pcDNA3.1(-)／VEGF-165；方法是应用基因克隆方法构建VEGF真核表达载体pcDNA3.1(-) 第四军医大学硕士学位论文／VEGFI 65，通过小量酶切法与基回测序对重组质粒进行鉴定。 第一部分：目的是通过转染心肌细胞来验证其生物活性；方法是应用阳性脂质体介导的基因转染技术，将真核表达载体pCDNA3．l 卜）／VEGF－165瞬时转染体外培养的大鼠心肌细胞中，采用 RTPCR，ELISA，WCstenl blot及免疫组化染色等方法检测 VEGF－165基因在心肌细胞中的表达情况，应用 MTT法检测转染后细胞培养卜清液中 VEGF 65的生物活，r4，。 第叁部分：目的是真核表达质粒 pCDNA3．l卜）／VEGF 65经心肌直接注射治疗犬心肌缺血模型后新牛血管和侧枝循环形成以及心功能改善情况。内容是建造犬急性心肌梗死模型，通过直接心肌注射将重组质粒转染梗死区域心肌细胞，3月后应川冠状动脉造影进行监测并处死，组织病理学切片观察心肌组织中毛细血竹生成情况。实验结果1．基冈测序及凝胶电泳结果证u已将＊＊G卜165基问片断成功克隆到 pCDNA3＊ 卜）／VEGFI 65 hJ。2．将构建好的真核表达质粒 pCDNA3二厂卜 VEGFI 65转染心肌细胞后， VEGF mRNA水平明显升高，ELJISA及 Western blot检测到 VEGF蛋白 表达水平明显增高，并且转染后的心肌细胞培养＿广沽液具有促使血管 匹 皮乡胞增午 的尘物活性口3．术后3月，＊＊G显示，治疗纵新生血管数目和侧枝血管形成较对照组 明显增加，TIMI血流分级M交对照组明显改善（P（．05）；组织学检查 显示，治疗组心肌内毛细血．牡数明显增加（P＜0．05）。结论 〕 第四军医大学硕士学位论文1．成功构建了真核表达质粒 PCDNA3．l卜一／VEGF 65。2．真核表达质粒pCDNA3．l卜厂VEGFJ 转染心肌细胞后可获得较高水 平VEGF蛋白的表达，所表达出VEGF蛋白具有生物学活性。3．在大心肌缺血模型经心肌直按注射pc＊＊M．1卜川＊＊＊卜165，能够促 进心肌微小血管新生，加速侧枝循环建立，达到改善心功能的目的。
易甫, 吕安林, 贾国良, 贺建国, 张海滨[3]2004年在《犬缺血心肌内注射血管内皮生长因子基因的疗效》文中指出目的 :了解血管内皮生长因子 (vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)基因 ,经心肌直接注射治疗犬心肌缺血模型后新生血管和侧枝循环形成以及心功能改善情况 .方法 :取实验用犬 2 4只 ,结扎左冠状动脉前降支 (LAD)近、中段 ,模型建造成功后 ,通过直接心肌注射将hVEGF1 6 5基因转染缺血部位心肌细胞 ,应用超声检查及冠状动脉造影 (coronaryangiog raphy,CAG)进行监测 ,3mo后处死 ,组织学切片观察心肌组织中毛细血管生成情况 .结果 :术后 3mo ,CAG显示 ,治疗组新生血管数目和侧枝血管形成较对照组明显增加 ,TIMI血流也较对照组明显改善 (P <0 .0 5 ) ;超声检查显示 ,治疗组射血期及舒张早期局部心肌运动速度和二尖瓣环舒张早期平均运动速度均较对照组显着增加 ;组织学检查显示 ,治疗组心肌内毛细血管数为 (4 1± 8) /HP ,而对照组为 (9± 6 ) /HP (P <0 .0 1 ) .结论 :犬心肌缺血模型经心肌直接注射pcDNA3.1 (- ) /VEGF1 6 5 ,能促进心肌血管新生 ,加速侧枝循环建立 ,达到改善心功能的目的
周大燕[4]2010年在《喷射心肌打孔填充凝胶支架治疗犬心肌梗死》文中研究表明背景和目的:心肌打孔术(TMR)即利用激光或者机械方式在心脏缺血区制作多个与左心室腔相通的孔道,使心腔内血液注入到缺血心肌内,同时通过血管新生可以营养该区域心肌,从而改善缺血心肌灌注。激光心肌打孔术(TMLR)作为治疗顽固性心绞痛和晚期缺血性心脏病的一种辅助治疗方法,可以改善心绞痛症状,提高运动耐量,改善心肌灌注等,但是激光心肌孔道的闭塞以及激光对周围心肌组织的热损伤等限制了其应用。而针刺打孔和电钻打孔的心室壁孔道也同样面临心肌孔道闭塞的问题。针对上述血运重建方法的不足,本实验采用一种新型的心肌打孔方式-喷射心肌打孔(TMJR)。该方法可以避免激光心肌打孔对心肌组织带来的热损伤,以及避免针刺打孔和电钻打孔将直硬刚针插入搏动的心脏,而且在喷射心肌打孔的同时可以喷入具有叁维支架作用的凝胶,凝胶在一定时间内可以对心肌孔道起到支撑作用,从而可能使心肌孔道得以保留,而且可能使心肌孔道壁内皮化及血管化。本实验观察了正常犬喷射心肌打孔填充不同凝胶支架后心肌孔道的演变规律,以及不同凝胶支架的组织相容性;观察了在急性心肌梗死犬模型的心肌缺血梗死区行喷射心肌打孔填充凝胶支架,对心肌孔道的开放性、心肌血管新生、心室重构、以及血流动力学等影响。方法:1、正常活体犬喷射不同凝胶心肌打孔犬12只,随机均分为3组(n=4):①琼脂糖凝胶组(AH组),②纤维蛋白凝胶组(FG组),③壳聚糖凝胶组(CH组)。在各组用无针注射器分别喷射各种凝胶心肌打孔。3组均于术后2、4、6周取含有孔道的心肌组织行HE染色和Masson染色,观察①各种凝胶支架在心肌组织中的降解性和组织相容性;②各组心肌孔道是否保留和开放;③各组心肌孔道内及孔道周围的纤维组织增生情况。2、心肌梗死犬喷射壳聚糖凝胶心肌打孔32只犬随机均分为4组(n=8):单纯心肌梗死组(MI组)、生理盐水组(NS组)、壳聚糖凝胶组(CH组)、壳聚糖凝胶+血管生长因子组(CH+GF组)。MI组仅建立心肌梗死模型。NS组,CH组和CH+GF组建立心肌梗死模型后在心肌缺血梗死区用无针注射器进行喷射心肌打孔;NS组心肌孔道内喷射生理盐水,CH组喷射壳聚糖凝胶,CH+GF组喷射包载有生长因子(血管内皮生长因子联合碱性成纤维细胞生长因子)的壳聚糖凝胶。术后6周①测量血流动力学参数;②苏木素-伊红(HE)染色和免疫组化染色观察心肌孔道的开放性以及心肌孔道的内皮化情况;③Masson染色观察心肌孔道内及孔道周围的胶原增生情况;④免疫组化染色观察缺血心肌中血管性血友病因子(VWF)、α-平滑肌肌动蛋白(a-SMA)的表达,计算微血管、小血管以及小动脉的密度;⑤计算心肌梗死面积、左右心室重量指数;⑥计算心肌组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原容积分数及Ⅰ/Ⅲ比值。结果:1、正常活体犬喷射不同凝胶心肌打孔①琼脂糖凝胶的生物降解性和组织相容性差,引起周围组织大量胶原增生,心肌孔道完全闭塞。②纤维蛋白凝胶具有良好的生物降解性和组织相容性,但支撑度弱,其降解后心肌孔道基本闭塞。③壳聚糖凝胶具有良好的生物降解性、组织相容性及良好的支撑度,其降解后可见心肌孔道开放及心肌孔道壁内皮化,心肌孔道内及孔道周围少量纤维组织增生。2、心肌梗死犬喷射壳聚糖凝胶心肌打孔①术后6周,HE染色和免疫组化染色示:NS组心肌孔道基本闭塞,CH组和CH+GF组均可见孔道开放,而CH+GF组孔道壁内皮化更明显。②Masson染色示:NS组心肌孔道内有大量的胶原纤维填充,CH组和CH+GF组的心肌孔道有部分胶原纤维,尚有大量空腔存在。③和MI组比较,NS组、CH组和CH+GF组的小血管显着增加(P<0.05);和NS组比较,CH组和CH+GF组的小血管显着增多(P<0.05),以CH+GF组更显着;而CH+GF组的小动脉较MI组和NS组均显着增多(P<0.05)。④和MI组比较,CH组的Ⅰ型胶原容积分数显着减少(P<0.05);和MI组、NS组及CH组比较,CH+GF组的Ⅲ型胶原容积分数显着增加(P<0.05);和MI组、NS组比较,CH组及CH+GF组的Ⅰ/Ⅲ比值均显着减少(P<0.05)。⑤CH组和CH+GF组的部分血流动力学参数较MI组显着改善(P<0.05)。结论:1、喷射心肌打孔填充凝胶支架具有可行性;2、琼脂糖凝胶和纤维蛋白凝胶均不适合作为心肌打孔的孔道填充物,而喷射壳聚糖凝胶心肌打孔能使心肌孔道开放;3、喷射心肌打孔填充壳聚糖凝胶支架可使心肌梗死犬的心肌孔道开放和孔道壁内皮化、促进血管新生,改善心室重构,有利于血流动力学功能的改善。
徐爱国[5]2009年在《自体骨髓单个核细胞移植对犬心力衰竭心脏功能和血管增生的影响》文中提出背景：心衰是各种心血管疾病最终的共同转归，严重威胁着人类的健康。传统观念认为，心肌细胞坏死后不能再生，而心肌细胞不可逆转死亡是心衰发病机制中最重要的始动和加速因素之一。尽管传统药物治疗和机械装置的使用发展迅速，但心衰的入院率和病死率仍高居不下，心脏移植又因为供体缺乏而大受限制。近年来，干细胞移植技术在心血管疾病领域的应用为心衰提供了全新的治疗策略，有关利用干细胞再生修复受损心肌的研究在理论上具有诱人的前景。虽然相关基础实验及临床研究比较广泛，但研究结果存在较大争议。细胞移植后的分化问题和改善心功能的机制等问题均不明确。目的：1．快速右室起搏建立心衰模型；2．观察骨髓单个核细胞(bone marrowmononuclear cells，BM-MNCs)悬液的制备及经心肌注射的可行性；3．观察经冠脉移植BM-MNCs对心衰犬心功能的影响；4．观察标记的BM-MNCs能否在心衰心肌内存活并且分化成为心肌样细胞；5．观察BM-MNCs移植后对血管形成的影响及对血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和AKt(丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶B)mRNA表达的影响。方法：1．杂种犬16只，随机分为实验组(n=8)和对照组(n=8)两组，快速右室起搏建立犬心衰模型；2．移植组的实验犬全麻后无菌条件下于髂前／后上嵴抽取骨髓30～40ml，ficoll淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离得到BM-MNCs，CM-DiI标记待移植的BM-MNCs，用倒置相差和荧光显微镜观察细胞数目和标记效率，调整细胞浓度为3×10~7～1×10~8／ml；3．开胸，暴露心脏，向左室心肌分4～5个点注射制备好的BM-MNCs，对照组注射等量生理盐水，术后饲养观察4周；4．所有实验犬于心衰前、建立心衰模型后及移植后4周行血流动力学检查，检测右房、右室、肺动脉及肺动脉毛细血管楔压，并以热稀释法测量心排血量；5．超声心动图检查：所有实验犬于心衰前、建立心衰模型后及移植后4周行超声心动图检查，测量左室舒张末内径、左室收缩末内径、左室舒张末容积、左室收缩末容积和射血分数；6．移植后4周，氯化钾注射法处死犬，取心尖、前壁和室间隔心肌，观察CM-DiI示踪的细胞的分布，免疫荧光染色检测CM-DiI示踪的细胞是否表达心肌细胞特异性蛋白-肌钙蛋白，免疫组化染色计算毛细血管密度；7．RT-PCR检测VEGF、bFGF和AKt的mRNA表达。结果：1．BM-MNCs经CM-DiI标记后，细胞膜着色，紫外光激发呈现红色，标记效率为80％～90％；2．4周后BM-MNCs移植治疗的犬心肌组织均可见到CM-DiI标记的红色细胞，细胞移植组肌钙蛋白的免疫荧光染色均为阳性，呈现绿色荧光，与CM-DiI标记的红色荧光供体细胞进行迭加，可见肌钙蛋白染色双阳性的细胞，呈现黄色荧光；3．实验组与对照组犬心衰模型血流动力学指标差异均无统计学意义(P＞0．05)，4周后实验组较治疗前PAP、PCWP和CO明显改善，差异有统计学意义(PAP，19．86±2．34 vs．16．29±1．90，P＜0．05；PCWP，14．71±3．15 vs．12．29±1．89，P＜0．05；CO，2．66±0．47 vs．2．95±0．40，P＜0．05)。对照组较治疗前血流动力学指标差异均无统计学意义(P＞0．05)。与对照组相比，实验组干细胞移植4周后PAP和CO差异有统计学意义(PAP，16．29±1．90 vs．19．50±2．67，P＜0．05；CO，2．95±0．40 vs．2．41±0．39，P＜0．05)；4．实验组与对照组犬心衰模型各项超声心动指标差异均无统计学意义(P＞0．05)，实验组术后4周时LVEF、SV和LVPWd均较治疗前有明显改善，差异有统计学意义(LVEF，37．29±6．75 vs．42．14±2．79，P＜0．05；SV，9．43±1．90 vs．13．28±1．80，P＜0．01；LVPWd，5．54±1．02 vs．6．12±1．43，P＜0．01)。对照组较治疗前血流动力学指标差异均无统计学意义(P＞0．05)。与对照组相比，实验组干细胞移植4周后LVEF、LVESV和SV差异有统计学意义(LVESV，16．86±2．67 vs．19．83±1．83，P＜0．05；LVEF，42．14±2．79 vs．36．83±4．12，P＜0．05；SV，13．28±1．80 vs．10．17±3．06，P＜0．05)；5．经过骨髓单个核细胞移植后4周，免疫组化染色高倍镜下，实验组的血管数量明显高于对照组(vWF，7．29±2．03 vs．6．04±2．07，P=0．040；a-SMA，13．25±2．88 vs．10．95±3．63，P=0．033)；6．实验组促血管生长因子VEGF和bFGF的mRNA表达水平(2-△△CT)高于对照组，差别具有统计学意义(VEGF，1．06±0．43 vs．0．32±0．18，P=0．000；bFGF，1．25±1．09 vs．0．50±0．53，P=0．040)，Akt的表达也明显高于对照组(1．15±0．55 vs．0．67±0．16，P=0．022)。结论：1．荧光染料CM-DiI标记BM-MNCs细胞效率高，荧光在活体细胞内存在的时间大于4周，可成功示踪移植的BM-MNCs；2．CM-DiI示踪的细胞能在心衰心肌内存活并且分化成为具有心肌细胞特异性标记——肌钙蛋白的心肌样细胞；3．经心肌内注射移植自体骨髓单个核细胞可改善急性心肌梗死后心脏收缩和舒张功能；4．经心肌移植BM-MNCs可以促进血管生成，提高促血管生长因子VEGF和bFGF的mRNA表达水平，此外抗凋亡效应的Akt mRNA表达明显升高。
程明, 仲崇俊[6]2007年在《基因治疗缺血性心脏病的研究进展》文中进行了进一步梳理缺血性心脏病严重威胁着人类的健康,尤其是严重的弥漫性病变,目前临床使用的治疗方法无法取得满意的疗效,根据血管生成的机制应用促血管生成因子、基因治疗等方式进行的治疗性血管生成为此类疾病的治愈带来了希望。本文就促血管生成因子基因治疗缺血性心脏病的研究进展进行综述。
李良[7]2010年在《脂肪间充质干细胞移植治疗扩张型心肌病大鼠的研究》文中研究表明扩张型心肌病(dilated cardiomyopathy DCM)在心肌病中最为常见,常发展为充血性心力衰竭,预后很差,心脏病学家们一直在寻找新的治疗方法,干细胞移植是一个切实可行的增加成体心肌细胞的方法。脂肪间充质干细胞(adipose tissue-derived mesenchymal stem cells,ADMSCs)具有多种分化潜能,将其植入损伤的心肌后,能够在损伤区存活、增殖、并分化为心肌细胞,改善心功能。ADMSCs移植在缺血性心脏病中的临床应用已经初见曙光,但是在扩张型心肌病等充血性心脏病方面尚属空白。本研究为临床应用ADMSCs移植治疗扩张性心肌病提供实验与理论依据。目的：(一)经腹腔注射阿霉素建立Wistar大鼠扩张型心肌病模型。(二)从Wistar大鼠脂肪组织大量分离、培养ADMSCs,证明ADMSCs在5-氮杂胞苷(5-aza)诱导下可分化为心肌细胞,确定其是否可以作为一个合适的工具细胞,为后续研究做准备。(叁)将同种异体ADMSCs移植入DCM大鼠心肌内,观察ADMSCs在心肌内的存活及分化情况,比较移植前后心功能及血流动力学的变化。内容和方法：1.提取大鼠脂肪组织,体外分离培养脂肪间充质干细胞ADMSCs,行细胞免疫组化检测免疫表型。分析其表面CD13,CD34,CD44,CD45,CD105.2.研究Wistar大鼠扩张型心肌病模型建立的方法；参考国外学者的方法,并经改良,通过大鼠腹腔注射一定剂量的阿霉素这种非手术方法建立慢性充血性心衰的DCM动物模型。最后通过心功能及病理切片检测模型。3.将体外分离培养的ADMSCS移植入治疗组DCM大鼠,同时将以相同体积的IMEM培养基移植入对照组DCM大鼠。术后4周,处死动物留取心脏,于荧光显微镜下观察ADMSCS植入后存活及分化情况。于细胞移植术前、术后4周,将两组大鼠进行超声心动、血流动力学检查,测定、比较心功能的指标。结果：1.在制模过程中除死亡鼠外,所有大鼠均出现不同程度体重增长缓慢或体重下降、脱毛、精神萎靡,个别大鼠出现眼角糜烂。随机抽取5只大鼠处死,解剖心脏进行病理学检查。大体观察心脏呈球形,室壁薄、心腔大。光镜下观察病理切片见心肌纤维肥大,胞腔内空泡形成,纤维组织增多,局部心肌细胞溶解等现象。比较心功能指标提示,造模后2周所有存活的大鼠均出现LVEDV及LVESV升高、左心室EF下降等心功能下降表现。2.从Wistar大鼠脂肪组织分离培养出大量螺旋生长的长梭形细胞,多次传代后,细胞呈均匀有序的向四周放射状分布,细胞排列呈放射状,多数细胞为长梭形。这些细胞的细胞表面分子CD13、CD44、CD105皆阳性,CD34、CD45、Ⅷ因子、HLA-DR、VWF均阴性；具有成骨、成脂、成肌的多向分化能力。可以在体外连续传代培养而保持稳定的生长速度,第3至8代细胞倍增时间为55至63小时；经2至4周液氮冷冻保存后复苏存活率90%以上,细胞表面阳性标志保持不变；3.移植术后4周,于移植部位可见DAP I标记的ADMSCs,同时,免疫组织荧光染色发现部分DAP I阳性细胞,TnT染色也为阳性,且排列方向与心肌细胞一致。移植术后4周,对照组与ADMSCS治疗组比较,左心室舒张末容积(LVEDV)及左心室收缩末容积(LVESV)减少(P<0.01),左心室每搏量(SV)、心脏射血分数(EF)、左心室收缩压(LVSP)、左心室室内压最大上升／下降速率(±dp／dtmax)均明显增加(P<0.05～0.01)。结论：1.本实验的结果表明,阿霉素作用于Wistar大鼠后,大体心脏观察左心腔呈球形扩大,超声心动检查室壁收缩动度减弱,心室壁变薄,射血功能受损,说明DCM模型建立成功。2.通过胰酶消化的方法成功地从Wistar大鼠脂肪组织分离培养出具有多向分化潜能的ADMSCs。分离的ADMSCs具有旁分泌功能,易于在体外长期传代培养、大量扩增、长期冻存。这些特征证明了ADMSCs作为细胞和基因工程备选种子细胞的基础,也为ADMSCs进一步的实验研究提供了一个理想的工具细胞。3. ADMSCs移植术后4周,治疗组LVESP、左心室室内压(+dp/dtmax)、左心室室内压(-dp/dtmax)、左心室EF(%)均较对照组明显升高；而LVEDP、LVEDV及LVESV均较对照组明显降低,说明ADMSCs移植入DCM大鼠心肌后,可使心脏收缩功能及舒张功能均得到明显改善,可抑制DCM的心室扩张性重构,进一步为临床上应用ADMSCs移植治疗DCM等非缺血性HF提供了实验依据。
李小卫[8]2002年在《超声介导载血管新生抑制基因反义核酸靶向促心肌血管新生的实验研究》文中认为冠心病基因治疗，即直接刺激心肌血管新生(angiogenesis)，刺激缺血区心肌小血管生长和侧支循环形成，即缺血区心肌“自我搭桥”。动物实验和临床研究已经证明：VEGF等血管生长因子，可以促进缺血区血管新生而改善心肌供血。在实验中人们发现：静脉注射途径简便，但载体用量大，缺乏靶向性，并可引起机体其它组织器官副效应。经冠状动脉内注射或心肌内直接注射，定位性好，却增加了治疗难度及手术创伤。因此，建立安全、有效、无创的基因治疗靶向传输系统，成为冠心病基因治疗研究的热点问题之一。超声照射以其特有的无创性及定位超声照射所导致的经静脉载药微泡在靶组织的释放，可产生生物学效应等特点，超声照射及微泡已被使用在冠心病基因治疗靶向传输系统的基础研究中。为了解超声介导脂质体微泡靶向传输系统，了解超声能量破坏微泡导致药物在体内的定向释放，建立经静脉主动靶向给药途径，推广声学造影剂的应用，推动超声影像治疗学发展：同时了解血管新生抑制基因一TSP-1 Ⅰ重复序列，TSP-1Ⅰ型重复序列反义RNA对大鼠缺血心肌新血管生成影响，我们进行了超声介导载血管抑制基因反义核酸对心肌新血管生成影响的实验研究。 方法与结果 1、构建pcDNA3.1+／TSP-1-Ⅰ、pcDNA3.1-／anti-TSP-1-Ⅰ，经双酶切，测序及Western blot签定后，转染ECV304细胞。MTT法检测转染前后ECV304细胞活性改变及转染后ECV304细胞培养上清液对ECV304细胞生长的影响，流式细胞仪检测转染前后ECV304细胞周期变化。透射电镜观察转染前后ECF304细胞形态学改变。结果：pcDNA3.1+／TSP-1-Ⅰ转染ECV304细胞后，MTT法检测所得OD值较未转染组和pcDNA3.1-空载体转染组减低(P=0.03和P=0.023)；pcDNA3.1+／TSP-1-Ⅰ转染ECV304细胞后，细胞培养上清液作用ECV304细胞48hMTT法检测所得的OD值也较未转染组和pcDNA3.1-空载体转染组减低(P=0.004和P=O.016，并且随着浓度的增加，其OD值逐渐减低。流式细胞仪检测结果显示：pcDNA3.1+／TSP-1-Ⅰ转染ECV304细胞后，其S+G2(％)较未转染组和PCDNA3．卜空载体转染组缩短0－0．03和 P－0．01人透射电镜结果显示：PCDNA3．1＋／TSP1二转染后的ECV304细胞可见染色质凝聚、核碎片及凋亡小体形成。pCDNA3．l／an1SP＊ 转染ECV304细胞后，MTT法检测所得OD值较未转染组、pCDNA3．卜空载体转染组和pCDNA3．l＋rySPll转染组升高（P－0＊02尸二0＊02和 P＜0＊of）；pCDNA3．l／an－TSP－11转染ECV304细胞后细胞培养上清液作用ECV304细胞48h后的MTT法检测所得的OD 值也较未转染组、pCDNA3．卜空载体转染组和p＊＊＊．1＋厅＊－卜1转染组升高（＊＜0＊01，P＜0．001和k0＊01）：流式细胞仪检测结果显示：pCDNA3．l灿ti1SP4 转染ECV304细胞后S＋GZ （％）较末转染组、pCDNA3．卜空载体转染组和pCDNA3．1＋／TSP刁 转染组附＊2（％）延长（卜0．001尸二0刀02和P＜0刀01）；透射电镜结果显示：PCDNA3．1－／8llli1SP上 转染后ECV304细胞核仁相对增多。 2、进行了脂质体、脂质体微泡制备、脂质体微泡鉴定及超声介导脂质体微泡携带LacZ基因转染ECV304细胞，通过p－Gal染色检测转染效率，p－Gal鉴定检测表达水平，了解超声照射及脂质体微泡在LacZ基因转染中的作用。结果：成功制备脂质体微泡，直径＜5pm占95，84％，浓度5．SX10’个／W，心肌显影效果佳，显影时间约7分钟；超声介导脂质体微泡携带LacZ基因转染ECV304细胞后的p－Gal染色结果：超声照射＋脂质体微泡＋LacZ基因组转染率高于超声照射＋脂质体＋LacZ基因组、脂质体微泡＋LacZ基因组和脂质体＋LacZ基因组（Pwto刀5、Prto刀5、Pt 0．05，p－Gal鉴定结果与卜－Gal染色结果相似；透射电镜显示：LacZ基因是粘附在脂质体微泡的表面。 3、制备大鼠心肌梗死模型，通过心肌内直接注射和经周围静脉注射脂质体微泡＋PCDNA3．＊ 或pCDNA3豆十／TSP－11 或pCDNA3．工／anti－TSPll，经周围静脉注射途径再加以心脏超声照射，叁周后处死大鼠。RTPCR检测 TSP－11型重复序列 InRNA水平，Western blot检测TSP－11型重复序列多肽水平，免疫组化检测梗死心肌微血管CD31表达。结果：RTPCR检测结果显示：pCDNA3．l＋／TSPl 经周围静脉注组TSPl二型重复序列条带明显强于心肌内注射组；pCDNA3，l／fllltiTSP＊＊经周围静脉注射组TSP－l型重复序列条带略弱于心肌内注射组；Westernblot检测结果与RT干CR检测结果相似。免疫组化结果显示：周围静脉注 ．2．射组心肌纤维排列较心肌内注射组整齐；周围静脉注射组中的PCDNA3．l刊TSP＊J 转染组微血管数少于心肌内注射组，PCDNA3．l／dlltl1SPl 转染组微血管数多于心肌内注射组。 结论： l、成功构建pCDNA3．l十／TSP且1、pCDNA3．l／an－TSP－11。作为血管新生抑制基因，在体外，TSP－二互型重复序列基因编码的TSP－且互型重复序列多肽，能够抑制ECV304细胞生长和增殖，其抑制机制与TSPll型重复序列诱导ECV304细胞凋亡相关。TSP－1
李海嵘[9]2010年在《自体骨髓单个核细胞移植快速右室起搏诱导心力衰竭犬心脏功能变化》文中进行了进一步梳理背景：心力衰竭是各种严重心脏疾病终末阶段所表现出来的一种临床综合征,其病情复杂,预后不良,病死率和病残率极高。近年的研究发现,骨髓单个核细胞(BM-MNCs)移植作为一种新兴的治疗手段,可修复损伤的心肌,改善心力衰竭心脏的整体功能。虽然相关基础实验及临床研究比较广泛,但研究结果存在较大争议。细胞移植后的分化问题和改善心脏功能的机制等问题均不明确。目的：1.快速心室起搏建立心力衰竭模型；2.观察BM-MNCs悬液的制备及经心肌注射的可行性；3.观察经心肌移植BM-MNCs对心力衰竭犬心脏功能的影响；4.观察标记的BM-MNCs能否在心力衰竭心肌内存活并且分化成为心肌样细胞；5.观察BM-MNCs移植后对心肌细胞及间质纤维化的影响。方法：1.杂种犬13只,随机分为实验组(n=7)和对照组(n=6)两组,快速右室起搏建立犬心力衰竭模型；2.实验组的实验犬全麻后无菌条件下于髂前／后上嵴抽取骨髓30-40ml,ficoll淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离得BM-MNCs, CM-Dil标记待移植的BM-MNCs,用倒置相差和荧光显微镜观察细胞数目和标记效率,调整细胞浓度为3×107～1×108／ml；3.开胸,暴露心脏,向左室心肌分4-6个点注射制备好的BM-MNCs,对照组注射等量生理盐水,术后饲养观察4周；4.超声心动图检查：所有实验犬于心力衰竭前、建立心力衰竭模型后及移植后4周行超声心动图检查,测量左室舒张末内径、左室收缩末内径、左室舒张末容积、左室收缩末容积、射血分数；5.4周后取材,取心尖、前壁和室间隔心肌,FITC标记心肌肌钙蛋白,观察心肌纤维化程度,测定心肌胶原容积分数。结果：1.BM-MNCs经CM-Dil标记后,细胞膜着色,紫外光激发呈现红色,标记效率为80%～90%；2.4周后BM-MNCs移植治疗的犬心肌组织均可见到CM-Dil标记的红色细胞,细胞实验组肌钙蛋白的免疫荧光染色均为阳性,呈现绿色荧光,与CM-Dil标记的红色荧光供体细胞进行迭加,可见肌钙蛋白染色双阳性的细胞,呈现黄色荧光；3.实验组与对照组各项超声心动指标差异均无统计学意义(P>0.05),实验组移植4周时射血分数(EF)较移植前有改善(37.29±6.75%vs 42.14±2.79%,P<0.05),差异有统计学意义；对照组注射后4周时EF较注射前无明显差异(36.17±5.34%vs 36.83±4.12%,P>0.05),对照组较治疗前血流动力学指标差异均无统计学意义(P>0.05)；4.实验组移植后4周时心尖、前壁和室间隔心肌胶原容积分数(CVF)较对照组减低,差异有统计学意义(2±0.1%vs 6±0.5%；2.7±0.3%vs 5.7±0.3%：1.8±0.5%vs 4.5±0.6%,P<0.05)。结论：1.荧光染料CM-Dil标记BM-MNCs细胞效率高,荧光在活体细胞内存在的时间大于4周,可成功示踪移植的BM-MNCs;2. CM-Di示踪的细胞能在心力衰竭心肌内存活并且分化成为具有心肌细胞特异性标记—肌钙蛋白的心肌样细胞；3.经心肌内注射移植自体BM-MNCs可改善心力衰竭后心脏收缩和舒张功能;4.BM-MNCs移植对心力衰竭心肌纤维化有一定的抑制作用。
田宇[10]2019年在《VEGF单基因治疗大鼠脑缺血的效果》文中进行了进一步梳理目的:探讨血管内皮生长因子(VEGF)单基因治疗大鼠脑缺血的效果。方法:选择健康成年雄性Wistar大鼠60只,随机分为基因治疗组,空白载体对照组和对照组,每组20只,所有大鼠均建立局灶性脑缺血再灌注模型,基因治疗组给予注射携带治疗基因hVEGF165的Ⅰ型重组腺相关病毒载体(rAAV1-VEGF),空白载体组给予注射rAAV1-null,对照组给予注射生理盐水,检测脑脊液和脑组织VEGF水平,测定各组大鼠颅内压、脑组织含水量和水肿脑体积,并观察各组微血管密度。结果:缺血再灌注后24h,与对照组和空白载体对照组比较,基因治疗组脑脊液和脑组织VEGF水平[脑脊液:(0.64±0.11) pg/ml、(0.63±0.12) pg/ml比(73.10±9.70) pg/ml,脑组织[(6.81±1.33) pg/ml、(6.64±1.30) pg/ml比(578.20±78.36) pg/ml]显着升高,颅内压[(14.10±1.63) mmHg、(14.62±1.57) mmHg比(25.81±2.05) mmHg]、脑水含量[(79.02±1.04))%、(79.81±1.10)%比(85.82±1.02)%]、水肿脑体积[(170.04±13.02) mm~3、(173.13±14.20) mm~3比(404.22±20.15) mm~3]和脑微血管密度[(106025.17±13320.11) m~2/mm~2、(106103.11±14022.57) m~2/mm~2比(140331.21±13892.05) m~2/mm~2]均显着增加(P均=0.001)。结论:通过载体rAAV1-VEGF给予治疗可使大鼠脑内VEGF水平增加,并促进脑内微血管增殖,但同时会诱发缺血半球脑水含量增加,水肿脑体积增大,引起颅内压升高。
参考文献：
[1]. 血管内皮生长因子基因经心肌直接注射治疗犬心肌缺血模型的疗效观察[C]. 易甫, 吕安林, 贾国良, 贺建国, 张海滨. 中华医学会心血管病分会第八次全国心血管病学术会议汇编. 2004
[2]. 血管内皮生长因子基因经心肌直接注射治疗犬心肌缺血模型的疗效观察[D]. 易甫. 中国人民解放军第四军医大学. 2003
[3]. 犬缺血心肌内注射血管内皮生长因子基因的疗效[J]. 易甫, 吕安林, 贾国良, 贺建国, 张海滨. 第四军医大学学报. 2004
[4]. 喷射心肌打孔填充凝胶支架治疗犬心肌梗死[D]. 周大燕. 重庆医科大学. 2010
[5]. 自体骨髓单个核细胞移植对犬心力衰竭心脏功能和血管增生的影响[D]. 徐爱国. 天津医科大学. 2009
[6]. 基因治疗缺血性心脏病的研究进展[J]. 程明, 仲崇俊. 中国动脉硬化杂志. 2007
[7]. 脂肪间充质干细胞移植治疗扩张型心肌病大鼠的研究[D]. 李良. 中国人民解放军军医进修学院. 2010
[8]. 超声介导载血管新生抑制基因反义核酸靶向促心肌血管新生的实验研究[D]. 李小卫. 第一军医大学. 2002
[9]. 自体骨髓单个核细胞移植快速右室起搏诱导心力衰竭犬心脏功能变化[D]. 李海嵘. 天津医科大学. 2010
[10]. VEGF单基因治疗大鼠脑缺血的效果[J]. 田宇. 心血管康复医学杂志. 2019