脂肪酶催化拆分N取代苯基α氨基丙酸的研究

郑良玉^[1]2004年在《脂肪酶催化拆分N取代苯基α氨基丙酸的研究》文中研究表明手性N取代苯基α氨基丙酸是一类重要的手性合成中间体, 特别是在农药领域, 是很多手性农药的关键中间体。目前对于旋光纯N取代苯基α氨基丙酸的合成，主要采用化学拆分方法，但化学拆分方法存在很多缺点。本论文选择脂肪酶作为催化剂，通过立体选择性酯水解反应成功的拆分了N取代苯基α氨基丙酸，确定了最佳拆分条件，研究了酶的固定化修饰和不同类型添加剂对酶催化活性和立体选择性的影响，从分子水平上解释了酶催化立体选择性水解机制，并对光学纯N取代苯基α氨基丙酸进行了应用基础方面的研究。一．N取代苯基α氨基丙酸的毛细管电泳分离采用高效毛细管区带电泳法，以环糊精作为手性选择剂，对外消旋模型化合物2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸(NEMPA)的两个对映体进行了手性分离，比较了环糊精种类、环糊精浓度、电解质溶液pH值、温度和电场强度对分离的影响。实验结果表明，本文采用DM-β-CD作为手性选择剂，不需要处理毛细管柱，就可以使对映体得到较好分离，经筛选确定的最佳实验条件为：DM-β-CD浓度为40 mmol/L，叁乙胺/乙酸缓冲溶液浓度为100 mmol/L，溶液pH =5.5，反向电场强度为340 V/cm，电泳温度 20℃，样品浓度50 mg/L，紫外检测器200 nm，对映体达基线分离，建立了利用毛细管电泳检测NEMPA对映体过量值的新方法，该方法也适用于其它的N取代苯基α氨基丙酸对映体过量值的检测。二．脂肪酶催化拆分N取代苯基α氨基丙酸的研究以NEMPA作为模型化合物，研究了在温和条件下，通过脂肪酶的立体选择性酯水解反应来制备光学活性N取代苯基α氨基丙酸的可行性。首先从不同来源的脂肪酶中，筛选出三种具有反应优势的脂肪酶：分别为南极假丝酵母脂肪酶（CAL-B）、假单胞菌脂肪酶（PSL）和枯草杆菌脂肪酶（BSL2）。进一步研究了脂肪酶的微环境对其催化拆分的影响，并对叁种脂肪酶进行比较。研究结果表明，微环境对所选择的叁种脂肪酶的催化活活性和立体选择性影响在某些方面具有相似性，主要表现在以下方面：反应温度较低时，脂肪酶的活性和立体选择性较高，温度高时，则有所下降；叁种脂肪酶在偏碱性条件下，酶活力和立体选择性均有不同程度下降，但反应速度有所提高；PSL 和BSL2催化活性和立体选择性和烷基酯的链长和类型密切相关；从酶催化拆分的动力学曲线可以看出，我们选取的叁种脂肪酶均没有表现出界面激活和底物抑制现象，完全受动力学控制。叁．改善脂肪酶立体选择性及催化活性的研究分别研究了体系中添加的有机溶剂、表面活性剂、大环多胺和离子液体对脂肪酶CAL-B和BSL2催化活性和立体选择性的影响，并分别对这四种添加剂的不同影响结果给出合理的解释。有机溶剂对CAL-B和BSL2的催化活性和立体选择性的影响，存在很大程度的相似性，反应体系中加入有机溶剂后，两种酶的催化活性均有不同程度的降低，可以提高立体选择性的有机溶剂（分别为乙醚和异丙醚）都属于醚类。所选择的叁种表面活性剂中，Tween-80对CAL-B和BSL2的立体选择性均有提高的作用，但对酶的催化活性影响不同，它可以提高CAL-B的活性，而降低BSL2的催化活性。带有亲酯性长链的大环多胺可以显着提高酶的催化活性和立体选择性，尽管带有亲酯性长链的大环多胺可以促进更多的底物分子与酶活性部位相互作用，但链长达一定程度后，可能由于大环多胺较长的亲酯链阻碍了酶对底物分子空间上的识别，立体选择性降低。和纯水相体系相比，在反应体系中加入离子液体后，提高了CAL-B的立体选择性(E=44.7), 大约是纯水体系的4倍(E=10.6), 低于在乙醚-水两相体系中的立体选择性（E=117.8）。但离子液体可以解决传统有机溶剂的乳化问题, 同时产物溶于水相, 与存在于离子液体相的酯分开, 有利于产品的回收，还可以循环利用。四．脂肪酶固定化的研究从四种经过不同修饰的中孔分子筛中筛选出只经过煅烧的分子筛SBA-15作为脂肪酶PSL的固定化载体，最佳固定化条件为：缓冲液离子强度为25mmol/L，pH 8.0，酶和分子筛的比例为1：15，温度为4℃，固定化时间为2小时。偶联率为69.2%, 活力回收为59.9%。结果显示，脂肪酶经固定化后具有较好的活性（固定化酶的比活高于游离酶1.2倍）和稳定性（可重复使用8次以上）。在反应体系中添加15%乙醚和40mg/mlCTAB后，固定化酶活性可分别提高到1.1倍和1.32倍，固定化酶在有机溶剂中的稳定性高于游离酶，在表面活性剂中稳定性略低于游离酶。初步确定了固定化机制是酶分子首先进入分子筛SBA-15的孔洞中，然后和分子筛的内表面的活性基相互作用。五．脂肪酶催化拆分N取代苯基α氨基丙酸的理论研究采用半经验量子化学方法，优化了R型和S型2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸甲酯(NEMPAME)分子的空间构型，得到了稳定的几何构型；以脂肪酶PSL 、CAL-B活性中心的晶体结构为基础，与优化的NEMPAME分子几何构型构建了NEMPAME与酶反应的四面体过渡态，在酶的活性腔中优化底物分子的过渡态，获得的最稳定构型存在差异，反应在生成热上。在PSL与NEMPAME作用时，R构型的过渡态要比S构型的过渡态稳定，说明PSL对NEMPAME具有手性选择性，催化R构型酯的水解

刘卫德, 蒋细良, 范亮波, 冀颖, 牛静^[2]2011年在《生物催化在农药合成中的应用》文中提出对现有农药进行结构修饰及制备光学纯的手性农药是当前农药研究开发的重要内容,其中常涉及很多高选择性反应步骤,采用传统化学方法往往操作复杂、成本高并可能造成环境污染。生物催化具有反应条件温和、高效、高选择性及低污染等优点,成为化学催化的重要补充。近年来,生物催化在农药合成中的应用日益受到关注。介绍了生物催化在农药分子的选择性结构修饰及手性农药去消旋化等方面的研究及应用情况。

佚名^[3]2002年在《分类题目索引》文中提出一　有机合成化学1,1′ 联 2 萘酚在不对称催化中的应用新进展李小永 ,聂进 (840 )…………………………………………………………………1,2 联烯亚砜和 1,2 联烯砜的反应魏琦 ,麻生明 (2 5 4)……………………………………

刘卫德^[4]2011年在《阿维菌素4"-OH氧化酶CYP107Z13的基因克隆、表达及功能验证》文中提出阿维菌素是一种结构新颖、农畜两用的重要生物源杀虫剂,对阿维菌素4"-OH进行改造可以获得药效更高、杀虫谱更广的甲胺基阿维菌素苯甲酸盐(甲维盐)。当前,甲维盐的生产是以天然发酵产物阿维菌素为前体,通过化学方法合成,其中最关键的反应步骤是将阿维菌素4"-OH氧化为4"-O。由于在对阿维菌素4"-OH氧化前后必须对分子中更加活跃的5-OH进行保护和去保护,且这个保护-去保护过程操作复杂、条件要求苛刻,导致了甲维盐合成成本较高且对环境污染严重。寻求廉价、高效、环保的生物催化剂,实现对阿维菌素4"-OH的位点特异性氧化,将大大简化甲维盐的合成步骤,有利于甲维盐的推广应用。据报道,一些链霉菌具有位点特异性氧化阿维菌素生成4"-O-阿维菌素的功能。笔者针对链霉菌进行筛选,获得一株能够高效氧化阿维菌素4"-OH生成4"-O的不吸水链霉菌菌株ZB01 (Streptomyces ahygroscopicus ZB01, CGMCC NO.2804),该菌株在72 h内对初始浓度为1 g/L的阿维菌素转化率达36%,是已报道的转化效率最高菌株的两倍多,具有较大的开发应用潜力。本研究以S. ahygroscopicus ZB01为出发菌株,展开了一系列的研究。结果如下:1.利用同源克隆及染色体步移的方法,从S. ahygroscopicus ZB01菌株基因组中克隆到一条cyp107z亚家族基因的同源基因,其全长1290 bp,共编码429个氨基酸残基,经国际P450命名委员会命名为cyp107z13,是cyp107z基因亚家族的第13个新成员。2.利用多拷贝型大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒pKC1139,建立了组成型启动子ermE*P调控下的cyp107z13链霉菌表达载体,采用原生质体转化法将重组质粒转入变铅青链霉菌TK54 (Streptomyces lividians TK54)中,经CO光谱分析和HPLC检测,证实cyp107z13基因在S. lividians TK54中成功表达,并且表达的CYP107Z13能利用S. lividans TK54的电子传递系统实现电子传递,完成位点特异性氧化阿维菌素4"-OH生成4"-O-阿维菌素的反应。3.对上述S. lividians TK54重组菌的转化条件进行优化,结果显示,培养基种类、pH值和菌体的活力状态对重组菌转化阿维菌素的效率有不同程度的影响。其中pH 6.0、改良ISP-2液体培养基以及活化细胞有利于提高重组菌转化阿维菌素的效率。4.利用pET28a载体,构建cyp107z13的重组质粒pET-z13,将pET-z13转入Escherichia coli BL21(DE3)中,经ELISA及CO差光谱法检测,证实CYP107Z13已在E. coli BL21(DE3)中成功表达,并采用Ni-柱亲和层析法纯化了带His_6标签的活性CYP107Z13重组蛋白。5.利用纯化的CYP107Z13重组蛋白,与铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶构建体外重组酶催化体系,通过测定体系中NADPH的消耗,获得了该重组蛋白以阿维菌素为底物时的酶学参数,其K_m值为1.4μM,V_(max)为0.041μmol/min·mg,kcat为0.033 s~(-1)。

参考文献：

[1]. 脂肪酶催化拆分N取代苯基α氨基丙酸的研究[D]. 郑良玉. 吉林大学. 2004

[2]. 生物催化在农药合成中的应用[J]. 刘卫德, 蒋细良, 范亮波, 冀颖, 牛静. 农药. 2011

[3]. 分类题目索引[J]. 佚名. 有机化学. 2002

[4]. 阿维菌素4"-OH氧化酶CYP107Z13的基因克隆、表达及功能验证[D]. 刘卫德. 中国农业科学院. 2011

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