李巧丽[1]2004年在《烟草花叶病毒载体及其在植物中表达外源多肽的研究》文中研究指明烟草花叶病毒( tobacco mosaic virus, TMV )属烟草花叶病毒属(Tobamovirus),是单组分带有帽子结构的正义单链RNA病毒,基因组全长6395bp。病毒基因组RNA被病毒外壳蛋白(coat protein, CP)包装成一类长300nm,直径15nm的杆状病毒粒子。在TMV植物表达载体的研究中,通常将较短的外源多肽序列插入TMV CP中Ser154的下游。在外源肽于CP羧端融合表达又不影响融合CP包装的前提下,基因组RNA能够在宿主植株内被融合CP包装成杆状的病毒粒子并高效地复制,大量表达含有外源肽的融合CP。本文主要对插入CP的外源肽的长度、序列特征及其它因素与病毒融合CP的表达、病毒粒子的感染性、形态和稳定性之间的关系进行研究,并以此提高利用TMV载体表达各种外源多肽的能力。在对重组病毒载体融合表达外源肽的研究中,我们观察到含有半胱氨酸(cysteine)的外源肽F18和F26等致使重组病毒发生了一系列变化。在携带外源肽F18和F26的重组病毒TMVF18TAA和TMVF26TGA感染的烟草植株中除分别检测到与病毒相应的融合CP蛋白亚基外,还都检测到能与CP抗体专一反应的大分子蛋白—hCP(high molecular weight CP-specific protein),并且在新生叶中产生了一类具有不规则形态的重组病毒粒子。一系列半胱氨酸替换证明外源肽中的半胱氨酸致使重组病毒发生了上述变化。因此我们在融合于TMV CP中外源肽的序列特征、大分子蛋白hCP的产生和重组病毒粒子形态叁者之间建立了相关性。而且,外源肽中的半胱氨酸同时影响重组病毒的侵染性和外源肽在重组病毒中的表达效率,其中外源肽中不含有半胱氨酸的重组病毒(TMVF18CYTAA和TMVF18CGTAA)的融合CP亚基的表达量最高。在TMV病毒载体的研究工作中,表达了来源于不同动物病毒的多种抗原决定多肽,如口蹄疫病毒(FMDV)和SARS冠状病毒等。由于受TMV基因组长度及其保守结构的限制,外源序列的表达受诸多因素的制约。这些因素包括如融合CP的等电点
江陆斌[2]2003年在《以烟草花叶病毒为载体在植物中表达外源多肽的研究》文中研究指明烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus, TMV)属烟草花叶病毒属(Tobamovirus),其基因组是带有帽子结构的正义单链RNA,全长6395bp。TMV的一个亚基因组RNA编码了病毒的外壳蛋白(coat protein, CP),在TMV系统感染烟草后,其表达量可达被感染烟草总蛋白的7%。通常,将较短的外源多肽序列插入TMV CP中Gly155的下游,重组病毒仍然能够在宿主植株内被融合CP包装并高效地复制。本文实验工作主要集中在TMV基因组序列、CP中外源小肽的长度和序列特征以及病毒粒子的形成和构象之间的关系等方面的研究,并以此提高利用TMV载体表达外源多肽的能力。在对携带FMDV抗原20肽的重组病毒TMVF20进行亚硝酸钠诱变分析的实验基础上,我们以缺失了TMV CP羧端4个氨基酸(G-P-A-T)的重组TMV为载体,成功地获得了两个感染强度较高的重组病毒TMVF20TAG和TMVF25TAG(分别表达外源20和25肽)。同时,我们以FMDV抗原11肽为外源插入肽,把外源小肽在TMV CP中的融合位点分别移至W152和T153的下游,并对CP的羧端序列做了不同程度的缺失,这些重组病毒的对烟草的感染活性、病毒后代的稳定性及融合CP的表达情况(2-4毫克/克新鲜烟草)都接近野生型TMV;并且,用这些重组病毒粒子制备的疫苗在豚鼠和猪的动物实验中亦表现出了对FMDV的良好的免疫效率。这些结果说明缺失TMV CP羧端的部分序列(T-S-G-P-A-T)不仅不会影响重组病毒粒子的包装、感染效率及其在疫苗生产领域的应用,而且有助于重组病毒载体携带表达更长的外源肽。在对携带FMDV抗原28肽的重组病毒TMVF28TGA的研究中,我们观察到外源肽中由于半胱氨酸(Cys)的存在致使重组病毒基因组发生了一系列突变,并且产生了一类具有不规则构象的重组病毒粒子(TMVF18TAA)。上述突变现象随着TMVF28TGA外源肽中的Cys被替换为其他氨基酸(如Tyr)而消失。这些结果暗示,外源肽中的某些序列特征(如含有Cys),可能会严重影响融合CP的完整表达乃至重组病毒
耿学军[3]2005年在《bpti基因的克隆及其在烟草中的表达》文中进行了进一步梳理为实现bpti 基因在烟草中的表达,本研究首先克隆了bpti 基因并重组构建了植物双元表达载体pBI121-bpti,通过冻融法将其转入根癌农杆菌EHA105,用根癌农杆菌介导的叶盘法将目的基因导入烟草植株,卡那霉素为筛选选择压,获得了卡那霉素抗性的再生烟草植株,PCR 扩增检测目的基因并结合酶分析法、SDS-PAGE 电泳,证明bpti 基因已整合到烟草基因组中并得以表达,SDS-PAGE 电泳显示样品相对分子量约为6.5kDa,与BPTI 标准品相对分子量吻合,证明基因在烟草中正确表达。
董小卫[4]2010年在《利用木霉和RNAi技术提高烟草抗性和品质的研究》文中提出病毒病是全世界烟草栽培区发生普遍,危害严重的一大类病害。目前分布广、危害严重的有烟草普通花叶病毒(TMV)、马铃薯Y病毒(PVY)和烟草黄瓜花叶病毒(CMV)等。防治病毒病的措施主要有几个方面,其中培育抗病品种和施用抗病药剂最为直接有效。本文从这两个方面入手开展研究工作:一是研究木霉这种生防真菌对烟草抗病毒的作用及施用方法;二是通过RNAi技术获得抗病毒的RNAi烟。通过研究发现:木霉孢子和康宁霉素分别与烟草花叶病毒混合后,能够引起病毒颗粒断裂、凝聚,极显着降低了病毒的侵染能力,钝化防效分别为85.81%和56.11%。木霉孢子与TMV混合后接种NC89,病毒RNA含量明显低于对照,仅为对照的2.05%,病情指数较对照极显着降低,说明木霉孢子能够体外钝化TMV,并且能够抑制病毒RNA在烟株内的积累。烟草NC89接种病毒6小时后,分别施用木霉孢子悬浮液和康宁霉素,48小时后研磨汁液接种枯斑叁生烟苗,治疗防效分别为97.98%和70.26%,病情指数显着低于对照处理,病毒含量也明显降低,可见木霉及其产物对病毒病具有治疗效果,能够抑制病毒在植物体内的复制和积累,对于防治病毒的二次扩展十分重要。木霉孢子和康宁霉素均可诱导烟草产生抗性,抗性基因得到激活,防御酶活性增强,特别是在接种病毒后,防御酶活性进一步增强,这有利于对抗病毒,抑制病毒RNA复制,降低危害,MDA含量减少,最大叶长、宽极显着提高,病情指数明显降低,诱导防效分别为55.46%和57.68%。康宁霉素作为木霉产peptaibols,具有木霉孢子的部分功能,且诱导浓度较低。木霉孢子的盆栽和大田实验表明,浇灌木霉孢子后施用木霉专用肥处理烟叶外观质量好、化学成分相对协调、评吸质量优于其他处理,加之该处理烟叶病害显着降低、产量高、产值高,具有较高的推广应用价值。从GenBank下载TMV、CMV的不同株系的移动蛋白氨基酸序列,PVY polyprotein酶氨基酸序列,运用DNAMAN进行对比分析,挑选高度重合序列,确定其编码碱基序列,经人工合成构建含有酶切位点的联合基因片段CTP,经过酶切得CTP、CT、CP、TP、C、T、P等7个片段。从GenBank下载TMV、CMV的不同株系的复制酶氨基酸序列,经对比分析确定其编码碱基序列后人工合成构建含有酶切位点的联合基因片段CrTr,经过酶切得CrTr、Cr、Tr 3个片段。将得到的10个片段分别插入RNAi-pUC中,再用双酶切反向连接至干涉载体,用PstⅠ酶切载体,回收片段,脱磷后,插入表达载体pUCC2300-35-ocs中,转化感受态农杆菌,获得富集质粒的农杆菌,经酶切验证,获得含hpDNA的农杆菌。用含有hpDNA的农杆菌感染事先准备好的无菌烟草叶片碎片中,MS培养基培养,待长出根系后,即初步得到RNAi烟苗,通过接毒实验、RT-PCR等手段检测其抗病性,得到抗病毒烟苗11株;通过Southern blot挑选单拷贝、高抗性RNAi烟苗2株进行单倍体育种,快速得到的双倍纯合转基因RNAi烟苗,烟苗抗病毒特性得到保留--能够同时抵抗叁种病毒入侵,且化学成分与普通烟草基本一致。
高书颖[5]2001年在《人骨形成蛋白-3成熟肽基因转化烟草的研究》文中研究表明人骨形成蛋白3(hBMP-3)是转移生长因子TGF-p超家族的一员，可以诱导间充质细胞分化为软骨和骨，对骨骼的发育和再生修复起重要作用，临床已试用于某些难治性骨折和骨缺损的治疗。hBMP-3基因编码的前体蛋白由N端的信号肽、中间区域的前肽和C端的成熟肽构成，必须经过翻译后加工：切去信号肽和前肽，并进行糖基化修饰，方可成为成熟的活性蛋白。cDNA基因编码472个氨基酸的多肽，依据BMPs前肽和成熟肽之间有一共同的内切蛋白酶酶切位点RXXR，推测hBMP-3成熟肽是C端127个氨基酸残基组成的肽段。在人体内的含量极微，尽管研究者已经在真核细胞和原核细胞表达系统分别进行了表达，但是由于原核表达系统缺乏翻译后的加工修饰，真核表达系统存在成本高、产量低等缺点，限制了其应用。随着一些疫苗、抗体、细胞因子等异源蛋白在植物中的成功表达，植物表达系统的优点日益受到关注。据此，我们在党永军构建了hBMP-3成熟肽(hBMP-3m)基因植物表达载体的基础上，将hBMP-3m基因的植物表达载体pCAMBIA1300-B3m通过冻融法转化根癌农杆菌，同时建立了烟草高频再生和转化系统，试图将人骨形成蛋白3成熟肽基因转入烟草。 本研究以烟草NC89种子为材料，在MS培养基(附加20g/L蔗糖)上培养无菌苗，继代培养3～4代后，取叶盘为外植体接种在不同的培养基上，研究不同浓度的潮霉素(Hyg)对愈伤组织分化和芽再生的影响，确定了25mg／L Hyg为烟草再生的选择压力。以NC89无菌苗叶片为外植体，用携带hBMP-3m基因的根癌农杆菌浸染烟草，研究根癌农杆菌介导的的遗传转化，经过诱导筛选分化培养，生根培养，最终获得了烟草的Hyg抗性植株。由hBMP-3m基因两端序列及35S启动子序列和hBMP-3m基因末端序列分别组成两对引物，对抗性植株总DNA进行PCR检测；提取烟草总蛋白，进行SDS-PAGE和Western Blot检测。通过研究主要获得了以下结果： 1．将hBMP-3m植物表达载体pCAMBIA1300-B3m通过冻融法导入根癌农杆菌LBA4404。 2．经潮霉素(Hyg)筛选转化体浓度梯度实验，确定了Hyg对转化不定芽的适宜筛选浓度为25mg／L。2 硕士论文：人骨形成蛋白－3成熟肽基因转化烟草的研究 弓．建立了以烟草NC89无菌苗叶盘为外植体的遗传转化体系，利用农杆菌介导法将 1300书3m基因导入烟草，最终获得了Hyg抗性植株。 4．经PCR证实部分抗性植株己将人骨形成蛋白I成熟肽基因整合到烟草基因组中，首次获得了含hBMP－3m基因的烟草转化植株。 5．Western Blot结果显示在转基因烟草中有微量 BMP生成。
刘雪梅[6]2012年在《烟草花叶病毒U2株衣壳蛋白构建功能性复合材料的可行性研究》文中提出蛋白质等生物分子以其固有的分子识别特性、自组装性质、基因可控性及易于放大等性能已成为构建功能性复合材料的理想模板。病毒是最简单的生物分子,包括衣壳蛋白和内部的基因组DNA或RNA。病毒本质上就是结构化的纳米粒子,其衣壳是由病毒基因组编码的衣壳蛋白亚基通过一定的方式有规律地聚集而成的。目前,纳米生物技术的发展和特异性无机结合短肽的应用,为新型复合材料的开发提供了新的思路。本课题以烟草花叶病毒U2株----烟草轻绿花叶病毒(tobacco mild green mosaic virus, TMGMV)的衣壳蛋白(coat protein, CP)为研究对象,考察其用于生物模板的可行性,根据其与TMV U1CP结构的相似性特点,对其进行重组外源分子的设计：一、将其第123位丙氨酸突变为半胱氨酸；二、在衣壳蛋白C末端融合表达特异性结合氧化铱等功能性半导体氧化物纳米材料的特异性结合多肽。突变后的第123位半胱氨酸残基为含硫氨基酸,可以与含羟基、羧基、巯基的敏化分子酰化或形成二硫键,从而连接所需的功能性分子；无机结合肽作为生物分子和功能性无机材料金属氧化物的桥梁和纽带,可以特异性的识别金属氧化物。将经过基因修饰的烟草轻绿花叶病毒外壳蛋白在大肠杆菌表达系统中进行诱导表达,考察其用于功能性生物模板的制备的可行性。首先,通过设计引物,采用定点突变方法,由聚合酶链式反应(PCR)扩增得到重组修饰的TMGMV-CP-IrO2基因,基因克隆到原核表达载体PGEX-4T-1中,得到末端携带有氧化铱无机结合肽编码基因的重组表达载体PGEX-4T-1/TMGMV-CP-IrO2。然后,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,使用IPTG作诱导剂,得到表达的GST/TMGMV-CP-IrO2蛋白。优化重组蛋白的表达条件,分析蛋白的表达形式,进行可溶性表达条件的探索。实验结果表明,融合蛋白在37℃时进行诱导培养,诱导剂IPTG终浓度为0.1mmol/L,培养时间为6h左右时表达量最大；但是在可溶性表达方面,探索了低温诱导、控制IPTG终浓度等36个诱导条件仍然不能得到大量的可溶性融合蛋白,因此推测该重组GST/TMGMV-CP-IrO2蛋白在实验条件下为包涵体表达,不具有可溶性。选择融合蛋白表达量最大的培养条件培养表达菌,提取包涵体并溶解在6mol/L的盐酸胍中,采用正向稀释复性法4℃低温复性过夜后转入浓缩杯,通N2浓缩至2ml,经过AKTATM purifier纯化,在洗脱体积为45ml处出现吸收峰,经SDS-PAGE和Western Blotting检测得到了GST/TMGMV-CP-IrO2融合蛋白。通过氧化铱纳米粉结合实验进行融合蛋白的功能鉴定,实验结果表明,与纯的GST蛋白相比,融合蛋白与纳米粉的结合效果明显；而融合蛋白与氧化铱和氧化钛纳米粉分别结合的实验表明这种结合的特异性不够强。用一定比例的凝血酶酶切GST/TMGMV-CP-IrO2融合蛋白,得到了用于构建功能性生物模板的目的蛋白——重组TMGMV-CP-IrO2。本课题研究是基于刚性致密的病毒衣壳蛋白,进行构建功能性生物模板的探索性工作,创新性地完成了将经过定点突变及重组功能性无机结合短肽设计的衣壳蛋白进行表达、纯化到功能鉴定的考察工作,方法及结果具有一定的参考价值,对旨在开发未来可应用于能源、生物医学及纳米电子学等领域的复合型功能材料的科学研究有积极意义。
杜国利[7]2006年在《转基因枸杞表达HIV重组壳体蛋白的鉴定及其免疫原性的初步研究》文中指出自1981年美国发现世界首例艾滋病患者,至今已死亡2000多万人,仅2003年新感染人数就有500万。目前全世界大约已有5800万人被感染,大约一半为15至24岁的青壮年。我国艾滋病病毒感染者迅猛增长,现已有84万人被感染HIV病毒,已经成为我国当前突出的卫生问题,目前还没有一种HIV疫苗问世,如何高效而迅捷的生产HIV疫苗成为关系人类生命健康的重大问题。应用转基因植物表达HIV疫苗,有其简洁可操作性优势。HIV的壳体蛋白(CA)为病毒核心结构的主要蛋白,在病毒粒子中含量丰富,在HIV病毒的组装和成熟过程中起着至关重要的作用,在HIV的不同亚型间高度保守。野生型的CA以圆柱状颗粒存在,与4个HIV基质蛋白(MA)的氨基酸残基结合就能使CA的形状由圆柱状转至球状,进而增强CA的免疫原性。本研究利用有助于CA形成病毒样颗粒(VLP)结构的MA的最后四个氨基酸残基,与CA融合表达,形成的球状颗粒能够增强CA的免疫原性。枸杞与烟草同属于茄科植物,植物细胞易于遗传转化,安全性性高,利用其再生成植株的形成可进行目的基因的表达。植物细胞作为真核细胞表达体系,可对其表达产物进行糖基化、磷酸化等翻译后加工修饰和装配,从而有利于提高HIV CA疫苗的免疫原性。有报道利用转基因烟草表达的HIV-1的P24蛋白能保持较好的免疫原性。而枸杞作为一种宝贵的中药材,则富含多种对身体有益的成分;而其作为常年生植物其遗传性状更加稳定,所携带基因不易丢失。在没有相应的HIV疫苗问世以前,应用植物表达系统选择性大量安全地表达HIV抗原多肽及众多重组蛋白,研究它们的作用机理及其免疫活性,应对HIV病毒的高度变异性,以制备安全高效的HIV疫苗。我实验室与美国Utah大学的Dr. W.I. Sundquist, Professor合作将影响CA形成球状VLP结构的MA的四个核苷酸序列与CA融合形成MA4-CA,然后将源于水稻的一个富含甘氨酸序列的信号肽(GRP)连接在MA4-CA融合基因的3'端,从而使枸杞中表达的CA疫苗被引导进入根细胞间隙,并从根系不断地分泌到培养液中,由此产生出高纯度的CA疫苗。并在此基础上.进一步明确植物组织表达的CA重组疫苗的免疫原性。为利用转基因枸杞表达成本低廉,更为安全有效的HIV重组疫苗提供依据。研究目的:利用本实验室构建好的分泌型植物表达载体,通过根癌农杆菌对枸杞进行遗传转化,筛选阳性克隆,从基因水平及蛋白水平鉴定转基因枸杞。应用所提取转基因枸杞蛋白免疫BALB/c小鼠,进行其免疫原性研究。以期应用转基因枸杞表
郎遥玲[8]2016年在《pCAMBIA-E8-APB-DOCK8融合基因表达质粒中标记基因的去除及瞬时转化番茄的研究》文中进行了进一步梳理龋病(dental caries),俗称虫牙或蛀牙。它是牙体硬组织发生的慢性、进行性破坏的疾病。其具有发病率高、分布广等特点,目前已严重影响到了人们的生活质量。因此,需要寻找一种能有效降低患龋率的方法已成为当今研究的热点。变异链球菌(Streptococcus mutans,S.mutans)是人类最主要的致龋菌,其中主要的致龋毒力因子是表面蛋白(surface protein antigen,PAc)和葡糖基转移酶(glucosyltransferases,GTFs),研究表明针对这两种致龋毒力因子的抗体,可以有效抑制龋病的发生和发展。因此,“免疫防龋”可成为当今有效控制龋病的方法。本课题组针对这两种毒力因子,成功构建了植物表达载体p CAMBIA-E8-APB-DOCK8(简称p E8AD3),并转化番茄获得转基因番茄植株。转基因植物的食用安全和生态安全受到了人们的广泛关注,目前转基因植物的首要安全问题来源于标记基因的存留,将标记基因去除可消除人们对安全性的顾虑。本实验作为课题组实验的延续,将融合基因表达质粒p E8AD3中的标记基因Km和GUS去除,并进一步探索番茄瞬时转化表达系统,为后续蛋白水平的研究提供实验基础。目的:以课题组构建的质粒pE8AD3为基础,将选择标记基因Km和GUS去除,为后期番茄再生转化提供实验基础,提高转基因植物的安全性。利用农杆菌介导的注射法,建立番茄子叶瞬时表达系统,分析外源基因的表达情况。方法:1、运用DNA重组技术,将p E8AD3中的选择性标记基因Km和GUS去除。2、通过对番茄无菌苗的培育,观察不同番茄品种的出芽数、成苗数及农艺学性状的差异显着性,筛选出适用于本实验的番茄品种;将重组质粒p E8AD3转化农杆菌EHA105,通过对番茄子叶、注射农杆菌浓度、农杆菌注射量、生长苗龄以及共培养天数进行筛选,建立农杆菌介导的番茄子叶瞬时表达系统,观察DOCK8基因的表达情况。3、番茄再生转化中,通过对番茄子叶外植体的培育,侵染农杆菌后的抑菌实验,观察羧苄青霉素、头孢霉素、特美汀3种抗生素在不同抑菌浓度下的抑菌效果及外植体形态的变化,确立抑菌抗生素及浓度;运用PCR检测方法,对课题组获得的转基因番茄果实进行初步筛选。结果:1、成功获得不含标记基因Km和GUS的重组质粒p E8AD3。2、建立番茄子叶瞬时表达系统,适合本实验的番茄品种为欧洲大红(苹果型),选材部位为番茄的子叶,注射农杆菌浓度为OD600为0.2-0.7,农杆菌注射量为50μL,苗龄为7-10 d,共培养24-48 h。3、番茄再生转化中,特美汀作为一种有效抑制农杆菌的抗生素,抑菌效果显着,对植物影响小,特别适用于较难转化的材料的转基因过程,抑菌浓度为400 mg/L为宜,抑菌浓度过大或过小均会影响外植体的生长;PCR筛选出阳性番茄果实并保种。结论:1、获得了可用于植物遗传转化的不含Km和GUS选择标记基因的融合基因表达载体p E8AD3,该载体含有果实特异性启动子E8,APB中包含cat、Pac A和ctx B基因,以及胞质分裂专一蛋白8(DOCK8)。2、建立并优化农杆菌介导的番茄子叶瞬时表达系统,该系统的优点是操作简单,不需要昂贵的试剂和仪器,在短时间内可分离蛋白,为进一步探索目的蛋白的生物学功能提供实验基础,为后期外源基因蛋白表达分析的研究提供一种方便、快捷和有效的方法。3、优化出浓度为400 mg/L的特美汀抗生素作为番茄(欧洲大红)转基因选择压,该抗生素与其他抗生素相比,其优点是能有效抑制农杆菌的生长,对植物影响小,特别适用于较难转化的材料的转基因过程,尤其是农杆菌OD值较高,很难被其他抗生素抑制时效果较为理想。4、获得含GUS报告基因的转基因(p E8AD3)阳性番茄果实,并成功用于种子的保存和繁育。
蒋冬花[9]2002年在《隐地疫霉（Phytophthora cryptogea） Cryptogein基因的克隆及其功能的研究》文中认为激发素(elicitin)是一类由卵菌纲(Oomycete)的疫霉属(Phytophthora)和腐霉属(Pythium)真菌分泌的蛋白类激发子，在烟草与疫霉菌的互作中起无毒因子作用。隐地蛋白(Cryptogein)由隐地疫霉(P. cryptogea)所分泌，该激发素在极低浓度下能诱导烟草产生过敏性反应(HR)，并使植株获得广谱抗病性(SAR)。可以预见，将Cryptogein基因转入烟草植株中表达应能诱导产生完整的抗病防卫反应，提高对多种病原物的抗性。因此本研究以隐地疫霉为基因源，克隆了Cryptogein(Crypt)基因并经PCR定点突变获得了13位氨基酸突变的CryK13V基因，构建了这两种基因的植物双元表达载体，并转化了烟草。对两种转基因烟草的抗病性、耐盐性、农艺性状、抗病耐盐分子机理及T1代的遗传特性等进行了初步的研究。具体结果如下： 1 目的基因的克隆和改造：根据已知的核苷酸序列，设计一对引物，以隐地疫霉的基因组DNA为模板用pfu DNA聚合酶进行PCR扩增，获得了一长度约为300bp的PCR产物，用酶切鉴定和测序分析证明克隆的Crypt基因与已报导的序列相同。进一步用一对突变引物进行PCR定点突变扩增，获13位赖氨酸(K)突变成缬氨酸(V)的PCR产物(OryK13V)，与pUC-mT载体连接后(pUC-CryK13V)通过酶切鉴定和测序证实与预期结果相一致。 2 构建了两个植物双元表达载体：针对Crypt基因的生物学活性和大多数病原菌从根、茎、叶等的表皮细胞侵入的特点，选用弱组成兼病菌诱导型，并能在表皮细胞中特异性表达的水稻苯丙氨酸解氨酶基因PAL启动子控制Crypt基因的表达；对突变基因CryK13V则选用35S强启动子控制。由于Crypt蛋白作用的受体位于植物细胞膜上，因此，在Crypt和CryK13V基因前设计了分泌结构(PR1b信号肽序列)；选用具有卡那霉素抗性植物双元表达载体CHF3，构建了两个植物双元表达载体CHF3-PAL-PRs-Crypt和CHF3-35S-PRs-CryK13V。用冻融法将含Crypt和CryK13V基因植物双元表达载体分别转入根癌农杆菌EHA105菌株中，通过PCR鉴定阳性的转化子用于烟草的转化。 3 转基因烟草植株的获得：将含Crypt和CryK13V基因的农杆菌与烟草叶盘共培养。经卡那霉素抗性筛选分别获转Crypt和CryK13V基因的再生植株22株和33株，PCR检测有21株和30株为阳性；部分植株的Southern杂交结果表明Crypt和 C仙JV基因己以低拷贝门～3个）整合到烟草基因组中。N0rthem杂交分析和 RTPCR检测结果表明 Cypt和 C他叁厂基因在转化烟草植株中有低水平的表达。 4 TO、TI代转基因烟草植株的抗病性分析：用不同接种方法测定转基因烟草植株的抗病性，统计分析结果表明，约一半（54．9％）的植株同时对烟草上3种重要病原菌高抗，80％左右的转基因植株对 3种病原菌的抗性比对照增强。引株转基因烟草植株中对烟草黑脏病菌高抗（0级）的有35株，抗病门～二级）的有8株，感病（3级）的有8株。对烟草赤星病菌高抗（0级）的有33株，抗病门～2级）的有9株，感病（3级）的有9株。大部分转基因烟草植株（81．8％）对烟草野火病均表现为高抗（0级）。而未转基因的烟草植株对3种病原菌均表现为感病。表明大部分转Cyp t和Cp 3厂基因烟草植株具有广谱抗病性。转Cyp t和CyK 3厂基因烟草植株对烟草上3种病原菌的抗性反应基本相近。 5 转基因烟草的耐盐性测定：将转基因和非转基因烟草种子播于含200 mMNaCI的1o 培养基上测定耐盐性。结果表明：大部分转基因烟草小苗的耐盐性比对照强，在含 200 mM NaCI的 1o 培养基中生长 40 d左右，转基因烟草小苗生长和生根基本正常；而转未转基因的烟草种于萌发后生长和生根明显被抑制，最后死亡。表明转基因烟草的耐盐性显着增强。 6 转基因烟草植株抗病、耐盐增强的分子机理初探：用Northern杂交对抗病。耐盐分子机理进行了初步探讨。结果表明：具有高水平 PR－la蛋白积累的转基因植株具有更强和更广的抗病性；PR－la等防卫反相关基因快速和超量诱导表达可能是转基因植株抵抗病原菌侵入的另一种机制。转录因子OPBI的活化与转基因烟草植株的耐盐、抗病性有一定的正相关性；渗调蛋白PRJ基因高水平组成型或诱导型表达也是提高转基因烟草植株耐盐性的原因之一。 n Cptogin基因对烟草其它农艺性状的影响：大部分转基因植株生长正常，并在长势、植株高度、生育期等有一定程度的改变，表现为苗期促进发棵，生长期长势旺盛、植株高度增加，生育期缩短，开花提早。也有少数转基因植株表现为矮化，不能正常现蕾、开花、结籽等异常现象。 8 TI代转基因烟草遗传分析：以卡那霉素抗性为筛选标记结合PCR检测，对部分＊代转基因烟草进行分离比测定，同时结合Southern杂交估算整合的拷贝数。结果转基因烟草TI代的分离基本符合孟德尔 3：1、15：1和 64：1的遗传规律。大多数转基因植株以单拷贝整合，少数为2个或3个拷贝整合。TO代抗病的转基因植株 TI代普遍表现为抗病，表明整合的 Cypt和 CIyK二厂基因己稳定遗传和表达。
参考文献：
[1]. 烟草花叶病毒载体及其在植物中表达外源多肽的研究[D]. 李巧丽. 中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）. 2004
[2]. 以烟草花叶病毒为载体在植物中表达外源多肽的研究[D]. 江陆斌. 中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）. 2003
[3]. bpti基因的克隆及其在烟草中的表达[D]. 耿学军. 吉林大学. 2005
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[7]. 转基因枸杞表达HIV重组壳体蛋白的鉴定及其免疫原性的初步研究[D]. 杜国利. 山东省医学科学院. 2006
[8]. pCAMBIA-E8-APB-DOCK8融合基因表达质粒中标记基因的去除及瞬时转化番茄的研究[D]. 郎遥玲. 遵义医学院. 2016
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标签：生物学论文; 农杆菌论文; 融合蛋白论文; 转基因植物论文; 转基因番茄论文; 重组蛋白论文; 基因合成论文; 融合基因论文;