李涛[1]2008年在《放疗后残余肝癌侵袭转移潜能的变化、机制及干预的实验研究》文中研究表明原发性肝癌(主要是肝细胞肝癌,hepatocellular carcinoma,HCC)是最常见的恶性肿瘤之一,预后极差,目前是世界第叁位癌症杀手,而在中国则高居第二位。手术切除仍是治疗肝癌最有效的方法,但由于肝癌的一些特性,如多灶性,早期血管侵犯,合并肝硬化等,只有不到20%的肝癌患者就诊时适合手术治疗。放射治疗(以下简称放疗)用于肝癌的治疗已有半个世纪,近年随着适形放疗技术的出现及放射生物学观念的更新,放疗在肝癌治疗中的地位有所提高。但临床观察到即使接受根治剂量放射治疗后,仍有60%以上的患者有残存肿瘤存在,尽管放疗后肿瘤会缩小甚至消失,病情得到控制或缓解,但缓解期过后不少病人很快出现复发转移,而且进展迅速,预后较差。这一现象从临床上提出了许多问题,如放疗是否会促进残余肿瘤的播散转移,出于何种机制,如何干预以减少放疗后的复发转移并最终提高放疗疗效,等等。本课题即为此而设计,主要应用我所建立的转移性人肝癌MHCC97L裸鼠模型,模拟临床分割放疗,并主要观察放疗后残余肝癌的侵袭转移潜能的变化。通过实验新发现放疗结束后期残余肝癌的侵袭转移潜能增强,其机制主要是通过上调TMPRSS4表达从而诱导上皮一间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)实现的。EMT是指上皮细胞向间质细胞转化的复杂过程,在此过程中上皮细胞的极性消失,迁移和运动能力增强,EMT是上皮来源的恶性肿瘤发生侵袭转移的重要原因。我们还发现放疗后单独使用TMPRSS4的抑制剂AEBSF或合并使用小剂量IFN-α和阿司匹林(Aspirin)可减少放疗后的肝内播散和转移,从而为进一步提高肝癌放疗疗效提供了线索。1.放射线照射可引起肝癌细胞MMP-2、VEGF表达增加及体外侵袭性增强,并与放射线剂量及时间相关分别以不同剂量的6mvX线照射MHCC97L细胞,各照射组吸收剂量分别为4Gy和8Gy,对照组(0Gy)除不接受X线照射外,其他处理与照射组相同。照射后24-48h MHCC97L细胞MMP-2和VEGF的表达或活性增强并与照射剂量及时间相关,组间差异具有统计学意义(P＜0.05)。8Gy照射后48h其表达及活性最强,此后逐渐降低,照射后96h MMP-2活性低于非照射组。放射线照射对MHCC97L细胞体外侵袭能力的影响:0Gy(对照组)、4Gy和8GyX线照射后,MHCC97L细胞穿过Matrigel胶到达Transwell小室膜背面的细胞数分别为7.2±1.9、13.2±2.7和31.2±7.2,组间差异具有统计学意义(P＜0.05)。放射线照射后96h,各组细胞穿膜数无显着差异(P＞0.05)。提示放射线照射可使MHCC97L细胞体外侵袭性短期增强。2.Aspirin能抑制放射线照射后肝癌细胞MMP-2和VEGF的表达、活性及体外侵袭性的增强体外放射线照射前2h细胞培养基内加入Aspirin,使其终浓度为2mM,放疗后继续培养48h。在不抑制细胞增殖的前提下,与对照组相比,Aspirin能在mRNA水平和蛋白水平抑制放疗诱导的VEGF和MMP-2的表达增加和MMP-2活性的增强,以及由此导致的肝癌细胞侵袭性增强。3.放疗结束后残余肝癌体内侵袭转移潜能的变化规律为了在体内进一步验证放疗结束后残余肝癌侵袭转移能力的变化,我们将具有肺转移潜能的人MHCC97L肝癌组织块种植于BALB/c nu/nu雄性裸鼠肝脏,建立转移性人肝癌裸鼠原位模型。待种植后4周瘤体直径1cm左右时开始放疗。周一至周五每天照射2Gy,共计2周,总放疗剂量20Gy。分别于放疗结束后2天和30天处死放疗组及其对照组裸鼠,切除残余肝癌组织再次原位种植于正常裸鼠肝脏,观察6周处死。放疗结束后2d残余肝癌及其对照组肝癌切除再种植肿瘤大小分别为1.61±0.51cm~3和2.25±0.52cm~3(P＜0.05),肺转移率分别为12.5%和66.7%(P＜0.05),而放疗结束后30d残癌及其对照组肝癌切除再种植肿瘤大小分别为和2.60±0.61cm~3和2.15±0.71cm~3(P＞0.05),肺转移率分别为100%和63.6%(P＜0.05)。提示放疗结束后2d残癌生长受到抑制,而放疗结束后30d肿瘤生长速度已恢复到放疗前,甚或过之。放疗结束后30d残癌切除再种植后肿瘤在肝内呈播散性生长,肺转移率增加;而放疗结束后2d残癌切除再种组肿瘤呈外生性生长,无肝内播散,肺转移率降低。提示放疗结束后残余肝癌在体内的侵袭转移能力先减弱后增强。4.放疗结束后不同时段残余肝癌组织肿瘤侵袭转移相关基因表达差异的研究为了寻找放疗结束后残余肝癌在体内侵袭转移能力变化的相关机制,我们采用Super Array肿瘤侵袭转移相关基因芯片,对对照组、放疗结束后2d和放疗结束后30d残余肝癌组织肿瘤侵袭转移相关基因的表达谱进行分析。以上调或下调超过2倍为检测标准。与对照组相比,放疗结束后2d残余肝癌组织抑癌基因Kiss1和TIMP2表达上调。而放疗结束后30d残余肝癌组织癌基因TMPRSS4表达上调,抑癌基因BAI1表达下调。5.实时荧光定量PCR验证基因芯片结果和Western blot分析TMPRSS4在放疗前后不同时段的表达我们采用实时荧光定量PCR法验证基因芯片的结果。结果显示放疗结束后2d残癌组织Kiss1(P＜0.01)和TIMP2(P＜0.05)的mRNA表达显着增强,而放疗结束后30d残癌组织TMPRSS4 mRNA表达显着高于对照组及放疗结束后2d残癌组织(P＜0.01),而BAI1mRNA表达变化无统计学意义(P＞0.05)。由于放疗结束后30d残余肝癌的侵袭转移能力增强是影响放疗疗效的关键,我们用Western blot进一步验证放疗前后不同时段肝癌组织内TMPRSS4的蛋白含量,同样发现放疗结束后30d残癌组织内TMPRSS4蛋白含量显着高于对照组及放疗结束后2d肝癌组织。提示放疗结束后期TMPRSS4表达增加是其侵袭转移增强的重要原因。6.Western blot分析EMT相关分子及COX-2的变化根据文献报道,TMPRSS4表达增强能够抑制E-cadherin从而诱导EMT,我们进一步用Western blot检测上皮细胞的标志E-cadherin和其转录抑制因子SIP1,以及间质细胞的标志Vimentin和N-cadherin,发现放疗结束后30d残癌组织SIP1、Vimentin和N-cadherin的表达明显增加,E-cadherin的表达则显着减少。而TMPRSS4抑制剂AEBSF能抑制放疗诱导的SIP1和TMPRSS4的表达而增强E-cadherin的表达,提示放疗结束后30d残癌侵袭转移能力增强是通过上调TMPRSS4的表达,从而抑制E-cadherin和引起EMT实现的。此外,我们选取部分基因芯片未包括的与肿瘤侵袭转移相关的基因进行分析。Western blot结果显示,放疗结束后30d残癌组织COX-2的表达明显增强,由于COX-2的表达与E-cadherin负相关,因此COX-2表达增强也有助于EMT的发生。7.联合使用小剂量IFN-α和Aspirin或绿脓杆菌制剂能抑制肝癌在裸鼠体内的生长转移据我所前期实验结果,大剂量(1.5×10~7 U/kg·d)长期使用IFN-α能有效抑制转移性人肝癌裸鼠模型肿瘤的生长,并降低手术切除后的复发转移率。但部分患者长期使用大剂量IFN-α会出现白细胞减少等副作用,不能坚持使用影响疗效。鉴于放疗结束后期COX-2表达增加,我们选择联合使用IFN-α和COX-2抑制剂Aspirin观察其对肝癌在裸鼠体内生长转移的抑制作用。结果显示小剂量IFN-α(7.5×10~6 U/kg·d)+Aspirin(15mg/kg·d)可显着抑制肝癌在裸鼠体内的生长转移,其疗效与单独使用大剂量IFN-α(1.5×10~7 U/kg·d)无显着差异。此外,结果还显示绿脓杆菌制剂腹腔注射也可通过促进肿瘤细胞凋亡而显着抑制肿瘤生长转移。为此我们选择小剂量IFN-α(7.5×10~6 U/kg·d)+Aspirin(15mg/kg·d)和绿脓杆菌制剂作为干预放疗结束后期残余肝癌侵袭转移增加的治疗手段。8.联合使用小剂量IFN-α和Aspirin或绿脓杆菌制剂可降低放疗结束后期的肝内播散和转移将放疗结束后30d残癌组织切除再种植于裸鼠肝脏,分为对照组、小剂量IFN-α+Aspirin治疗组和绿脓杆菌制剂治疗组。与对照组相比,小剂量IFN-α+Aspirin治疗组和绿脓杆菌制剂治疗组肝内播散显着减少,而肺转移被完全抑制。Western blot及免疫组化结果显示小剂量IFN-α+Aspirin治疗组可显着减少放疗后残癌组织内的COX-2的表达,而增强E-cadherin的表达,从而逆转放疗结束后期TMPRSS4表达增强所诱导的EMT及侵袭转移的增加,显示出小剂量IFN-α和Aspirin在减少放疗结束后期残癌侵袭转移方面的临床应用价值。结论1.放疗结束后残余肝癌体内侵袭转移潜能随时间变化先降低后增强。2.放疗结束后残余肝癌TMPRSS4表达增加,进而抑制E-cadherin的表达和诱导EMT,是放疗结束后期残余肝癌侵袭转移能力增强的主要原因。3.联合使用小剂量IFN-α和Aspirin或单独使用TMPRSS4抑制剂AEBSF能有效抑制放疗后期COX-2和TMPRSS4表达的上调,增加E-cadherin的表达,抑制残癌的侵袭转移。绿脓杆菌制剂亦可通过促进肝癌细胞的凋亡来抑制放疗后的播散转移。4.联合使用小剂量IFN-α和Aspirin可成为临床肝癌患者放疗后减少复发转移有效实用的干预措施。应用价值1.明确放疗后残余肝癌体内侵袭转移潜能变化规律及其机制,有助于指导放疗后的综合治疗,从而降低放疗后肝癌的复发转移。2.联合应用小剂量IFN-α和Aspirin可显着降低放疗结束后期残癌在体内的侵袭转移,为临床提高肝癌放疗的疗效提供了线索。3.联合应用小剂量IFN-α和Aspirin可显着抑制肝癌的生长转移,有可能成为临床肝癌治疗的新方法。创新点1.首次发现放疗结束后残余肝癌体内侵袭转移潜能的变化规律及其机制,提出放疗后残癌TMPRSS4表达增加,进而抑制E-cadherin的表达和诱导EMT,是放疗结束后期残癌侵袭转移能力增强的主要原因。2.首次提出联合应用小剂量IFN-α和Aspirin可显着抑制肝癌的生长转移并降低放疗结束后期残癌的侵袭转移。
李志浩[2]2010年在《人退变腰椎间盘中HIF-1α和COX-2的表达相关性及其意义》文中研究指明腰椎退行性改变引起的局部病理解剖学、病理生理学的变化不仅可以导致椎间盘功能异常、腰椎管狭窄,同时还可能影响运动节段的稳定性,出现异常活动,这种异常活动又可以进一步破坏椎间盘的结构与功能,进一步加剧椎间盘的退变与破坏。许多研究结果证实椎间盘是脊柱退变过程中首先发生变化的结构,因此腰椎间盘退变是一系列腰椎退行性疾病的前提和基础病理过程。临床上往往表现为腰椎管狭窄、腰椎节段不稳、腰椎间盘突出等病症,从而表现出神经根、脊髓受压并由此产生一系列相应症状,如腰腿痛,下肢无力、皮肤感觉异常等。目前引起腰椎间盘退变的确切机制尚无定论,腰椎间盘退变的发生除了与传统的力学因素、神经生理因素、生化因素相关之外,还与免疫反应密切相关。近年来,随着分子生物学和分子免疫学的迅速发展以及对细胞因子和炎症介质研究的深入,细胞因子和炎症介质在椎间盘退变的作用越来越受到重视。大量的研究表明退变的腰椎间盘组织中能产生炎性介质,炎性成分已被认为是导致椎间盘退变的主要因素之一。细胞因子与炎症介质介导的髓核细胞凋亡、椎间盘内蛋白多糖含量减少、新生血管的形成等都普遍认为在椎间盘退变过程中发挥着重要作用。随着研究的深入,新生血管在退变椎间盘中的作用逐渐引起研究者重视。早年国外有学者在退变的腰椎间盘组织内发现血管结构,并且发现血管结构在椎间盘突出时更加多见。他们认为新生血管的形成在椎间盘自发性吸收过程中具有重要作用。目前国内外学者对血管形成在椎间盘退变中的作用有两种不同的观点。有学者认为新生血管的形成是机体试图修复组织损伤,延缓椎间盘退变的自发性改变,是一种对抗对退变的反应,因为正常椎间盘无血供,其营养的供应主要是通过两个途径被动扩散而来：一是终板途径,二是纤维环途径。而椎间盘退变早期,营养物质的被动扩散减弱,椎间盘新生血管的形成有助于给椎间盘细胞提供营养物质,因而对机体是有益的。而另一些学者则认为椎间盘血管化是导致椎间盘发生退变的始动因素,是椎间盘退变的病理基础。因为椎间盘退变的实质是基质成分的降解,生理状态下的椎间盘为无血供组织,血管的侵入可能满足了基质金属蛋白酶等基质降解酶激活所需要的条件,从而导致基质的降解,引起椎间盘退变,因而对机体有害。环氧化酶-2 (COX-2)因子是一种多功能的蛋白质,在许多恶性肿瘤组织中表达增高,它与肿瘤细胞增殖、凋亡、血管形成密切相关。而这种相关性主要表现为COX-2对于肿瘤新生血管形成过程中的调控作用。而研究早已证实退变椎间盘内新生血管十分常见,那么COX-2因子在退变椎间盘中新生血管的形成过程中的作用是否也如同其在肿瘤组织新生血管中的作用?此外,COX-2因子还是催化花生四烯酸转化为前列腺素类物质的限速酶,研究人员最早发现,突出的椎间盘组织中前列腺素物质浓度明显高于正常椎间盘,且其浓度存在一定的规律性。而前列腺素类物质对椎间盘细胞蛋白多糖的合成具有抑制作用,而椎间盘髓核蛋白多糖含量减少又是导致椎间盘发生退变的重要原因。诸多研究表明人类退变的椎间盘组织中COX-2因子的表达明显高于正常水平,而临床上运用选择性COX-2抑制剂治疗椎间盘突出的相关研究表明选择性COX-2抑制剂能明显减少椎间盘突出症患者的炎症反应。缺氧诱导因子-1 (HIF-1α)是1992年发现的一种氧依赖转录激活因子,通过与低氧反应元件(HRE)结合,引发下游基因的转录。HIF-1α是一种使组织细胞适应低氧环境的重要分子,它可以增加促红细胞生成素、葡萄糖受体、糖酵解酶、血管生成因子以及调控细胞凋亡和分化相关分子的表达。由于肿瘤生长迅速,其增生速度超过周围血管的生长速度,必然会造成局部组织严重缺氧,进而诱导HIF-1α的表达。早期的研究认为退变的椎间盘由于营养供应不足,造成椎间盘局部的相对缺氧环境,因此有学者提出在退变的人类腰椎间盘中是否有HIF-1α的表达。随后他们通过免疫组化的方法证实,在突出椎间盘HIF-1α的表达要明显高于正常椎间盘,同时还证实HIF-1α的表达和椎间盘细胞凋亡存在相关性。近年来有研究者证实在大鼠椎间盘髓核细胞内也有HIF-1α的表达,并且在不同的诱导环境下诱导出的HIF-1α表达程度也不同。HIF-1α的表达程度与细胞凋亡程度之间存在高度相关性,随着椎间盘凋亡程度的增加,髓核内HIF-1α的表达也相应增加。研究目的早前的研究已经表明环氧化酶-2 (COX-2)和缺氧诱导因子-1 (HIF-la)是肿瘤内部新生血管形成的重要因子,而COX-2, HIF-1α则更是已经被证实在人类椎间盘中表达。然而早先国内外相关研究仅仅局限于这两种因子分别在椎间盘退变过程中的作用和机制,并没有联合检测这两种因子在椎间盘退变过程中的影响,相关文献也未曾有报道COX-2, HIF-1α在椎间盘退变过程中的相关关系研究。因此探讨它们在退变椎间盘组织内的表达相关性以及与退变椎间盘内新生血管形成之间的关系,对于进一步揭示和完善椎间盘退变的机制,以及对于椎间盘退变早期的预防和治疗都有着十分重大的意义。那么在退变的椎间盘组织中二者的表达是否有关、二者与椎间盘内新生血管的形成是否有关、以及他们之间的表达差异如何,都是本研究需要探讨的。研究方法选取手术摘除的退变椎间盘组织及少量正常椎间盘组织,将所得的椎间盘组织固定,制成病理切片。采用免疫组化技术,显示出COX-2因子、HIF-1α因子以及CD34标记的新生血管在退变椎间盘及正常椎间盘中表达状况,并计数退变椎间盘中微血管的密度。统计学分别描述退变椎间盘中COX-2因子与HIF-1α因子的表达相关性以及微血管密度(MVD)与COX-2因子、HIF-1α因子的表达情况。研究结果1.光镜检测结果：正常的椎间盘髓核组织切片经HE染色后光镜下可见髓核组织中胶原纤维相互平行排列,纤维粗细较均匀,可见少量类软骨细胞,未见囊泡状空腔和裂隙；而退变的椎间盘髓核组织中纤维细胞增生明显,胶原纤维粗细不均、排列紊乱,甚至发生断裂,并可见大量纤维软骨样组织。髓核基质发生玻璃样变性,可见散在或灶状坏死区,有的坏死物液化、吸收,遗留下长短不等、大小不一的蜂窝状、囊泡状空腔和裂隙。2.免疫组化染色结果：经免疫组化染色后发现HIF-1α、COX-2在作为对照组的正常椎间盘髓核中仅有微弱表达或几乎不表达。但在退变的髓核内其表达明显增加,其中COX-2在退变的椎间盘中表达的阳性率为42.5%。切片上的染色阳性部位大部分为椎间盘髓核细胞的胞质或胞膜,镜下表现为髓核细胞胞质或胞膜上出现棕黄色染色颗粒,并且附近大多有新生血管生成。HIF-1α因子在退变的椎间盘中表达的阳性率为45%。切片上的染色阳性部位大部分为椎间盘髓核细胞的胞质与胞核,镜下表现为髓核细胞胞质或胞核上出现棕黄色染色颗粒,并且出现染色阳性细胞的部位与表达COX-2的阳性细胞的位置存在明显重迭。用CD34标记的新生血管经免疫组化染色后,镜下表现为棕色的单个内皮细胞或内皮细胞簇。在正常的髓核组织中未出现阳性结果,但是在退变的髓核中其阳性结果明显增多。3.统计学分析结果：经Spearman等级相关分析,退变椎间盘髓核组织内HIF-1α、COX-2之间呈显着正相关关系(P<0.01,r=0.406)。经独立样本t检验,退变椎间盘髓核组织中MVD值在HIF-1α阳性组的表达高于阴性组,两者有统计学差异(t=-4.052, P=0.000),退变椎间盘髓核组织中MVD值在COX-2阳性组的表达高于阴性组,两者有统计学差异(t=-5.103,P=0.000)。结论1.HIF-1α、COX-2在退变的髓核内其表达明显增加；2.退变椎间盘髓核组织内HIF-1α、COX-2的表达呈显着正相关关系；3.退变椎间盘髓核组织中MVD值在HIF-1α阳性组的表达高于阴性组；4.退变椎间盘髓核组织中MVD值在COX-2阳性组的表达高于阴性组。
马磊[3]2014年在《海兔素对脑胶质瘤异位移植瘤抑制作用研究》文中认为目的观察海兔素(Aplysin)对小鼠脑胶质瘤异位移植瘤血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子受体(EGFR)及环氧化酶-2(COX-2)表达的影响,探讨其抑制脑胶质瘤的可行性。方法将75只昆明种小鼠于左前腋下皮下接种1×106细胞/ml胶质瘤细胞悬液,24 h后随机分为5组,每组15只,分别为脑胶质瘤异位移植瘤模型组、海兔素低、中、高剂量组[50、100、150 mg/(kg?bw?d)]和替莫唑胺(temo-zolomide,TMZ)阳性对照组[20 mg/(kg?bw?d)],给药组和与阳性对照组分别按上述剂量Aplysin和TMZ灌胃,模型组以等体积大豆色拉油灌胃,每天灌胃1次,2周内连续给药。末次灌胃24小时后,称体质量,摘除眼球取血后处死小鼠。无菌条件下剥离肿瘤组织。免疫组化法测定肿瘤组织中VEGF、EGFR及COX-2的表达情况。结果与脑胶质瘤异位移植瘤模型组相比,海兔素各剂量组VEGF、EGFR及COX-2的表达显着降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。随着海兔素剂量的增加,COX-2、VEGF和EGFR表达呈现逐渐减弱趋势(P<0.05)。其中海兔素高剂量组EGFR的表达水平与TMZ阳性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论海兔素可抑制小鼠脑胶质瘤异位移植瘤肿瘤生长,其作用机制可能与对小鼠脑胶质瘤异位移植瘤组织VEGF、EGFR及COX-2表达具有抑制作用有关。
杨哲, 李建基, 黄赞松[4]2019年在《原发性肝癌靶向药物治疗试验与临床研究进展》文中认为肝癌是一种高发的消化系统恶性肿瘤,传统的治疗方法对于中晚期肝癌疗效不佳,索拉非尼是第一个用于肝癌治疗的分子靶向药物,靶向药物的出现为中晚期肝癌患者提供了新的选择.近年来,特别是免疫治疗的加入,已发现许多新型靶向药物可明显改善中晚期肝癌患者的预后,因此靶向药物成为了研究热点.本文就近年来肝癌靶向药物治疗试验及临床研究进展做一综述.
参考文献：
[1]. 放疗后残余肝癌侵袭转移潜能的变化、机制及干预的实验研究[D]. 李涛. 复旦大学. 2008
[2]. 人退变腰椎间盘中HIF-1α和COX-2的表达相关性及其意义[D]. 李志浩. 南方医科大学. 2010
[3]. 海兔素对脑胶质瘤异位移植瘤抑制作用研究[D]. 马磊. 青岛大学. 2014
[4]. 原发性肝癌靶向药物治疗试验与临床研究进展[J]. 杨哲, 李建基, 黄赞松. 世界华人消化杂志. 2019
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