摘要：建立了测定依酚氯铵中有关物质的高效液相色谱（HPLC）法。采用苯乙烯-二乙烯苯共聚物为填充剂（250mm ×4.6 mm，8μm），以7.7g/L四甲基溴化铵溶液（用磷酸调节pH=3.0）-乙腈（85：15）为流动相；流速1 mL·min－1；柱温30 ℃；检测波长281nm，依酚氯铵峰与有关物质峰分离完全，有关物质3-二甲氨基苯酚（杂质A）在0.05～2μg·mL-1浓度范围内呈良好的线性关系（r=0.999），回收率为98.7％。方法操作简便，结果准确可靠，可作为依酚氯铵的有关物质测定方法。
关键词：依酚氯铵；3-二甲氨基苯酚；高效液相色谱法；有关物质
Determination of Related Substances in Edrophonium Chloride by HPLC
TAO Mingfeng，Tan Nanqi，Li Qiuchan，Tian Liang，Xie Chunyan，Yue Feng
（Guangdong Jiabo Pharmaceutical Co．，Ltd．，Qingyuan，Guangdong 511517，China）
ABSTRACT：To establish an HPLC method for the determination of related substances in edrophonium chloride.HPLC was carried out on Styrene-divinylbenzene copolymer（250 mm×4.6 mm，8μm），with the mobile phase of 7.7g/L tetramethylammonium bromide solution（adjusted to pH 3.0 with phosphoric acid）-acetonitrile（85：15）as the mobile phase.The flow rate was 1mL·min－1，and the column temperature was set at 30 ℃ with the detection wavelength of 281 nm.The related substances could be effectively detected and separated with edrophonium chloride completely.It was linear for the related substance dimethylaminophenol in the concentration range of 0.05～2μg·mL-1.Its recovery was 98.7％.The method is simple，reliable and suitable for the determination of related substances in edrophonium chloride by HPLC.
KEY WORDS：edrophonium chloride；dimethylaminophenol；HPLC；related substance；determination
依酚氯铵为拟胆碱药物，作为神经肌肉阻滞剂的拮抗剂，对胆碱酯酶有拮抗作用。基本作用与新斯的明相似，但作用较弱，作用快而短暂，仅维持数分钟。原料药及其注射剂已载人美国、英国、日本等国家药典[1] [2]。杂质A是依酚氯铵原料药的已知杂质，是合成依酚氯铵的中间体，规定了其限度不得超过0.1％[3]。本文参考有关文献[4]，区别于依酚氯铵注射液的有关物质检测方法，为了提高依酚氯铵原料药有关物质的准确性和检测灵敏度，保证药品质量和用药安全，结合设备情况，建立了对依酚氯铵原料药的有关物质进行HPLC检测的方法。结果显示，本方法系统适应性强，专属性好，误差小，灵敏度高。
1 仪器与试药
1.1 仪器
高效液相色谱仪（LC-20A），岛津；电子天平（BT125D），日本岛津。
1.2 试药
对照品（批号：20-XJZ-65-1，纯度：99%），TRC；依酚氯铵（批号：D030-Z2018001、D030-Z2018002、D030-Z2018003），广东嘉博制药有限公司）；乙腈（色谱纯），SINENCE；四甲基溴化铵，分析纯，阿拉丁；水为纯化水；其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2．1 色谱条件
色谱柱：PLRP-S（250mm ×4.6 mm，8μm）；流动相：乙腈-四甲基溴化铵溶液=15：85（V /V）；流速：1mL·min－1；柱温：30 ℃；检测波长：281 nm；进样量：20μL。
2．2 溶液的制备
2．2．1 供试品溶液：取本品适量，精密称定，加水溶解并稀释制成每1ml中约含依酚氯铵1.0mg的溶液，作为供试品溶液。
2．2．2杂质A溶液：精密称取3-二甲氨基苯酚适量，加乙腈溶解并稀释制成每1ml中约含3-二甲氨基苯酚1.0mg的溶液，作为杂质A溶液。
2．2．3对照溶液：精密量取供试品溶液、杂质A溶液各1ml按1：1的比例混合，用水定量稀释至100ml，取该溶液10ml用水稀释至100ml，作为对照溶液。
2.3系统适用性试验
2.3.1 取杂质A对照品适量，加乙腈配制成浓度约为10μg/ml的杂质A对照溶液；取上述杂质A对照溶液适量、依酚氯铵（批号：D030-Z2018001）适量，加水稀释制成杂质A浓度约为1μg/ml、依酚氯铵浓度约为1mg/ml的混合溶液。取上述混合溶液，进样，记录色谱图。结果显示，各杂质峰面积RSD均小于5.0%，保留时间RSD均不大于1.0%。
2．4 专属性试验
2．4．1 空白干扰：分别取纯化水、乙腈、对照溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，空白溶剂对各杂质测定应无干扰。见图1。
图1 各溶液的HPLC色谱图
2．5 检测限及定量限
取依酚氯铵适量，配制成适宜浓度的溶液，信噪比约为3时为检测限，进样3针，峰面积的RSD值为0。依酚氯铵适量，配制成适宜浓度的溶液，信噪比约为10时为定量限，平行制备6份定量限浓度的溶液，进样测定，峰面积的RSD值为4.5%。
2．6 线性关系考察
取杂质A对照品适量，精密称定，配制浓度为0.05、0.5、1、1.5和2μg·mL-1的依酚氯铵溶液，进样。以浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线。线性方程：Y =0.179X-0.001，r= 0.999。杂质A在0.05～2μg·mL-1浓度范围内，与峰面积呈良好的线性关系。见表1。
表1 线性关系考察结果
2．7 精密度试验
取同批供试品（批号：D030-Z2018001），平行制备6份供试品溶液进行测定，计算各杂质含量的RSD，杂质A均未检出，未知杂质1和未知杂质2含量的RSD分别为2.7%、4.1%。方法重复性良好。由另一分析人员在重复性测定的不同日期平行制备6 份供试品溶液，使用另一仪器进样，杂质A均未检出，未知杂质1和未知杂质2含量的RSD分别为2.7%、4.2%。12 份供试品溶液的杂质A均未检出，方法精密度良好。见表2。
表2 精密度试验结果
2．8 准确度试验
表3 准确度试验结果
取杂质A对照品适量，精密称定，加乙腈溶解制成浓度约为10μg/ml的杂质A对照品溶液。取依酚氯铵（D030-Z2018001）约20mg，精密称定，置20ml量瓶中，平行9份。分别精密量取上述杂质A对照品溶液1.6ml、2.0ml及2.4ml置已称取依酚氯铵的同一量瓶中，制成三种不同浓度的样品加标溶液，每个浓度平行3份，测定样品加标溶液的杂质A含量。9份溶液回收率在93.9%～102.5%之间，平均回收率为98.7%，RSD为3.2%，说明方法准确度良好。见表3。
2．9 稳定性与耐用性试验
2．9．1 稳定性：供试品溶液室温放置0h、4h、8h、12h、24h、48h，于各时间点测定杂质含量。各时间点杂质A含量RSD 为0.02%，供试品溶液在室温条件下放置48h，稳定性良好。
2．9．2 耐用性：在流动相pH变化±0.2、流动相比例变化±5%、柱温变化±5℃，波长变化±5nm，流速变化±0.2ml/min的条件下，测定杂质含量，杂质A含量RSD小于2.0%，方法耐用性良好。
2．10 样品测定结果
采用建立的方法，对自制的3批样品的对照品溶液和供试品溶液进行了检测。结果见表4。在供试品溶液色谱图中按外标法计算依酚氯铵中有关物质杂质A的含量，按自身对照法计算依酚氯铵中其他未知有关物质的含量，试验结果表明，以上所有样品均符合要求。见图2和表4。
图2 各样品的HPLC色图谱
表4 多批样品测定结果
3 讨论
杂质A作为合成依酚氯铵的中间体，结构含有基因毒性杂质标示的警示结构，对人体有一定潜在的危害。笔者建立了HPLC法测定依酚氯铵原料药中杂质A的方法，同时对其他未知有关物质进行定量测定。操作快捷简便，精密度、重复性、稳定性良好，结果准确可靠，可作为依酚氯铵原料药有关物质的检查方法。
参考文献：
[1] 王兰明.拟胆碱药物依酚氯铵的合成[J].化工时刊，1998，12（12）：29-30.
[2] 丁岩冰，孙文娟.依酚氯铵的合成[ J].中国医药工业杂志，1994，25（12）：538-539.
[3] USP 40，Edrophonium 3941.
[4] 马玉贞.依酚氯铵注射液中有关物质的HPLC法测定[J].中国医药工业杂志，2014，45（9）：871-873.
论文作者:陶明锋,谭南奇,李秋婵,田亮,谢春燕,岳峰
论文发表刊物:《基层建设》2019年第14期
论文发表时间:2019/7/29
标签：溶液论文; 杂质论文; 浓度论文; 物质论文; 色谱论文; 精密论文; 含量论文; 《基层建设》2019年第14期论文;