张革平[1]2000年在《不结球白菜CpTI基因遗传转化的研究》文中指出本研究以CpTI抗虫基因为目的基因，以不结球白菜（Brassicacampestris ssp. chinensis Makino）AB耐寒系和短-126品系的带柄子叶为转化受体，以农杆菌介导的方式，转化不结球白菜材料，以获得具有抗虫性状的不结球白菜种质。 带柄子叶在添加0.1mg/L 2，4-D和0.1mg/L NAA的预处理培养基上处理3天，AB耐寒系不定芽分化率由6.0％提高至44.6％，而在短-126品系上则没有明显的效应；卡那霉素对不结球白菜子叶的分化有强烈的抑制作用，Km为15mg/L时产生100％白化外植体：羧苄青霉素不仅不抑制带柄子叶的不定芽分化，反而可使不定芽分化的时间由20天提前至14天；农杆菌侵染浓度的变化对带柄子叶分化影响不大，但是随着共培养时间的延长，芽分化率显著下降。 以不结球白菜AB耐寒可育株品系的带柄子叶为外植体材料，在含有2，4-D 0.1mg/L的预培养基上培养三天后，与农杆菌共培养1～2天，再在含有6-BA 5mg/L和NAA 0.1mg/L的分化培养基上培养20天；经过在含有15mg/L的卡那霉素选择培养基上筛选2次，获得卡那霉素抗性芽；苗经过扩繁、生根，移栽在田间开花、结籽。 以农杆菌Ti质粒为阳性对照，未转化植株为阴性对照，对得到的转化植株进行PCR和PCR-Southern检测；检测结果表明CpTI基因确实存在于转化植株的基因组中。
郑佳秋[2]2009年在《不结球白菜小分子量热激蛋白基因克隆及表达分析》文中进行了进一步梳理遇到高温胁迫时植物体内会产生应激蛋白——热激蛋白,其中植物小分子量热激蛋白含量最为丰富、种类繁多。小分子量热激蛋白的分子量在17-30 kDa之间。高等植物中含有至少6种小分子量热激蛋白,分别定位于细胞质、叶绿体、线粒体、内质网。在常温下植物体内小分子量热激蛋白基因不表达,高温时小分子量热激蛋白则快速积累。近年来,关于高温诱导热激蛋白以及热激蛋白提高植物耐热性的研究取得了重要进展。然而,关于高温诱导热激蛋白基因及其在低温防御中作用的研究相对较少。本研究从不结球白菜中分离到小分子量热激蛋白基因BcHSP,表达模式和功能分析表明,这个基因的表达受高温逆境诱导,高温、低温条件下过量表达对大肠杆菌均有保护作用,构建了过量表达载体进行了转基因初步鉴定,为进一步BcHSP基因研究打下基础。1.利用同源序列设计兼并引物,通过RT-PCR和RACE方法从不结球白菜叶片中克隆到小分子量热激蛋白基因的中间片段,通过5’-RACE和3'-RACE分别克隆到5’片段和3’片段,拼接后设计特异引物扩增到全长722bp cDNA,命名为BcHSP(DDBJ登录号：AB367955),ORF为473 bp,编码157个氨基酸的多肽,理论等电点(pI)为5.31,分子量约为15.98 kDa。核苷酸序列同源性比较发现,BcHSP与芥蓝相似性最高达98%。氨基酸序列进行比对发现,相似性均在65%以上,说明HSP具有高度保守性。HSP的高度保守性说明他们在生物生命活动中具有重要的作用。聚类分析结果显示,BcHSP基因与芥蓝(CAB93512)最先聚为一类,亲缘关系最近,芜菁(AAB72190)单个聚一类、然后与拟南芥(NP-175759)、豌豆(P19243)、大豆(P02519)等聚为一类,最后与水稻(EAY89381)聚类,亲缘关系相对较远。实时定量检测表明,不结球白菜BcHSP转录表达受热激诱导,以叶片中表达量最高,BcHSP在不结球白菜叶片中表达特征说明它可能与植物叶片的耐热性关系更为密切。2.不结球白菜幼苗经42℃热激后,其幼苗的耐冷性明显增强,膜伤害程度降低。热激处理组的冷害指数仍低于对照组,差异显著(P<0.05),并且经热激的幼苗鲜重比对照增加了51%,苗高增加了40%。热激使不结球白菜幼苗在冷胁迫和恢复生长过程中电解质的渗透和丙二醛(MDA)含量均比对照大为下降,差异显著(P<0.05),显示热激降低了不结球白菜幼苗的脂质过氧化水平,并且使幼苗的抗氧化系统中的关键酶超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)的活性在冷胁迫及恢复生长2d时仍保持比对照组高,差异显著(P<0.05)。热激处理后与对照组的幼苗SOD同工酶的电泳图谱显示,热激诱导使幼苗在低温胁迫前后SOD同工酶谱带均比对照组强,以上与冷害相关的生理生化指标测定结果显示,热激处理增强了不结球白菜幼苗的耐冷能力。荧光实时定量分析表明BcHSP的表达量与耐冷性相一致。低温(4℃)胁迫下,在大肠杆菌中异源表达BcHSP可维持大肠杆菌较高的细胞活力,这些结果表明BcHSP合成与不结球白菜幼苗耐冷性的提高有关。3.本实验从不结球白菜中克隆BcHSP基因的cDNA完整编码区序列,用来构建植物过量表达载体,并将表达载体转化到农杆菌菌株LBA4404中,以根癌农杆菌介导法转化不结球白菜‘苏州青’,GUS组织化学染色,发现大多数材料均出现了蓝色斑点,呈阳性,说明农杆菌的侵染效率较高,初步验证植物表达载体已经整合到植物组织中。PCR检测结果表明：目的基因已经整合到苏州青基因组中,为深入研究BcHSP基因功能创造了条件。
贾艳丽[3]2014年在《农杆菌介导的白菜高效遗传转化体系研究》文中研究指明随着白菜全基因组测序的完成，白菜开始成为植物功能基因组研究的模式植物，白菜基因的功能研究需要有一个高效的白菜遗传转化体系为基础。然而，白菜遗传转化困难，已成为影响白菜基因挖掘和功能研究的一大障碍。建立白菜的高效遗传转化体系具有重要的理论和实际意义。本研究通过比较11个白菜品种的下胚轴再生频率，筛选出6种再生频率较高的基因型：不结球白菜品种南京矮脚黄（N1）、结球白菜品种天津2号（N2）、华良5号（N3）、红菜薹品种十月红（N4）、黄秧小白菜（N5)、和汉阳青小白菜（N11)，并探讨了适宜各基因型遗传转化的卡那霉素的使用浓度。同时以N11下胚轴为外植体，研究了苗龄、共培养基的pH值、激素浓度和AgNO3浓度等因素对白菜遗传转化频率的影响，优化了农杆菌介导的的白菜遗传转化体系。以该遗传转化体系为基础，将抗虫基因Cry1Aa和SAD干扰载体分别导入到了白菜品种，成功获得转基因白菜植株。主要研究结果如下：1.从11个白菜基因型中筛选出6种再生频率较高的基因型，并确定了N1、N2、N4、N11基因型的适宜筛选剂Kan浓度应为25mg/L，N3和N5品种的适宜筛选剂Kan浓度应为20mg/L。2.优化了农杆菌介导的遗传转化体系：以N11下胚轴为外植体，确定了最佳分化培养基激素浓度为Zeatin2.0mg/L、IAA0.1mg/L和AgNO30mg/L，共培养基最适pH值为5.8。3.获得抗虫转基因白菜材料：构建了过表达载体PBI121-Cry1Aa，利用农杆菌介导法将抗虫基因Cry1Aa导入到N1、N2、N4和N11白菜品种中，平均转化频率分别为1.65%、0.52%、0.13%和3.65%。其中N11基因型共获得63株转基因抗性苗，经PCR鉴定其中61棵均为阳性转基因株，即抗性株阳性率达96.8%。N11基因型转基因T1后代5个株系植株分别经PCR、Southern blotting杂交证实，抗虫基因已经整合到汉阳青小白菜基因组中；实时荧光定量PCR证实，抗虫基因在转基因植株T1后代体内已正常进行了转录；网室和离体抗虫鉴定结果表明，5个株系与对照组相比，小菜蛾和菜青虫的幼虫死亡率均具有显著差异（P<0.05)，即均具有显著地杀虫效果，并且各株系之间的抗虫性没有明显差异。4.获得SAD干扰载体的转基因白菜材料：为了获得高硬脂酸转基因材料，构建了SAD基因的干扰载体（SAD-RNAi）载体。基于本研究建立的农杆菌介导的白菜遗传转化体系，将反向重复抑制片段转入到汉阳青小白菜中，平均转化频率为1.81%，共获得转基因T0代植株15棵，经PCR验证均为阳性抗性苗。
马伟[4]2002年在《大白菜转芜菁花叶病毒外壳蛋白基因的研究》文中指出大白菜是人们喜爱的大众蔬菜。而以芜菁花叶病毒(TuMV)为主的大白菜病害一直没有得到很好解决。蔬菜遗传转化可以利用的目的基因很多，但在大白菜转基因方面研究工作却很少。利用农杆菌介导法转化大白菜抗病基因的研究工作在国内外未见报道。本课试验采用农杆菌介导法将TuMV-CP基因导入大白菜中，建立了高效的大白菜离体再生、遗传转化体系，并对转基因植株进行分子生物学检测，证实得到的再生植株为转基因植株，目的基因已在部分植株上表达。同时，对转基因植株的后代进行检测，分析该基因所控制性状的遗传稳定性以及基因表达情况，为大白菜基因工程抗病育种提供理论依据。 试验得到结论如下： 1．建立了高效的大白菜离体再生体系 5日龄的大白菜二牛心品种的子叶，置于诱导芽分化的培养基(MS+5mg/L6-BA+0.5mg／L NAA+5mg/L AgNO_3)上，诱导不定芽数最多。置于生根培养基(1／2MS+0.2mg/L IBA)，生根效果好，得到的再生植株多。 2．建立了大白菜遗传转化体系。 a．确立了大白菜转化过程中筛选剂及抑菌剂的种类及浓度。筛选剂为卡那霉素，最适筛选浓度为10mg／L；头孢曲松那的抑菌效果最好，最适浓度为300～500mg／L。 b．确立了农杆菌介导转化过程中基因型是影响转化率的主要因素。通过极差分析，基因型为“二牛心”，菌液浓度15倍的，外植体为子叶，感染方法为浸泡法是最佳的组合。农杆菌与外植体共培养的时间为28h。 c．试验表明所用的四个大白菜品种，品种“二牛心”子叶再生频率较高，品种“东农901”下胚轴再生频率较高。 d．比较了R1000与EHA105介导转化对抗性芽的影响：发根杆菌在浸染外植体时得到的抗性芽较多，得到的转基因植株相对少。而根癌农杆菌浸染外植体时得到抗性芽相 马 伟 摘 要2002年5月对少，得到的转基因植株相对多。 3．获得了大白菜抗病转基因植株。 大白菜转基因植株TO代，经PCR、PCR－Southern检测己证实导入目的基因己整合到植物基因组中，得到转基因植株15株己完全整合，但经RTNR检测，只有12株表达，证明一部分植株中有基因沉默现象。大白菜转基因植株乃代，经PCR、PCRSouthl检测，后代有分离现象，分离比例趋于3：l，符合盂德尔分离规律。 4．接病毒实验 经病毒接种试验表明：转基因＊代植株接种hlMv病毒后，发病率和病情指数明显低于对照品种。
侯喜林, 史公军[5]2005年在《“十五”期间我国蔬菜分子育种研究进展》文中进行了进一步梳理从分子遗传图谱的构建、遗传多样性分析,基因标记及定位,基因克隆及表达,杂种纯度鉴定与品种的DNA指纹分析以及基因工程育种等几个方面对“十五”期间我国蔬菜分子育种取得的进展进行了综述,对存在的问题进行了分析,并提出展望。
参考文献：
[1]. 不结球白菜CpTI基因遗传转化的研究[D]. 张革平. 南京农业大学. 2000
[2]. 不结球白菜小分子量热激蛋白基因克隆及表达分析[D]. 郑佳秋. 南京农业大学. 2009
[3]. 农杆菌介导的白菜高效遗传转化体系研究[D]. 贾艳丽. 中国农业科学院. 2014
[4]. 大白菜转芜菁花叶病毒外壳蛋白基因的研究[D]. 马伟. 东北农业大学. 2002
[5]. “十五”期间我国蔬菜分子育种研究进展[J]. 侯喜林, 史公军. 中国蔬菜. 2005