李焕秀[1]2005年在《番茄RAPD聚类分析、抗ToMV番茄cDNA文库构建和分离RGA的研究》文中研究表明番茄病毒病是番茄的重要病害之一,是世界性的病害,危害十分严重。番茄花叶病毒(ToMV)又是病毒病中危害最严重、危害作物种类最多的病毒病,严重影响番茄的产量和品质。选育抗ToMV的品种是防治番茄病毒病最有效的途径。选育抗ToMV的番茄材料可以依靠传统的抗病育种方法,也可以利用抗病基因工程。随着植物抗病机制的分子生物学和抗病基因工程研究的深入发展,植物抗病基因的分离和转化为高效育种展示了广阔前景。 本试验以20个番茄材料为试材,应用田间调查和实验室酶活性、同工酶等方法,对番茄材料对ToMV的抗性进行了鉴定,研究了过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)酶液提取及反应适宜条件;应用RAPD技术对20个番茄材料进行亲缘关系的鉴定;用抗ToMV番茄材料,构建了抗病番茄cDNA文库;根据烟草和拟南芥抗病基因同源保守序列设计简并引物,分离番茄基因组DNA中的抗病基因类似片段RGA。通过研究,得出以下结果: 1、番茄材料ToMV抗性分类 对国内主栽番茄材料和四川农业大学收集的番茄育种材料共20份进行了ToMV抗性研究。根据品种资料介绍及田间试验和室内接种ToMV后番茄发病率和病情指数鉴定结果,以病情指数为主要指标,参照ToMV抗性分级标准,初步可将20份番茄材料对ToMV的抗性分为四类。 ① 高抗材料(HR):黄圣果和美国番茄; ② 抗性材料(R):中杂9号、W_(262-4)、黄叶番茄和Oh-2-2-11; ③ 耐病材料(T):L-402、美味樱桃番茄、加州大红1号、早红宝、宝大903和川杂-10; ④ 感病材料(S):今科红玫、大红番茄合作903、加州大红4号、改良美国903、宝岛巨星、W_(262)、Oh-2-2-6和金刚2号大番茄。
苏君芝[2]2004年在《番茄对ToMV抗性与氧化酶活性关系的研究》文中提出本试验以20个番茄品种或材料为试材，研究了过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)酶液提取及反应适宜条件；应用POD同工酶对20个番茄材料进行亲缘关系的鉴定；对20份材料苗期室内接种ToMV后进行抗病性鉴定以及接种两周后所有材料POD、PPO、苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性变化的研究，得出以下结论： 1．抗性分类：根据品种背景资料介绍和室内接种鉴定分析，可初步将所有参试材料抗性分为叁类：① 抗病品种：中杂9号、早红宝、W_(262-4)、黄化黄叶番茄、黄圣果和美国番茄：② 耐病品种：美味樱桃番茄、加州大红1号、川杂-10和Oh-2-2-11；③ 感病品种：L-402、今科红玫、大红番茄合作903、加州大红4号、改良美国903、宝岛巨星、宝大903番茄、W_(262)、Oh-2-2-6和金刚2号大番茄。 2．氧化酶活性与抗病性关系：所有材料接种株的POD、PPO和PAL的活性均比未接种对照株的高，POD的酶活性增加倍数与抗病性呈正相关；PPO的酶活性增加倍数与抗病性呈负相关；PAL的酶活性变化与抗病性无必然联系。 3．POD和PPO同工酶与抗病性关系：接种后所有材料的POD和PPO同工酶谱带染色的深浅及谱带宽度都发生了变化，抗性品种比感病品种多出现1～3条新的POD同工酶谱带；感病品种比抗性品种多出现1～2条PPO同工酶谱带。 4．不同浓度分离胶分离效果：POD、PPO同工酶皆以10％的分离胶分离效果最好，得到的酶带最清晰，有利于进行相关分析。 5．亲缘关系：番茄属20份材料的遗传相似系数在0.54～1.00，当取相似系数为0.83时，可以将它们分为4大类。 6．最佳反应条件：(1) POD和PPO酶液提取及反应的最佳磷酸缓冲液的pH为6.0；(2) 10℃以下时PPO反应的最适时间为10min；(3) 以儿茶酚为底物，PPO在398nm波长下有最大吸光值。 综合各分析结果，接种ToMV后，不同抗性的番茄品种的PPO、POD活性及其同工酶变化具有明显的趋势，可以将其作为抗病育种苗期鉴定的重要生化指标。
李敏[3]2005年在《番茄抗花叶病毒（ToMV）的鉴定及其类似序列分离》文中认为番茄(Lycopersicon esculentum Mill),属于茄果类番茄属,原产秘鲁厄瓜多尔一带的喜温植物。番茄适应性强,果实风味独特,营养丰富,世界上重要的农作物之一。番茄花叶病毒病(ToMV)是一种世界性的病害,分布广,危害严重,造成品质下降,产量锐减。按常规培育、改良品种周期较长、效率低,目前为止没有行之有效的防治ToMV的措施。在生物技术迅速发展的今天,应用转基因技术不仅加速育种的进程,而且避免了不良基因留给后代。 本研究应用20个番茄为材料,材料来源:四川农业大学保存的种质资源和四川优良的栽培品种。研究的主要内容:田间自然条件下和室内接种ToMV后对各材料病情指数的调查,并对接种前后抗性酶(过氧化物酶、多酚氧化酶、苯丙氨酸解氨酶)的活性进行测定及显着性分析,鉴定20个材料对ToMV抗性程度。同时应用RAPD对20个番茄材料进行亲缘关系的分析,根据植物抗病基因的同源性和保守序列的特性及前人的研究设计特异引物进行PCR扩增。研究结果如下: 1.通过田间、室内发病指数的调查结果与分析及抗性酶活性测定,鉴定20个材料对番茄花叶病毒病的抗性程度,将材料分成叁类:第一类为抗病材料:中杂9号、早红宝、W_(262-4)、黄化黄叶番茄、黄圣果和美国番茄;第二类为耐病材料:美味樱桃番茄、加州大红1号、川杂-10和Oh-2-2-11;第叁类为感病材料:L-402、今科红玫、大红番茄合作903、加州大红4号、改良美国903、宝岛巨星、宝大903番茄、W_(262)、Oh-2-2-6和金刚2号大番茄。 2.RAPD聚类分析结果:聚类距离从0到0.72,以0.36为标准将20个参照材料分为叁大类。第一类为美味樱桃番茄、Oh-2-2-11、黄化黄叶番茄。第二类为中杂9号;最后一类为L-402、今科红玫、加洲大红番茄4号、改良美国903、宝岛巨星、早红宝、宝大903、大红合作903、加洲大红番茄1号、W_(262)、中杂—10、Oh-2-2-6、黄圣果、金刚2号大番茄、W_(262-4)、美国番茄。 3.根据植物抗病基因的同源性和保守序列的特性及前人的研究设计两对特异引物对筛选材料扩增,结果如下:抗病材料扩增出一条比较亮的谱带,耐病材料扩增出一条相对较暗的谱带,扩增条带分子量的大小相似;感病材料没有扩增出谱带,我们初步认为这条带是抗番茄花叶病毒病的类似序列。
李焕秀, 苏君芝, 卞青山[4]2004年在《番茄品种对ToMV抗性与氧化酶活性的关系研究》文中研究说明测定了6个不同抗性番茄品种接种ToMV两周后POD、PPO和PAL活性,以及POD同工酶酶谱的变化。结果表明:抗、感病品种接种ToMV后POD、PPO和PAL活性均比相应未接种株高,而且POD、PPO和PAL的酶活增长率与抗病性成负相关;感病品种接种株的POD同工酶谱带数都比相应未接种株多出2条酶带,而抗病品种只增加了1条酶带。
于翠[5]2004年在《番茄花叶病毒（ToMV）和黄瓜花叶病毒（CMV）单克隆抗体制备及ToMV在烟草上致病分子机理研究》文中进行了进一步梳理番茄花叶病毒(ToMV)是烟草花叶病毒属(Tobamovirus)的重要成员。由于ToMV与烟草花叶病毒(TMV)具有很近的血清学关系，基于多抗血清的检测方法较难区分二者。利用ToMV提纯病毒作为免疫原，通过杂交瘤技术获得4株ToMV的单克隆抗体，其中2株为ToMV特异性单抗，2株能同时检测ToMV和TMV。4株单抗腹水ELISA效价在1：32000-1：1024000之间。Western印迹分析表明，只有2株单抗与ToMV 17.6 kDa的外壳蛋白亚基有特异反应，而另2株无反应，推测它们是针对构象决定簇的抗体。建立了叁抗体夹心ELISA(TAS-ELISA)检测ToMV和TMV的方法，结果表明4株单克隆抗体检测病汁液的稀释度均能达到1：2000倍以上。以制备的单抗和建立的TAS-ELISA方法对杭州市郊和云南部分地区的烟草、辣椒、番茄等田间发病样品进行检测，结果发现田间样品以TMV侵染为主。 ToMV和TMV亲缘关系很近，但二者在含N基因烟草上所产生的枯斑大小有显着差异。为确定TMV和ToMV在含有N基因烟草上症状差异的决定因子，比较了TMV、ToMV及用ToMV运动蛋白(MP)基因精确置换TMV MP基因后获得的重组病毒T／OMP在不同寄主上的症状差异，发现T／OMP在含N基因烟草上产生的枯斑大小与ToMV相似。系统分析比较了TMV、ToMV和T／OMP外壳蛋白(CP)和MP在植物体内的积累水平，发现3种病毒的CP和MP在测定的时间内没有明显的差异。Northern印迹分析表明TMV和T／OMP在原生质体中的复制水平也没有差异。同时，测定了TMV、ToMV和T／OMP接种后烟草体内防御相关酶(PAL、POD和PPO)的活性变化，T／OMP和TMV所诱导酶活性水平变化趋势基本一致，而与ToMV有所差异。以上结果表明ToMV和TMV在含N基因烟草上的症状差异可能是由MP基因的功能差异决定的。 黄瓜花叶病毒(CMV)是世界范围内广泛分布的最具经济重要性的植物病毒之一。CMV具有许多株系或分离物，根据不同的鉴定方法和分类系统，不同的分离物主要被划分为两个亚组。以CMV亚组Ⅰ分离物CMV-RB和CMV亚组Ⅱ分离物CMV-Z分别免疫BAL B／C小鼠，通过杂交瘤技术共获得9株稳定分泌单克隆抗体的细胞株。间接ELISA方法测定表明9株单抗的腹水效价在1：32000-512000之间。以TAS-ELISA方法检测单抗的特异性，结果发现6株单抗能特异地与CMV亚组Ⅰ或亚组n分离物发生反应;2株单抗既能与亚组I也能与亚组H的分离物反应，1株单抗只能与提纯病毒反应，而不能与粗汁液中的病毒反应。 利用其中的8株CMV单抗建立了快速区分CMV不同亚组分离物的TAS一ELISA检测体系。与间接ELISA方法相比，TAS一ELISA在检测亚组I分离物时二者没有显着的差异，但对于亚组n分离物，TAS一ELISA的检测效果要优于间接ELISA。利用TAS一ELISA方法测定了来自不同地区的197份田间样品，结果发现130份样品为CMV，其中亚组I分离物为121份，占93 .1%，而亚组11分离物为9份，占6.9%。还建立了区分CMV不同亚组分离物的免疫捕获反转录PCR(IC~Rl’- PCR)检测体系，并对TAS一ELISA反应中为阳性反应的CMV分离物进行了检测，结果表明TAs一ELIsA检测为cMV亚组I的样品仅能用亚组I特异性引物扩增出约500bP的条带，而TAS一ELISA检测为亚组n的样品也只能用亚组n特异性引物扩增出约600bp的条带。对其中的10个CMV分离物的IC一RT一PCR产物进行克隆和序列测定，序列分析表明TAS一ELISA、IC一RT一PCR和序列测定对CMV亚组的划分是一致的。TAS一ELISA和IC~R下PCR快速区分CMV亚组I和亚组H体系的建立，为研究CMV的变异进化提供了简便的方法，对了解黄瓜花叶病毒不同亚组分离物在我国的发生分布与流行情况具有重要意义。
姜国勇[6]2003年在《番茄Tm-2～2基因在烟草中的表达及其编码蛋白特异氨基酸决定对病毒的抗性》文中进行了进一步梳理番茄(Lycopersicon．esculentum Miller)的Tm-2~2基因是一个抗Tobamovirus属病毒、属于NBS-LRR家族的抗病基因，与Tm-2基因均来源于野生种L．chilense，它位于第九号染色体长臂、靠近着丝点处，与基因nv紧密连锁，Tm-2~2和Tm-2与感病基因tm-2互为等位基因，拥有Tm-2~2基因的番茄感染病毒株系ToMV-2a，抗其它5个Tobamovius属病毒。Tm-2~2基因及其等位基因Tm-2和tm-2的ORF全长2586bp，编码有861个氨基酸，分子量为98.8kDa，PI值为8.4。Tm-2~2与Tm-2、tm-2基因分别有99.7％和97.7％的同源性。Tm-2~2基因及其等位基因在N末端的前90个氨基酸没有任何差异；第91-483个氨基酸构成了NBS结构域，Tm-2~2与Tm-2、tm-2基因的编码蛋白分别有2个和6个氨基酸的差异；在LRR(Leucine-rich Repeats)结构域的15个重复序列中，Tm-2~2与tm-2有32个氨基酸的差异，与Tm-2有2个氨基酸的差异，这种差异氨基酸的不均一分布表明Tm-2~2具有抗病特异性。 为了了解Tm-2~2基因的特性、功能及抗病机制，研究工作从叁个方面进行，首先将Tm-2~2基因转化同科异属的烟草SR1，以确定Tm-2~2基因在模式植物的表达的可能性和功能的完整性。其次，通过氨基酸序列和结构的比较，确定Tm-2~2基因的编码蛋白与ToMV病毒在抗病反应中相互识别的特异氨基酸及其功能；然后，应用重组DNA技术，互换Tm-2~2基因和tm-2基因的对应结构域，构建嵌合基因，获得嵌合蛋白表达的转化体，验证Tm-2~2编码蛋白中变异氨基酸的作用。结果如下： 1．Tm-2~2抗病基因转化烟草SR1共获得了13个拥有自主启动子和14个具有CaMV35S启动子的纯合转基因株系，两种类型的转化体除了对ToMV-2a感病外，对接种的其它5个病毒株系ToMV-0、ToMV-2、ToMV-1、TMV-U和TMV-Cg均表现抗病。这表明，Tm-2~2基因可以在不同遗传背景的受体细胞中自主表达，同科不同属的物种之间的基因转移并不影响基因的表达和抗病特异性。Tm-2~2基因在烟草的表达有叁个特点：1)．不受基因型的影响，在纯合和杂合状态下均表现抗病特异性；2)．Tm-2~2基因在烟草基因组DNA为显性单拷贝的基因整合，并在自交后代中稳定遗传，其后代分离符合孟德尔遗传分离规律；3)．Tm-2~2基因自主启动子与CaMV 35S启动子的表达作用不同，pTM47转化体感染ToMV-2a时表现为细胞凋亡的感病症状。 2．为了进一步了解Tm-2~2的抗病机制，对两类转化体植株抗病反应福建农林大学博士学位论文摘要中相关的MP反应蛋白基因伽护204)、病程相关蛋白基因(朋一Ia)和RNA决定的RNA多聚酶基因(R办护)进行了检测，结果显示:1).pTM47转化体对接种的ToMV一2a表现感病，没有诱导PR一1a基因的表达;pTM47转化体对接种的病毒株系ToMV一0、ToMV一1、ToMV一2、TMV一U、ToMV一Cg表现抗病，其抗病反应能够诱导PR一1a基因的表达;2).pTM47转化体和pTM49转化体接种ToMV一o、ToMV一2和ToMV一2a毒株以后，均能诱导A刀尸204基因的表达;不能诱导RdRP基因的表达。因此，可以认为Tm一22基因的编码蛋白与复合蛋白转录因子有关，在抗病反应中能够诱导五刃沪204和尸尺一Ia基因的表达，与RdRP基因的转录没有直接的联系。根据R基因的护卫学说，Tm一22与MIP204可能拥有相互协同的护卫关系，并在抗病反应中诱导病程相关基因的表达。 3.对Tm一22基因及其等位基因编码蛋白的氨基酸序列进行了分析，并比较了已经公布的R基因的同源序列，结果显示:l).Tm一22基因及其等位基因的编码蛋白属于LZ一(NB一ARC)一LRR结构的膜蛋白，在CC结构域的90个氨基酸中，有4个保守序列拥有(FR)XLXXX的亮氨酸拉链结构(Lz，Leueine 21即er Motifs);2).在NBs结构域的392个氨基酸中，由9个具有ARC结构的基序组成，并拥有叁个保守序列vv大JXGMXGXGKTTLA、L(1尸犷)(V几)LDDV(W月O)和SFJIXTTRDXXV，分别被称为P一loop、激酶2和激酶3a结构，与人类(APaf-1)和线虫(C ED一4)的同源结构极其类似，表明Tm一22基因的编码蛋白是一个具有受体结构、激酶特性的膜蛋白，其功能是参与细胞内的离子交换、磷酸化和蛋白之间的特异反应。Tm一22基因与tm一2基因编码氨基酸的差异没有发生在这叁个保守序列之中;3).亮氨酸重复序列(LRR，Leucine一rich RePeats)位于C末端，共有354个氨基酸、巧个LRR组成，其结构为LxxL双LxxLxL双(N/C/T)x(x)LxxIP。。Tm一夕基因的编码蛋白在该区与tm一2有32个氨基酸的差异，主要集中在第10、11和12个亮氨酸重复序列中，与Tm一2有两个氨基酸的差异，仅仅是位于第12个亮氨酸重复序列中的767和769两个位点，这表明:第一，LRR是Tm一22基因和Tm一2基因编码蛋白对病毒识别的特异区段;第二，767和769两个位点的差异氨基酸是Tm一22基因和Tm一2基因编码蛋白对病毒识别的特异位点。 4.应用分子生物学方法和DNA重组技术，构建4对互换DNA片断的嵌合基因，经遗传转化、分子鉴定和基因测序，获得嵌合基因表达的转化体烟草，ToMV一O、ToMV一2和ToMV一2a叁个病毒株系接种结果表明:福建农林大学博士学位论文摘要1).只含有Tm一22编码蛋白第6一15个LRR的四个嵌合基?
李一星[7]2010年在《番茄抗病毒相关基因的克隆与比较分析》文中研究表明番茄是我国普遍栽培的重要经济作物,常受到番茄花叶病毒(Tomato mosaic virus,ToMV)和黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)等病毒侵害,研究病毒侵染机理对病害控制具有重要意义。本研究克隆了番茄的抗病毒相关基因,分析了该基因与上述两种病毒侵染的相关性。ToMV-N5是本实验室从番茄上分离获得的一株ToMV。寄主生物学研究表明,该病毒株侵染不同番茄品种产生的具有明显差别的症状。其侵染合作903品种可引起新叶坏死,在中蔬4号品种上则为轻花叶。因此,我们推测这与不同番茄品种的抗病基因Tm2类型有关。Tm2是番茄中一类对ToMV具有抗性的抗病基因,包括抗病基因Tm-2~2、Tm-2和感病基因tm-2叁个等位基因,两个抗病基因在抗病反应中呈现坏死斑和系统坏死症状。本研究克隆鉴定了合作903和中蔬4号两个番茄品种的Tm2基因,结果显示:合作903番茄是一个同时含有抗病基因Tm-2~2和感病基因tm-2的杂合型番茄,中蔬4号番茄仅含有感病基因tm-2。两个番茄品种在该基因位点有较大差别,认为ToMV-N5侵染两种番茄的症状差异与该基因的类型密切相关。CMV-Fny在番茄上的典型症状为花叶及叶片线性化。寄主生物学结果显示,病毒株与ToMV-N5在合作903番茄上存在强烈地干扰作用:番茄植株接种CMV-Fny 6~8天后再复合侵染ToMV-N5,则不能产生坏死症状,叶片呈花叶及线性化,并且干扰作用不论CMV-Fny是否携带卫星RNA都稳定存在,推测这与植物病程相关蛋白(Pathogenesis Related Protein,PR)有关。PR是植物受病原物侵染或环境因素影响时诱导产生的一类免疫蛋白,在寄主抗病防卫反应过程中发挥重要作用,并有研究表明PR的诱导产生与病原物侵染症状有关。本研究对CMV-Fny和ToMV-N5单独侵染及复合侵染植株的PR-1a1、PR-2基因mRNA水平的表达进行检测。结果显示:CMV-Fny单独侵染和与ToMV-N5复合侵染的植株中均未发现PR-1a1和PR-2的表达,仅在ToMV-N5单独侵染表现坏死症状的植株中检测到了两基因的表达。PR-1a1和PR-2在单独侵染及复合侵染植株中的表达差异性,说明两个基因与ToMV-N5引起的番茄坏死症状相关,而CMV-Fny的预先接种则阻碍了上述两个基因的表达。
张锋[8]2005年在《纳豆激酶植物表达载体的构建及番茄遗传转化体系的建立》文中认为番茄是世界上栽培最广泛,年产量最高的蔬菜作物之一,也是遗传学和生物工程等学科研究中的重要对象和模式植物,其研究结果常常被借鉴用于其他作物上。截至1997年底,全世界共有48个转基因番茄品种进行商业化生产。目前,利用番茄作为生物反应器生产植物疫苗、基因工程药物和功能食品的研究正成为番茄基因工程研究的一个热点。而纳豆激酶是一种由纳豆枯草杆菌(Bacillus natto)产生的具有纤溶活性的丝氨酸蛋白酶,其来源于日本的传统食品—纳豆(natto)。国内外的研究结果表明,NK可有效地分解血栓的主要成分——纤维蛋白,极有可能开发成为新一代理想的溶栓药物。因此,本试验旨在建立根癌农杆菌介导的高效的番茄遗传转化体系,为用植物作为生物反应器来获取纳豆激酶蛋白提供一条新途径,现取得的研究成果如下: 1. 根据GeneBank里公布的纳豆激酶基因序列设计引物,并分别在两端增加了BamHI酶切位点,利用纳豆芽孢杆菌菌液进行PCR 反应,通过试剂盒回收纯化提取NK 基因,并和PBST 载体连接,从而成功地克隆到了纳豆激酶基因;测序结果表明,克隆的NK 基因大小为1143bp,共编码381 个氨基酸,其与GeneBank 中报道的序列(AF368283)同源性达到99.7%以上,产生突变的3 个碱基,并没有影响到纳豆激酶的纤溶活性。 2. 利用质粒pBPC47、质粒pCAMBIA1300 和质粒pMG15 进行纳豆激酶基因NK 表达载体的构建。PCR 反应和酶切检测证明,目的基因片段正向插入载体pCAMBIA1300,从而成功的构建了表达载体pCAMBIA-nk。 3.采用经典冻融法转化pCAMBIA-nk 表达质粒,将其导入到农杆菌LBA4404 中;并利用农杆菌介导作用,将质粒pCAMBIA-nk 导入番茄,通过潮霉素筛选得到了大量的抗性愈伤组织,并进一步进行分化、生根、炼苗培养,最终得到了7 株再生番茄苗,转化率最高达到7.52‰。 4. 以载体质粒DNA 为阳性对照,未转化植株DNA 为阴性对照,对得到的再生植株进行PCR 反应。检测结果表明:有7 株扩增出1146bp 的条带,与质粒扩增出的条带位置相同,初步说明外源基因NK 已整合到番茄基因组中。
牛颜冰[9]2003年在《烟草抗病毒基因工程研究》文中指出病毒病是农作物的主要病害之一，素有植物“癌症”之称，难以防治。将病毒基因组上基因的cDNA转化植物获取抗病毒工程植株是当前防治病毒病害的重要途径。但使用这种方法获得高抗转基因植物的几率较小，因而寻找一种更高效、经济的获取抗病毒转基因植株的方法已是当务之急，而RNA沉默机制的揭示为我们提供了新希望。本研究以在植物体内转录出RNA沉默的高效诱导因子-dsRNA为目标，将黄瓜花叶病毒部分复制酶基因和番茄花叶病毒移动蛋白基因以反向重复的方式与大豆内含子相连，并定向插入到植物表达载体pBIN438上35S启动子下游；在农杆菌介导的瞬时表达法预测所构建的重组载体对病毒侵染具有很强的干涉效应后，以农杆菌介导法转化烟草，分别获得了转黄瓜花叶病毒部分复制酶基因和番茄花叶病毒移动蛋白基因的转基因烟草，并对这两种转基因烟草植物进行了抗病性及抗性机制初探，具体结果如下： 1 黄瓜花叶病毒部分复制酶基因的反向重复植物表达载体构建 根据已报道的黄瓜花叶病毒(CMV)Fny分离物基因组的核苷酸序列设计特异性引物(在上游引物上引入SalⅠ酶切位点，在下游引物上引入ClaⅠ酶切位点)，以CMV Fny RNA2的全长cDNA克隆pFny209为模板，扩增出CMV的部分复制酶(△Rep)基因，将扩增的片段克隆到pUCm-T上获得重组克隆pUCm-△Rep，用PstⅠ和BamHⅠ酶从重组载体pUCm-△Rep上切下反向插入的△Rep基因，用△Rep基因中引入的SalⅠ位点和pUCm-T上的SalⅠ位点切下正向插入的△Rep基因。将反向△Rep基因定向插入含有正向大豆内含子(intron)的pBlue SK重组质粒(pSK-In)(由丹麦Johansen教授提供)上，接着用SalⅠ和BamHⅠ将包括Intron在内的片段切下，定向插入同样酶切开的pBIN438上，获得重组质粒pBIN-In-△Rep，随后将所得正向△Rep基因插入用SalⅠ切开且已去磷酸化的pBIN-In-△Rep上，获得了含反向重复CMV△Rep基因的植物双元重组表达载体pBIN-CMV△Rep(i/r)。 2 番花叶病毒移动蛋白基因的反向重复植物表达载体构建 根据已报道的番茄花叶病毒(ToMV)MP基因的核苷酸序列设计特异性引物(在上游 浙江大学博士学位论文 烟草抗病毒基固工程研究引物上引入 Bhl酶切位点），以 T。MV SI分离物的全基因组克隆（本实验室提供）为模板，扩增出 ToMV M基因，将扩增的片段分别克隆到 pGEM－T easy和 pUCm－1”上获得重组克隆 pGEM－W和 pUCm－M用 APal和 Sail酶从重组载体 pGEM－W上切下正向插入的ToMV N用 PStl和 foal从重组载体pUCm－N上切下反向插入的ToMV i将ApaI和 Sal酶切下的正向 MP基因定向插入同样酶切开的 pSK二n上，获得重组质粒pSK二，再将 Pstl和 Xbal从 pUCm1上切下的反向 MP基因定向插入同样酶切开的重组质粒 pSKJIMP上，获得含有反向重复 TOMV MP基因的重组质粒 pSK1OMV MP （i／r），随后用 BamH将含 Intron在内的 MP基因的反向重复片段切下，插入也用 Ban；HI切开且已去磷酸化的 pBpo438上，获得了含反向重复 TOMV M基因的植物双元重组表达载体叼IN－ToMV MP（i／r）。3植物双元重组表达载体转化农杆菌 用叁亲交配法将含八R印门肋和 W门／r）基因植物双元表达载体幽tw－CMVARer 门／r）和 pBIN1OMV MPO／r）分别转入根癌农杆菌 EHA105菌株中，通过 PCR和酶切鉴定阳性的转化子用于非转基因烟草的瞬时表达或烟草的转化。4 目的基因的瞬时表达和对相关病毒的抗病性分析 用农杆菌浸润法在烟草的叶片组织中瞬时表达 CMVAR叩基因和 TOMV MP基因dSRNA，发现表达dSRNA的植物细胞可以阻止相关病毒的侵染，该方法的建立为快速预测重组载体的抗病毒效应提供了依据。5转基因烟草植株的获得 在农杆菌介导的瞬时表达法预测所构建的载体对病毒侵染具有很强的干涉效应后，；将含 CMVMopO／r）基因和 TOMV NO／r）基因的农杆菌与烟草叶盘共培养。经卡那霉素抗性筛选分别获得转 CMV凸Rop口／r）基因和 TOMV N一／r）基因的再生植株 40株和 47株，所有植株的 PCR检狈均为阳性；部分植株的 Southern印迹杂交表明 CMV＊R叩（i／r）基因和 T。MV N臼／r）基因已整合到烟草基因组中。但多次实验均未能检测出拷贝数，原因不详，进一步实验还在进行中。6转基因烟草植株的抗病性分析 用删V－PI、CMV－Fny和 CMV－RB的病汁液接种 40株伽V－FnyAR印（i／r）的转基因烟草，症状观察和 ELISA检测表明，同一转基因烟草植株对CMV分离物的抗性反应相似， 浙江大学博士学位论文 烟草抗病毒基因工程研究但不同转基因烟草植株对＊＊V的抗性强度不同。我们将其划分为叁种抗病表现型：免疫型（植株在整个生育期未检测到病毒），抗病型（植株前期无病毒症状，后则有轻微症状，只能检测到少量病毒）和感病型（植株与对照发病相似，但稍轻）。其中，免疫型植株有15株，占转基因总株数的37％；抗病型植株有10株，占转基因总株数的25％；感病型植株有15株，占转基因总株数的37％。 用 TOMV的病汁液接种 47株 TOMV N（f）的转基
朱文哲[10]2010年在《多毛番茄（Lycopersicon hirsutum）中抗冷转录因子LhCBF1基因的遗传转化》文中研究表明番茄是一种重要的蔬菜作物,在世界各地均有栽培,但在生产过程中,经常遭受低温冷害,因而降低了经济效益,影响番茄生产。而多毛番茄是一种野生番茄,属番茄属。相关研究表明,它具有耐低温甚至是抗冻的特性。通过对多毛番茄叶片的观察,其表面有厚密的绒毛,而普通番茄不具备此特点,推测多毛番茄表面的绒毛可能在一定程度上提高了其耐冷能力。另外,多毛番茄耐冷性的提高可能受到耐冷途径的调控,例如膜脂相变程度小、膜结构的调整能快速适应低温、代谢调整等一些生理生化的变化。推测多毛番茄自身可能具有独特的功能强大的耐低温或抗冻基因。目前.,植物耐冷性基因研究焦点则主要集中在抗冷转录因子CBF基因上。在寒冷条件下,细胞严重脱水,最先受到损伤的是植物的细胞膜。植物遇冷时,CBF基因调控的耐冷相关基因表达阻止了细胞膜脂双层向六角形11相脂的转变,防止低温引起的细胞脱水,而多毛番茄表面有厚密的绒毛覆盖,同时类番茄茄的叶片窄小而且薄,因此我们推测,在多毛番茄和类番茄茄的耐冷机制中,CBF1基因调控的耐冷途径占主导地位。1.本试验以普通番茄金棚1号、较耐冷的普通番茄L402和多毛番茄为试验材料,在5℃低温条件下比较了不同处理时间对多毛番茄和普通番茄的生理生化机制的影响。通过5℃低温胁迫处理此叁种番茄,然后参照普通番茄的生理生化变化情况来探讨多毛番茄的耐冷性生理机制。研究结果表明：(1)随处理时间的延长,多毛番茄的丙二醛(MDA)含量和超氧自由基(O2-)含量显着低于普通番茄,而超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化物酶(POD)活性、脯氨酸含量、过氧化氢酶(CAT)活性、抗坏血酸过氧化物酶(ASA)活性和苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性则显着高于普通番茄。(2)经5℃低温处理24h后多毛番茄叶片无明显变化,而普通番茄叶片出现了萎蔫症状。2.在初步确定了多毛番茄的耐冷机制的基础上,本研究以CBF1基因为材料,将其与载体构建并取得了以下结果：(1)分别构建了强组成型启动子CaMV35S和冷诱导型启动子Rd29A调控的多毛番茄中CBF1基因的植物表达载体pCAMhp1033和pRDhp1033。(2)分别构建了强组成型启动子CaMV35S和冷诱导型启动子Rd29A调控的类番茄茄中CBF1基因的植物表达载体pCAMhp2408A和pRDhp2408。3.通过农杆菌介导法,将CBF1基因遗传转化到番茄品种Micro-tom,对转基因植株进行检测,研究结果如下：(1)获得再生植株19株,其中移入土中的有13株,未移入土中的有6株。对此13株植株进行PCR分子检测,获得阳性植株8株。(2)检测了转基因植株的低温耐性,5℃低温胁迫处理条件下,生理生化指标分析结果显示：超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化物酶(POD)活性、脯氨酸含量、过氧化氢酶(CAT)活性、抗坏血酸过氧化物酶(ASA)活性和苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性显着高于未转基因植株。而转基因植株的丙二醛(MDA)含量和超氧自由基(O2-)含量则显着低于未转基因植株。且经5℃低温处理后转基因植株叶片无明显变化,长势好于未转基因植株。
参考文献：
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[9]. 烟草抗病毒基因工程研究[D]. 牛颜冰. 浙江大学. 2003
[10]. 多毛番茄（Lycopersicon hirsutum）中抗冷转录因子LhCBF1基因的遗传转化[D]. 朱文哲. 东北农业大学. 2010