龚光明[1]2001年在《基因工程去势疫苗的抗原性、抗体动态及安全性》文中研究表明间接ELISA交叉试验及交叉抑制实验证明禽型LHRH与哺乳型LHRH之间没有抗原交叉性很弱，要使基因工程LHRH去势疫苗畜禽两用，必须将禽型LHRH与哺乳型LHRH串联才能达到预期目的。 小鼠一免两周后检测到LHRH抗体，第八周时抗体滴度很低，二免叁至四周后抗体达到高峰，第七周、第八周抗体迅速下降。而猪体抗体消长规律试验中发现猪在一免第二周产生抗体，第七周时抗体处于检测临界水平，二免抗体效价略高于一免，持续到第十一周效价很低，与一免情况基本相似。 弱抗原强化兔体皮内试验中，叁种状态抗原疫苗产生的抗体在试验时间内均以高水平保持，变化小，而小鼠腹腔注射试验中LHRH抗体的产生变化较大，但兔体及小鼠试验均表明金黄色葡萄球菌重构组LHRH疫苗免疫原性强于免疫复合物组；二者均强于单苗组。 去势疫苗兔体残留实验中，家兔血液、肌肉2天后，肝4天后，脾10天后在ELISA灵敏度范围内没有检测出残余的LHRH抗原。免疫兔肉小鼠饲喂试验表明食用免疫去势动物肉品对生殖健康没有潜在危害。将免疫去势、手术去势、不去势对照组叁组猪肉进行品质检验，免疫去势可以去除膳味在营养成分方面免疫去势和手术去势无显着差异，但是一次免疫组猪睾丸大小与对照组没有差别，二次免疫组猪睾丸稍有萎缩。兔高免血清被动免疫初步证实食用免疫去势动物肉食品（即使生食），不会因为抗体的抗激素效应而影响生殖健康。 分析现有的LHRH融合蛋白氨基酸序列，没有发现任何已经存在的蛋白序列与之高度同源，同源性主要集中在载体（硫氧还蛋白）部分，叁级结构模拟得到载体硫氧还蛋白叁维结构，比较了两种融合蛋白LHRH抗原亲水性和疏水性，表明哺乳型LHRH在L1和L2中抗原性以及哺乳型LHRH与禽型LHRH中相对应的某些相同的氨基酸亲水性疏水性可能不同。
方富贵[2]2010年在《重组MBP—GnRH—I6研制及其免疫公猪的效果与机理的研究》文中研究表明目的:动物去势术仍是畜牧生产中一个急需解决的问题。因为传统的手术去势往往遗留后遗症,且在施术过程中对人畜的安全构成威协等,而免疫去势法可以克服传统方法的不足。本研究系统地研究了免疫去势疫苗MBP-GnRH-I6的制备、效果以及免疫去势的机理,旨在研制出一种免疫原性强且成本低的免疫去势疫苗并阐明其去势的机制。方法:(1)将人工合成的GnRH-I六聚体基因插入麦芽糖结合蛋白融合表达系统载体pMAL-c4x中,重组质粒转化到大肠杆菌(E.coli TB1)中并用IPTG进行诱导表达,多糖树脂(amylose resin)亲和层析法纯化蛋白。应用SDS-PAGE、HPLC法对纯化蛋白进行分析。Western blot鉴定融合蛋白的反应原性。(2)同龄健康的杜洛克×长白×大白初生公猪,随机平均分为3组,分别为免疫组,阳性对照组(不去势组)和阴性对照组(手术阉割组)。用PBS溶解MBP-GnRH-I6,并与AL(OH)3佐剂充分乳化。免疫组猪颈部肌肉注射2mL的乳化剂(含1mg MBP-GnRH-I6),采用同样的剂量与路线加强免疫一次。实验期间从前腔静脉采血置于4℃过夜,然后4℃2000g离心20min,收集血清-80℃保存。游标卡尺测量阴囊直径,酶联免疫分析法测血清GnRH-I抗体效价,放射免疫分析法测血清睾酮浓度,屠宰时取睾丸,称重并测量大小,取睾丸组织用福尔马林固定,制做5μm厚的切片,HE染色后观察其组织学变化,随机选取每头猪的5张睾丸组织切片,用形态学分析软件统计生精小管中不同发育阶段的生殖细胞数目,探明MBP-GnRH-I6的免疫去势效果。(3)屠宰后,迅速取出下丘脑、腺垂体和睾丸,置于液氮中,-80℃保存。采用实时荧光定量PCR法,分析下丘脑GnRH-I和GnRH-IR mRNA,垂体中GnRH-IR,FSHβ和LHβmRNA以及睾丸中GnRH-IR、FSH受体、LH受体、3βHSD和17βHSD mRNA的变化。透射电镜观察垂体促性腺激素细胞,睾丸生精细胞、支持细胞和间质细胞的超微结构,探讨MBP-GnRH-I6主动免疫对生殖轴上相关生殖激素及其受体的影响以及垂体和睾丸组织超微结构的变化。(4)免疫前和屠宰时称猪体重,酶联免疫分析法检测血清猪生长激素,放射免疫分析法检测血清IGF-I水平,Pearson相关分析血清睾酮与IGF-I的相关性,探讨免疫去势猪生长快的初步机理。(5)HPLC法分析背膘脂肪中雄烯酮和3-甲基吲哚的含量,探明MBP-GnRH-I6主动免疫对公猪肉膻味的影响。结果:(1)与麦芽糖结合蛋白基因融合的GnRH-I六聚体基因在E.coli TB1中能够高效表达,且为可溶性表达,经多糖树脂亲和层析纯化后,获得高纯度的MBP-GnRH-I6融合蛋白(纯度达97.68%),其分子量大小与理论值(50kDa)一致,且Western blot表明MBP-GnRH-I6融合蛋白与GnRH-I抗体发生特异性反应。(2)MBP-GnRH-I6主动免疫能诱导公猪产生高效的抗GnRH-I抗体,导致血清睾酮浓度显着下降(P<0.05),阴囊直径增大缓慢且比阳性对照组短(P<0.05),屠宰时睾丸的纵径、横径、纵周长、横周长和重量均小于阳性对照组(P<0.05),睾丸组织切片显示,生精小管严重发育不良,精原细胞、初级精母细胞和精子细胞退化且没有精子,管壁不同发育阶段的生精细胞数目明显减少(P<0.01)。(3)免疫组,阳性对照组和阴性对照组公猪下丘脑GnRH-IR和GnRH-I mRNA表达差异不显着(P>0.05),垂体中FSHβmRNA、LHβmRNA显着地低于阴、阳对照组(P<0.05),GnRH-IR mRNA显着地低于阴性对照组和阳性对照组(P<0.05)。免疫组公猪睾丸FSH受体、LH受体mRNA表达均显着地低于阳性对照组(P<0.05),但3βHSD和17βHSD mRNA却高于阳性对照组(P<0.05)。超微结构显示,免疫猪垂体促性腺激素细胞颗粒减少,睾丸生精小管基膜增生,初级精母细胞线粒体数量明显减少,精子细胞核内染色质聚集成块状,分布于核膜四周,细胞器少,支持细胞线粒体少数空泡变性,线粒体嵴断裂。间质细胞少数线粒体空泡变性,胞浆内溶酶体增多。(4)MBP-GnRH-I6主动免疫猪体重显着重于阴性对照组(P<0.05),但不影响公猪血清pGH水平(P>0.05)。在17～21周龄时,免疫组公猪血清IGF-I浓度显着低于阳性对照组(P<0.05),21～25周龄时免疫组公猪血清IGF-I显着高于阴性对照组(P<0.05)。相关分析表明血清睾酮与IGF-I呈正相关。(5)免疫组背膘脂肪雄烯酮下降,和阴性对照组一样低于检测下限;但是免疫组、阳性对照组和阴性对照组公猪3-甲基吲哚水平差异不显着(P>0.05)。结论:(1)成功构建出GnRH-I6基因工程体,获得高纯度且具有良好反应原性的MBP-GnRH-I6。(2)MBP-GnRH-I6主动免疫使公猪血清睾酮浓度维持在较低的水平,睾丸显着萎缩,表明是成功的免疫去势。(3)MBP-GnRH-I6主动免疫降低公猪垂体FSHβmRNA、LHβmRNA和GnRH-IR mRNA以及睾丸FSH受体、LH受体、3βHSD和17βHSD mRNA的表达,损伤了垂体促性腺激素细胞及睾丸组织的支持细胞、间质细胞和生精细胞的超微结构。揭示MBP-GnRH-I6主动免疫可能通过降调生殖轴生殖激素及其受体mRNA数量,以及破坏生殖轴细胞的亚显微结构影响公猪生殖机能。(4)MBP-GnRH-I6主动免疫改变了公猪生长性能,增加体重,其作用途径可能是睾酮通过调控血清IGF-I水平来调控的。(5)MBP-GnRH-I6主动免疫降低脂肪雄烯酮含量,消除膻味,改善了肉质。
姜勋平[3]2001年在《抑制素和bcl-2基因免疫对小鼠繁殖和生长的影响》文中认为用生物分子信息学理论和方法，借助计算机软件分析猪抑制素α亚基的二级结构、疏水性、亲水性和抗原性等理化特征，确定了抑制素α（1-32）和（100～120）区域是两个抗原决定簇。比较猪抑制素α亚基与NR蛋白库已知的蛋白质序列表明，它与人、牛、羊等家畜的抑制素具有较高的同源性，同时也与体内的100多种其它蛋白质具有较高的同源性。用抑制素α亚基全序列构建基因疫苗，可能产生的抗体会与体内其它同源蛋白发生交叉反应。经综合分析，抑制素α（1-32）既具有抑制素的免疫原性，又与体内其它蛋白质没有同源性，它的编码序列是构建抑制素基因疫苗的理想克隆区域。 克隆猪抑制素α（1-32）基因，与pET-32c载体的硫氧还蛋白（Thioredoxin）基因重组，表达的融合蛋白分子量约14KD。用最优回归试验设计研究IPTG最佳诱导条件，最大表达量电泳扫描净灰度达38.78％。与NR库同源性分析表明，融合蛋白与体内的硫氧还蛋白等具有很大的同源性，不宜用作抑制素免疫原。 用编码抑制素α（1～32）的基因与pcDNA3.1真核表达质粒重组构建抑制素基因疫苗。抑制素基因免疫后重组质粒可以在活体肌细胞内表达，表达产物具有抑制素抗原性，能激活免疫系统产生抑制素抗体，阳性率30％。验证了用计算机确认的抑制素抗原区域是正确的。抑制素抗体阳性小鼠与阴性小鼠的产仔数、初生重和窝重等没有显着差异（p＞0.05）。这是国内外首次用基因免疫的方法研究动物繁殖力调控的实验。 构建了B细胞淋巴瘤/白血病-2（bcl-2）基因真核表达质粒。用流式细胞仪分析表明，体外转染bcl-2基因重组质粒后，传代细胞比对照组分裂速度快（p＜0.01）、凋亡比率较低，G_2/M+S期细胞显着高于对照（P＜0.01）。表明构建的bcl-2基因真核表达质粒能在真核细胞中表达；外源Bcl-2基因可以抑制体外培养细胞的凋亡、延长细胞的寿命。bcl-2基因免疫后小鼠生长速度比对照组慢，对睾丸重、卵巢重没有影响。这提示该基因与小鼠生长有关，可以用基因治疗的方法增加小鼠的生长速度；可以将它作为候选基因，研究其对生长的遗传效应。
王宏魁[4]2009年在《河南株PPV的分离鉴定及VP2基因的克隆与序列分析》文中指出猪细小病毒病是由猪细小病毒引起的以初产母猪发生流产、不孕、产死胎、畸形胎、木乃伊胎及弱仔为特征的繁殖障碍性疾病。该病广泛存在于世界各地并在大多数猪场流行,严重地影响着养猪业的发展,因此一直是猪病研究的热点之一。本研究首先建立了用于检测猪细小病毒感染的PCR方法,并使用细胞培养技术在临床病料中分离了一株猪细小病毒,在此基础上利用PCR技术扩增了猪细小病毒的VP2基因主要抗原决定区序列并与其他国内外13个细小病毒基因组进行了比较和分析,为下一步进行原核表达、真核表达以及基因工程疫苗免疫预防应用打下了基础。根据已报道的猪细小病毒基因组序列,设计并合成了一对寡核苷酸引物,通过PCR扩增成功地从猪细小病毒感染的胎儿和细胞中扩增出1124bp片段,回收该片段用HindⅢ酶切得到了预期的结果,以PPV细胞毒、PCV2、PRRSV、PRV及临床病料为模板,结果只有PPV细胞毒和部分疑似病料扩增出目的条带。将PPV RFDNA模板进行10-6稀释后依然可以检出说明该方法敏感性很好。利用该方法对临床上32份流产病料的检测,检出阳性6份,而同时利用HA检测阳性只有4份。这些结果说明本研究建立的PCR诊断方法具有灵敏度高、特异性强的特点。利用本方法检测到的阳性病料进行初步分离鉴定,发现该分离病毒在PK-15细胞上连续盲传4代,可致PK-15细胞出现聚堆、拉网、形成空斑等典型病变;琼扩试验可见明显的沉淀线;间接免疫荧光阳性;应用本课题已建立的猪细小病毒的PCR诊断方法,以提取的病毒DNA作为模板,扩增出特异性的目的片段。上述结果证明,所分离到的病毒为猪细小病毒,并将其暂命名为PPV ZK株。PCR反应扩增了包含猪细小病毒VP2主要抗原表位基因DNA片段,并进行了克隆和测序.将该序列在GenBank上利用DNA Blast软件和DNAstar软件和其他国内外分离株进行比较,发现该株病毒与GenBank登录的PPV-VP2基因组的核苷酸和氨基酸同源性均达到97%以上,证明了PPV VP2基因序列是十分保守的,但从序列进化树上仍可以看出地域差异,与大部分国内序列在一个分支上而与德国分离株关系较远。氨基酸序列分析结果表明该片段编码352个氨基酸,具有14个潜在的抗原位点均匀分布,而且疏水性区域和亲水性区域分布也都比较均匀,这一结果预示着PPV-ZK株VP2基因可以应用于免疫预防的良好前景。本研究中PPV PCR检测方法的建立解决了PPV隐性感染和早期感染以及传代细胞系污染不易检测的难题,对猪细小病毒病的临床诊断、控制以及生物制品的生产等均具有重要意义。对VP2结构蛋白基因的克隆、序列测定与分析以及氨基酸序列分析和蛋白质一级结构的预测为进一步研究细小病毒的免疫诊断、分子流行病学、免疫预防以及更进一步的分子生物学研究打下了坚实的基础。
张倩[5]2008年在《表达裂谷热病毒糖蛋白重组山羊痘病毒的研究》文中提出裂谷热(Rift Valley Fever, RVF)是反刍动物和人共患的一种烈性传染病,可通过虫媒(库蚊等)及直接接触等途径传播,具有传染性强、致死率高、易感动物广泛等特性。RVF每次流行均造成巨大的社会经济损失和公共卫生危机。国际兽医局(OIE)已将RVF列为A类传染病,也是国际上重要的生物武器研究对象及生物反恐防范对象。RVF主要流行于非洲,2000年前后蔓延至中东及阿拉伯半岛。近年,南亚地区也有迹象表明存在该病毒的流行。随着全球化贸易、人员交往快速发展及全球气候变暖趋势的加速,我国面临RVF等新发传染病的威胁也越来越严重,急需开展疫苗、诊断监察技术等相关防控技术的研究。裂谷热病毒(Rift Valley Fever Virus, RVFV)为布尼安病毒科(Bunyaviridae)的Phlebovirus属成员,仅一个血清型。囊膜糖蛋白G是RVFV的主要结构蛋白及保护性免疫原,由基因组M节段编码,翻译后裂解为GN和GC两个亚单位。山羊痘病毒(Goatpox virus, GPV)宿主范围明确,主要限于山羊和牛等反刍兽。GPV基因组容量大,遗传性稳定,复制非必需区明确,可耐受大片段外源基因的插入、重组和表达,作为重组病毒载体疫苗不影响流行病血清学监测。本研究首先以我国自行培养并得到广泛应用的山羊痘病毒(GPV)疫苗株为载体,以复制非必需区TK基因为插入靶点,通过同源重组,构建了痘病毒晚期启动子p11驱动、内部核糖体进入位点(ires)介导的黄嘌呤鸟嘌呤磷酸转移酶基因(gpt)和绿荧光蛋白基因(gfp)串联表达的重组病毒rGPV-gpt-ires-egfp。在此基础上,进一步构建痘病毒早晚期启动子p7.5驱动RVFV保护性抗原G基因片段重组病毒rGPV-gie-rvfv-g(n+c),利用霉酚酸(Mycophenolic acid, MPA)药物筛选后,经PCR、Western-blot和IFA(间接免疫荧光)方法证实G蛋白在重组病毒中稳定表达,并被有效裂解为GN和GC两个亚单位,重组病毒具有良好细胞生长特性。本研究为RVF重组山羊痘病毒活载体疫苗的研制奠定了坚实的基础。
任加强[6]2004年在《前列腺特异性膜抗原（PSMA）在前列腺癌的病理诊断及免疫治疗的基础研究》文中指出在美国,前列腺癌为男性恶性肿瘤发病率的首位,占男性恶性肿瘤构成比的30%,列亡率仅次于肺癌居第二位,占男性恶性肿瘤构成比的11%。随着人口寿命的延长,前列腺癌的发病率和死亡率在我国呈上升趋势,特别在我国发现前列腺癌时常处于晚期或者已发生转移,而对于转移性癌,目前尚无有效治疗措施,因此寻找新的标记物以辅助前列腺癌的诊断及治疗成为了国内外肿瘤研究的热点。前列腺特异性膜抗原(Prostate Specific Membrane Antigen,PSMA)是一种Ⅱ型跨膜糖蛋白,绝大多数研究表明,与前列腺特异性抗原(Prostate Specific Antigen,PSA)不一样的是,PSMA特异性地表达于前列腺上皮细胞表面,其表达强度在前列腺癌细胞明显升高,特别是晚期前列腺癌及转移性前列腺癌中,PSMA升高尤为明显,这使得它成为前列腺癌诊断和治疗的一个重要靶分子。长期以来,在临床上得到广泛应用的抗PSMA膜内段的抗体不能越过细胞膜与其相应的表位结合,使其在前列腺癌的示踪诊断及靶向治疗中的作用受到了很大的限制,制备抗PSMA膜外段表位的单克隆抗体无疑是克服这些障碍的最佳途径。 前列腺癌的分化程度与其预后及激素治疗的效果密切相关,Gleason分级是目前评价前列腺癌分化程度的通用标准,可预测前列腺癌的预后情况,尽管PSMA是一个前列腺特异性标记物,但是它与前列腺癌的分化程度之间的相关性尚未见报道。 传统的治疗措施对转移性前列腺癌及雄激素剥夺治疗失效后的复发性前列腺癌效果不佳,有必要寻找新的治疗措施。免疫治疗是一种安全的、非创伤性的方法,最近有报道显示DNA疫苗可用于前列腺癌的治疗。DNA疫苗可以在体内表达出具有天然表位的蛋白,激活机体的免疫机制产生全面的免疫应答,如产生抗体、细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte CTL)、免疫记忆等,而且安全性高、成本低廉,成为肿瘤主动免疫治疗的一个热点。PSMA的表达受雄激素负调控,经去势治疗后升高尤为明显,提示它可能是构建治疗前列腺癌特别是复发性前列腺癌的DNA疫苗的理想靶抗原。 基于以上背景及设想,本课题将制备出抗PSMA膜外段表位的单克隆抗体以用于前列腺癌的病理诊断,并且为前列腺癌的免疫治疗提供载体;分析PSMA表达水平与前列腺癌的分化程度之间相关性,评价PSMA能否作为前列腺癌病理分级的指标;构建表达PSMA的DNA疫苗免疫C57BL/6小鼠,建立稳定表达PSMA的黑色素瘤B16细胞对小鼠进行攻击,观察DNA疫苗是否产生抗肿瘤反应。通过这些研究以明确PSMA在前列腺癌的病理诊断及免疫治疗的意义。
江玲丽[7]2006年在《单核细胞增多性李斯特菌的主要毒力基因分析及其重组菌构建与免疫原性》文中研究指明单核细胞增多性李斯特菌(简称单增李斯特菌，Lm)为重要的食源性病原菌，能引起人的败血症、脑炎、脑膜炎和胃肠炎，虽然发生率不高，但死亡率可达30％。不同来源Lm的致病性差异较大，有些菌株致病性很强，而另一些菌株毒力较弱甚至无致病性。将Lm减毒后作为携带外源基因的基因工程疫苗载体是近年来国外学者研究的热点之一。国内在Lm分离株的生物学特性、遗传多样性、基因结构与功能及其疫苗载体的研究方面鲜见报道。本研究以小鼠和鸡胚LD_(50)试验及体外培养鼠成纤维细胞的空斑形成试验比较了20株Lm食品及环境分离株的毒力。结果表明：大多数Lm分离株毒力与参考菌株10403S相当，对小鼠的LD_(50)在10~(3.86)-10~(6.74)之间，对鸡胚的LD_(50)在10~(1.23)-10~(3.35)之间，为强毒株；分离株H4对小鼠和鸡胚的LD_(50)分别为10~(8.14)和10~(6.73)，为弱毒株。空斑形成试验与LD_(50)结果基本一致，大多数单增李斯特菌分离株感染孔均有清晰的空斑形成。相对于参考菌株而言，它们的大小在83.7％-108.3％之间，而弱毒株H4感染孔无可见空斑。选取Lm的毒力基因actA，InlA和InlB高变区域外测保守区设计引物进行PCR扩增，T-A克隆至pMD18-T载体后进行测序，对20个Lm的食品及其环境分离株进行多位点序列分型。基于actA和InlA序列的分型结果基本一致，可将21个菌株分成6个亚型，与基于InlB的序列分型略有差异。综合上述3个毒力基因的分型结果可将所有菌株分成8个序列亚型，分别为S1-S8，其中菌株0194、10403S和H4各自成一亚型。用SmaⅠ对上述菌株基因组DNA进行酶切，以脉冲场凝胶电泳(PFGE)方法将21个菌株划分为6个亚型，分辨力与序列分型结果相当，弱毒株H4自成P6亚型。此外，分离自同一加工厂的海产品分离株1056，1057及其环境分离株6属于同一序列或PFGE亚型，表明该加工企业成品中的Lm来自其加工环境。消毒奶分离株320与其环境分离株690共为同一序列或PFGE亚型，表明成品奶中污染的Lm来自加工环境，而非奶牛场。为探讨Lm H4株弱毒的分子基础，对其主要毒力相关基因(iap，prfA，plcA，hly，mpl，actA，plcB，InlA和InlB)进行了测序和系统分析。体外试验表明：分离株H4与参考菌株10403S相比，具有相似的溶血活性和细胞侵袭力，但具有更强的细胞黏附力、更高的细胞内增殖水平和更强的溶脂活性。而H4株对小鼠及鸡胚的LD_(50)比菌株10403S毒力分别低2.7和4.8个对数。菌株H4与10403S及EGD的prfA、plcA和mpl具有很高同源性(＞98％)；与10403S菌株的hly基因核苷酸同源性为96.9％，氨基酸同源性为98.7％，体外溶血活性相似；与10403S菌株的plcB基因核苷酸同源性为95.4％，包含ORF第1位碱基及其上游序列-26位的突变(A-G，C-T)，有可能使ORF从-27位开始形成，这一变化可能导致H4的强溶脂活性。H4株在肌动蛋白ActA的脯氨酸富集区有35个氨基酸缺失。本研究结果表明：单增李斯特菌H4株对小鼠和鸡胚的低毒力可能与actA中脯氨酸富集区的部分缺失而引起的细胞间迁移能力下降或丧失有关。为探明单增李斯特菌弱毒株H4强溶脂活性的分子基础，根据前期对plcB ORF及其上游序列分析结果，首先设计引物扩增plcB同源区(包含上游序列)，定向克隆至pUC18，构建pUC18-plcB。设计3对点突变引物，以pUC18-plcB为模板进行PCR扩增，分别将plcB上游第26位(-26位)及ORF第1位双突变或-26位单突变为参考菌株10403S的相应碱基，测序确认后命名为pUC18-△plcB1、pUC18-△plcB2和pUC18-△plcB3。继而亚克隆至pKSV7，构建重组穿梭质粒pKSV7-△plcB1、pKSV7-△plcB2和pKSV7-△plcB3，并将其电转入H4株的感受态细胞中，利用同源重组技术实现目的碱基的置换，构建H4的突变株H4-△plcB1、H4-△plcB2和H4-△plcB3。目的片段的PCR扩增及序列分析表明各突变株构建成功。在含5％的卵黄琼脂平板中，各突变株均无溶脂活性，表明H4菌株强溶脂活性由plcB上游第26位碱基的突变(C-T)、致其ORF从-27位开始形成有关，比参考菌株10403S多9个氨基酸。这一突变对H4株plcB基因表达的增强作用机制还有待进一步探索。另外，小鼠LD_(50)试验表明突变株H4-△plcB1毒力比其亲本菌株H4提高1个Log，初步表明H4菌株中两个膜裂解相关基因hly与plcB的高效表达及协同作用可能增强了细菌对宿主细胞的毒性，并暴露于宿主的免疫系统而被清除，从而降低了对宿主的致病性。单增李斯特菌为侵袭性胞内菌，可在专职和非专职吞噬细胞内存活并繁殖，是目前疫苗载体研究的热点之一。以绿色荧光蛋白基因gfp为模式外源基因，以单增李斯特菌毒力基因hly为靶基因，通过基因切割-重迭延伸PCR法及同源重组技术构建表达GFP的重组单增李斯特菌。首先构建了pKSV7质粒衍生体，此质粒含有hly的启动子和信号肽序列，gfp片段及hly的同源区，通过电穿孔法把该质粒转入野生型Lm 10403S株，经两次等位基因交换将gfp片段整合入Lm染色体基因组中。目的片段的PCR、序列测定及该重组菌在显微镜下发出的绿色荧光表明该重组子的构建成功。溶血试验表明hly基因中gfp的插入后溶血活性消失，对Hela细胞的黏附和侵袭力降低。此外，小鼠及鸡胚的LD_(50)试验表明该重组菌比其亲本菌株毒力下降了2个Log。以新城疫病毒(NDV)编码融合蛋白的截短片段Fa为外源基因，通过基因切割-重迭延伸PCR法将其插入到单增李斯特菌毒力基因plcB信号肽序列下游，定向克隆至穿梭质粒pKSV7，并电转入单增李斯特菌10403S，通过同源重组技术构建携带NDV Fa片段的重组单增李斯特菌。PCR扩增结果表明重组菌Lm-△plcB-Fa构建成功。RT-PCR结果表明整合的外源基因能在重组菌中转录，SDS-PAGE及Western blot分析表明融合蛋白Fa能在重组菌中表达，与NDV阳性血清具有免疫反应性。毒力试验表明重组菌对小鼠与鸡胚的毒力降低，LD_(50)比其亲本菌株下降1.7-2.3个Log。重组菌Lm-△plcB-Fa对细胞的黏附和侵袭力均低于亲本株10403S(P＜0.05)。然而，重组菌口服或腹腔免疫SPF鸡后，均未能有效诱导针对NDV和融合蛋白Fa的特异性抗体，也未能保护NDV强毒的攻击。其可能原因是重组单增李斯特菌在鸡体内持续存在时间短、增殖率低，进而导致外源基因的低水平表达。本试验结果为深入探索单增李斯特菌的致病机理、对食品污染的控制和基因工程疫苗载体的研究奠定了良好基础。
李学仁[8]2005年在《重组奶牛α、γ干扰素的研制及其抗病毒作用》文中进行了进一步梳理目前有多种疾病严重威胁着牛的健康,影响了我国养牛业的发展和牛肉和奶制品的对外贸易。因此,急需研制出安全、高效、新型的抗病毒和免疫增强剂用于增强牛的抵抗力。干扰素(Interferon,IFN)是动物机体感染病毒或接种疫苗后产生的一类具有抗病毒和免疫调节功能的蛋白质,是动物抵御病毒入侵的第一道防线。根据干扰素的氨基酸序列、抗原性和细胞来源的不同可将其分为2个型:Ⅰ型干扰素的主要成员为α干扰素和β干扰素,Ⅱ型干扰素为γ干扰素。Ⅰ型干扰素具有较强的抗病毒功能,Ⅱ型干扰素抗病毒功能稍弱,但免疫调节功能较强。人类重组干扰素用于治疗病毒感染和肿瘤疾病已有几十年的成功历史。近年来,牛干扰素(Bovine interferon,BoIFN)的抗病毒和疫苗佐剂功能也在更多的试验中被发现和证实。本研究的目的就是应用基因工程和蛋白质工程技术研制出具有自主知识产权的重组牛α、γ干扰素并研究其抗病毒作用,为我国重组牛干扰素的工程化生产及其在养牛业中的应用奠定基础。研究主要从以下几个方面展开: 1.应用RT-PCR方法从经刀豆素(ConA)刺激诱导的奶牛外周血淋巴细胞总RNA中克隆到牛γ干扰素成熟蛋白基因,与Genebank上登录的γ干扰素基因(NM_174086)同源性为100%。然后将特异性片段连在PBV载体上进行表达,经SDS-PAGE分析,原核表达产物为16KDa的重组蛋白,占菌体总蛋白的32%,表达产物以包涵体形式存在。经7mol/L盐酸胍的变性液溶解及0.5mol/L盐酸胍复性液处理,表达产物进行脱盐、凝胶层析纯化,细胞病变抑制法结果表明,重组牛IFN-γ具有较高的干扰素活性,约为6.0×10~5U/mg。 2.提取经新城疫病毒诱导培养的奶牛外周血淋巴细胞总RNA,应用RT-PCR方法扩增出奶牛α干扰素成熟蛋白基因,然后将特异性片段连接到pMD18-T载体,测序结果表明,扩增片段为牛α干扰素成熟蛋白序列,与Genebank上发表的α1干扰素序列同源性为98%。然后将特异性片段连接到含分泌信号肽序列的pichia pastoris表达载体pPICZαA上,将重组质粒经Sac Ⅰ酶切线性化后电转化导入毕赤酵母菌株X-33。转化子经PCR分析鉴定后利用甘油增菌和甲醇诱导,实现了BoIFN-α在毕赤酵母系统中的分泌表达。SDS-PAGE结果显示表达产物分子量约为23kDa,比其推导结果(20kDa)略大,推测可能是因为表达产物发生了一定程度的糖基化。细胞病变抑制
周明[9]2009年在《大肠杆菌裂解性噬菌体的分离鉴定及其实验治疗》文中研究说明本研究是以产肠毒素性大肠杆菌O101为宿主菌,在10份污水样品中筛选出一株裂解性相对最强的噬菌体P3,该噬菌体的在双层平版上形成噬菌斑的直径约为6mm,效价约为5.5×109pfu/mL,具有较强的裂解性和特异性。对P3的生物学特性研究表明:该噬菌体的最适pH值为7.0,在pH值4～11的环境中2h仍可保持较高的活性;最适生长温度为37℃;对热较稳定,在60℃保温1h效价可在107以上,但在70℃时则完全失活;对氯仿和乙醚不敏感;其最佳感染复数(MOI)为1;感染宿主菌的潜伏期约为20min,裂解期约为80min,裂解量为55。电镜下观察噬菌体P3的形态,其头部呈正二十面体,直径约为20nm,无尾,无囊膜;经SDS-PAGE电泳鉴定,噬菌体P3至少含有两种结构蛋白;其中大小为49kDa的蛋白含量较高。提取噬菌体P3的基因组,用0.7%琼脂糖凝胶电泳鉴定,其大小约为15kb,为双股DNA分子。经综合鉴定,将噬菌体P3暂划为群I-双股DNA病毒中的盖病毒科盖噬菌体属的成员。实验小鼠经口服接种大肠杆菌O101后,利用噬菌体P3进行实验治疗,结果表明:噬菌体P3能大大减少感染小鼠体内的宿主菌的数量,对感染大肠杆菌O101的小鼠有较好的保护力,且在接种后3小时和接种同时口服噬菌体液的治疗效果较好。本研究筛选出一株对产肠毒素性大肠杆菌O101具强裂解性的噬菌体P3,研究了其生物学特性及进行了分类鉴定,并进行了该噬菌体进行了实验性治疗研究。
参考文献：
[1]. 基因工程去势疫苗的抗原性、抗体动态及安全性[D]. 龚光明. 南京农业大学. 2001
[2]. 重组MBP—GnRH—I6研制及其免疫公猪的效果与机理的研究[D]. 方富贵. 安徽农业大学. 2010
[3]. 抑制素和bcl-2基因免疫对小鼠繁殖和生长的影响[D]. 姜勋平. 南京农业大学. 2001
[4]. 河南株PPV的分离鉴定及VP2基因的克隆与序列分析[D]. 王宏魁. 河南农业大学. 2009
[5]. 表达裂谷热病毒糖蛋白重组山羊痘病毒的研究[D]. 张倩. 东北农业大学. 2008
[6]. 前列腺特异性膜抗原（PSMA）在前列腺癌的病理诊断及免疫治疗的基础研究[D]. 任加强. 复旦大学. 2004
[7]. 单核细胞增多性李斯特菌的主要毒力基因分析及其重组菌构建与免疫原性[D]. 江玲丽. 浙江大学. 2006
[8]. 重组奶牛α、γ干扰素的研制及其抗病毒作用[D]. 李学仁. 南京农业大学. 2005
[9]. 大肠杆菌裂解性噬菌体的分离鉴定及其实验治疗[D]. 周明. 吉林大学. 2009
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