转化生长因子β1及其Ⅰ和Ⅱ型受体与肾脏疾病关系的研究

张玉侠^[1]2000年在《转化生长因子β_1及其Ⅰ和Ⅱ型受体与肾脏疾病关系的研究》文中研究说明近年来有关肾小球硬化机制研究最多的是转化生长因子β(transforminggrowth factor β，TGF-β)所起的作用。转化生长因子β(TGF-β)在ECM积聚中发挥着重要作用，许多实验已证实TGFβ可促使ECM沉积，是肾小球疾病进展的重要介导因子。因此，对TGF-β家族的研究越来越受人们的重视。也成为目前国际肾脏病领域研究的一个热点。 自从Delaro和Todaro在研究病毒时首次发现了TGF-β，随后人们相继发现与其有类似功能的物质，并将其命名为转化生长因子超家族。目前已知道，TGF-β超家族广泛存在于哺乳动物之中，有30多种成员。TGF-β是一种多功能的细胞因子，以自分泌、旁分泌、和内分泌的方式，通过细胞表面的复杂的受体信号传导途径调控细胞的增殖、分化和凋亡，在许多组织的发育形成中起到十分重要的作用。此外，它还参与成熟的哺乳动物机体的免疫调节、细胞粘附以及细胞外基质的合成和储存。大量证据表明，TGF-β可促进肾脏疾病的发展，导致肾组织纤维化。血管内皮细胞是TGF-β作用的主要部位，受体密度最高的是肾小球和肝脏。新合成的TGF-β是无活性的，要发挥其生物效应必须活化，在体内，TGF-β的激活与失活受多种蛋白酶系统调控，如纤溶酶原/纤溶酶。当毛细血管内皮细胞与外膜细胞共同培养时，无活性TGF-β的激活需纤溶酶的参与，加入纤溶酶抑制剂或耗竭纤维原都能阻止其激活。 TGF-β与TGF-β受体相结合而发挥生物学效应。通过受体信号转导促进细胞合成胶原蛋白、纤连蛋白、层连蛋白以及蛋白多糖等，调节组织正常的损伤修复，其过量生成则与慢性纤维化有关。信号转导时，配体与TβR-Ⅱ结合后，TβR-Ⅱ自身发生二聚化，然后与TβR-Ⅰ结合形成四聚体，TβR-Ⅱ使TβR-Ⅰ胞内区的GS(glycine serine)区磷酸化，激活TβR-Ⅰ，启动细胞的信号转导。 TGFβ1的肾内表达位点，国外已有许多报道，但各说纷纭，尚无定论。有关TGF-βRⅠ、Ⅱ在人类多种肾小球疾病中的表达及与凝血纤溶因子的相互关系的研究国内外均报道甚少。为此，本研究做了如下叁方面的探讨。l第一部分] 转化生长因子pl及其I、n型受体在人类肾小球 疾病中的肾内表达位点目的:探讨转化生长因子pl(transforminggrowth factor pl，TGF一pl)及其I、11型受体(TGF一p Typel、llReeeptor，TGF一p RI、11)的肾内表达位点孕其与各肾小球疾病的关系。方法;采用免疫组化SABC法检测系膜增生性肾炎(MspGN)22例，系膜毛细一xfll管性肾炎( MpoN)6例，局灶节段性肾小球硬化(F GS)9例，膜性肾病(MN)4例中TGF一pl、TGF-pRI、11的表达。结果:TGF一pl、TGF一p咫、H在各肾小球疾病中均有不同程度的阳性表达。各组中MPGN表达均呈强阳性，差异显着(P<0.05=;各组球一管染色强度存在显着差异(P<0.05)。结论:TGF一日1、TGF一p租、11的过度表达参与肾小球疾病的进展;其在肾小球、小管及间质细胞均有表达位点，但在肾小管一间质表达呈强阳性，而肾小球呈弱表达。提示TGF一pl、TGF一pRI、H一仁要参与肾小管一间质损害。[第二部分」 转化生长因子pl及其I、fl型受体在人类肾小球 疾病中的协同表达及意义目的:探讨转化生长IPJ子p一(transforlni:lggrowth faetorpl，『l’GF一pl)及其I、11型受体戈TGF一p Typel、llReeeptor，TGF一p RI、11)在肾小球疾病「一护的协同表达关系及其意义。方法:采用免疫组化SABC法检测系膜增生性肾炎(MsPGN)22例，系膜毛细血管性肾炎(MPGN)6例，局丈l二节段性肾小球硬化(FGs)9例，)lR性肾病(MN)4例’I，TGF一pl、rl’Gl了一f，RI、11的表达。全部数据行Spearman’s等级相关分析。结果:(l)宁rCF-pl、TGF一p川、11的表达在MPGN最强，其次为MsPGN、FGS、MN。随肾组织炎症程度及纤维化程度加重，其表达增强。同步观察发现’rGF-pl肾内表达与其I、11型受体的表达在阳性染色强度__七及分布仁基木一致。叁者之间存在显着正相关;(2) TGF一pl、TGF一pRI、11的过度表达与肾小球疾病患者的年龄呈负相关，与性别无关。结论:TG卜pl与TCF一pl、11在肾组织内的共同表达，提示叁者对肾小球疾病的进展可能有协同作用。表明:I、11型受体杂二聚体的形成对于TGF一p】和细胞之间的信号传递是十分重要的。仁第叁部分]转化生长因子pl及其1、fl型受体与FN等因素的相关性分析目的:探i寸TGF一日l、l’Gl了一日RI、11与FRA、FN、。:一pl、pLG之I‘「，J的相互关系及在肾小球硬化过程’一仁，的主因索作川。方法:采川Speamlall’s等级相关和FIShef’判别方法，分析系膜增生性肾炎(Msl，GN)，系膜毛细血管性肾炎(MPGN)，局灶节段性肾小球硬化(F Gs)，膜性肾病(MN)，!“rrGF一pl、TGF一p Rl、11与FRA、FN、(，:一I，l、pIJG之{nj自勺丰tlli关系及在肾小球硬化过程中的主因素作用。结果:(l)厂fGF一pl、fGI了-pl丈I、11与FRA、FN、。2一pl、pLG之I侧存在显着一I叁相关，j迪肾红l织炎症程度及纤维化程度加重，其表达增强。(2)’}于小球纤维化是多因索共同作)目的结果。其中TGF一pl、T

戚其学, 张玉侠, 王力芬, 赵霞, 冯婕^[2]2007年在《转化生长因子β_1及其Ⅰ、Ⅱ型受体在人类肾小球疾病中的表达及促使肾组织硬化的机理》文中研究说明目的探讨转化生长因子β1(TGF-β1)及其Ⅰ、Ⅱ型受体(TGF-βRⅠ、Ⅱ)在人类肾小球疾病中的肾内表达位点及其与各肾小球疾病的关系。方法采用免疫组化SABC法检测系膜增生性肾炎(MsPGN)22例,系膜毛细血管性肾炎(MPGN)6例,局灶节段性肾小球硬化(FGS)9例,膜性肾病(MN)4例中TGF-β1、TGF-βRⅠ、Ⅱ的表达。结果TGF-β1、TGF-βRⅠ、Ⅱ在各肾小球疾病中均有不同程度的阳性表达。各组中MPGN表达均呈强阳性,差异显着(P<0.05);各组球-管染色强度存在显着差异(P<0.05)。结论TGF-β1、TGF-βRⅠ、Ⅱ的过度表达参与肾小球疾病的进展;其在肾小球、小管及间质细胞均有表达位点,但在肾小管-间质表达呈强阳性,而肾小球呈弱表达。

王丹^[3]2010年在《尾加压素Ⅱ在大鼠肾间质纤维化发生发展中的作用及其机制的研究》文中进行了进一步梳理肾间质纤维化是进展到终末期肾衰竭的共同途径和主要病理学基础，主要病理学变化是肾间质成纤维细胞活化，分泌大量细胞外基质(ECM)，沉积于肾间质，导致肾间质纤维化。近年来，尾加压素Ⅱ(UⅡ)在肾脏疾病中的病理生理作用受到关注，UⅡ及其受体在肾内广泛分布，且具有多种生物学作用。但UⅡ在肾间质纤维化发生发展中的作用尚未阐明。本研究从体内、体外实验两方面进行一系列研究，旨在揭示UⅡ在大鼠肾间质纤维化形成过程中的作用，并探讨作用的机制。在整体水平上，采用单侧输尿管梗阻(UUO)方法诱发大鼠肾间质纤维化模型。实验结果表明，UUO组大鼠血肌酐、尿肌酐、尿素氮水平增高；HE染色及masson染色证实UUO组大鼠肾间质炎细胞浸润，间质扩张，胶原呈带状明显增生；免疫组化、RT-PCR和Western blot结果表明，UUO组大鼠肾组织UⅡ及其受体GPR14含量明显升高，且与致纤维化因子tTG及TGF-β1呈正相关。肾间质成纤维细胞是纤维化时的主要效应细胞，大鼠肾间质成纤维细胞(NRK-49F)容易培养可传代，是一个比较理想的细胞模型。采用MTT法及流式细胞术研究发现UⅡ对NRK-49F的促增殖作用具有浓度依赖性和时间依赖性；UⅡ提高NRK-49F细胞α-SMA的表达，促进其向肌成纤维细胞转分化；UⅡ增加ECM的合成及分泌；提高TGF-β1、CTGF、及tTG的mRNA的表达及蛋白水平；RNA干扰技术的应用进一步证实了UⅡ受体GPR14的重要作用，GPR14基因干扰后，UⅡ的促TGF-β1及CTGF合成明显降低。钙通道阻断剂尼莫地平、钙离子鳌合剂EDTA及UⅡ抗体能不同程度的阻断UⅡ的作用。这些研究结果表明，UⅡ具有促进肾脏成纤维细胞增殖、转分化、ECM沉积及分泌致纤维化活性因子的作用，为研究肾间质纤维化的发生机制和防治措施提供了新的理论依据。

王筝^[4]2014年在《肾络通对梗阻性肾病大鼠炎性介质表达的影响》文中进行了进一步梳理由于先天性或获得性泌尿系梗阻所致的梗阻性肾病是急性或慢性肾功能衰竭的常见原因之一，也是难治性反复发作的尿路感染的常见诱发因素。造成慢性泌尿系梗阻的机制非常复杂，其中包括血液动力学改变、炎性介质、血管活性物质、氧化应激等因素的共同参与，最终导致肾脏损伤及肾功能衰竭。肾脏病的发生与肾素-血管紧张素-醛固酮系统(Renin-angiotensin-aldosterone, RAAS)有密切关系，目前对血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ, AngⅡ)的研究较多，其通过转化生长因子-β(Transforminggrowth factor-β, TGF-β)途径促进肾间质纤维化(Renal interstitial fibrosis,RIF)的机制已经比较明确，应用血管紧张素转化酶抑制剂(angiotensinconverting enzyme inhibitors, ACEI)及血管紧张素Ⅱ受体阻断剂(angiotensin II receptor blockers, ARB)后可减轻慢性肾脏病患者肾脏结构和功能的损伤，但仍有不少患者，即便足量的ACEI及ARB治疗亦未能有效，说明有其他因素如炎性损伤、氧化应激的参与。已有的研究表明，炎性损伤在慢性疾病持续进展中发挥重要作用，故抗炎治疗对于慢性疾病的预后有重要意义。这种炎性损伤并非单纯由外界感染所致，而是以内源性炎性损伤为主，且与RIF的持续进展密切相关，炎性介质在其中的作用也得以重视。有研究指出炎性介质例如单核细胞趋化蛋白-1(monocytechemotactic protein1, MCP-1)、白介素-1β(Interleukin1β, IL-1β)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factorα, TNF-α)和诱导型一氧化氮合酶(inducednitric oxide synthase，iNOS)是各种慢性肾脏疾病中引起肾脏炎症和纤维化的重要因素。随着对RAAS的深入研究，发现除了AngⅡ外，醛固酮也可通过激活其下游效应介质血清糖皮质激素诱导蛋白激酶1(Serum andglucocorticoid-induced protein kinase1, SGK-1)及核转录因子κB (NuclearfactorκB, NF-κB)、氧化应激等多种途径导致肾脏炎性细胞浸润和细胞外基质(extracellular matrix, ECM)积聚，最终导致RIF的进展，故阻断醛固酮活化造成的炎性损伤对于减缓肾脏病的进展有重要意义。本次实验通过单侧输尿管结扎(unilateral ureteral obstruction, UUO)建立梗阻性肾病间质纤维化实验动物模型，观察盐皮质激素受体阻断剂依普利酮和化瘀涤痰通络方肾络通煎剂对单侧输尿管梗阻大鼠炎性介质表达的影响，利用实时定量荧光聚合酶链式反应(Real-time polymerase Chain Reaction, Real-timePCR)、免疫组化、蛋白质印迹法(Western blot)、酶联免疫吸附法(enzymelinked immunosorbent assay, ELISA)、放射免疫分析法等技术检测血清醛固酮、血清和糖皮质激素诱导蛋白激酶1(Serum and glucocorticoid-inducedprotein kinase1, SGK-1)及MCP-1、TNF-α、iNOS、IL-1β、核转录因子κB (Nuclear factorκB, NF-κB)和α平滑肌激动蛋白(α-smooth muscleprotein, α-SMA)等指标的变化，从组织、分子、基因水平研究肾络通煎剂的作用机制，为中药治疗梗阻性肾病提供理论和实验依据。第一部分“毒”、“瘀”伤肾机制及关联简述了“毒”和“瘀”的概念、分类、形成机制、两者在肾病中的发病机制，以及毒邪和瘀血的相互影响、毒瘀互结在肾病中的作用、毒瘀相关的分子生物学基础及临床意义等内容。大量实验研究表明，肾间质纤维化是各种慢性肾脏疾病的病理表现和共同通路，而炎性损伤在肾间质纤维化的进程中是一种启动和诱发因素。现代医学研究表明，炎性细胞的浸润、炎性介质的释放、促纤维化细胞因子的表达等均可归属于中医“内毒致病”范畴，而细胞外基质在肾脏的积聚是“瘀”的表现，由此可见，以炎性损伤为特征的“毒”为起因，纤维化为表现的“瘀”为结果，二者交互错杂，导致和加重肾间质纤维化，且贯穿于肾脏病的整个病理过程。同时，也总结出“毒”和“瘀”可作为慢性肾脏病的基本病机。在临床上，肾脏病的进展与感染有密切关系，或因感染而诱发，或因感染而加重，且肾病患者易于感染，这种感染所致的炎性损伤在肾间质纤维化的进展中发挥着重要的作用，抗炎治疗可能是治疗靶点。“毒”、“瘀”病机学说的提出为临床治疗慢性肾脏疾病提供了理论依据，对于慢性肾病的进展可能有重要意义。第二部分肾络通对梗阻性肾病大鼠肾脏组织病理形态学的影响方法：48只Wistar大鼠随机分为假手术组(Sham group)、UUO组(UUOgroup)、依普利酮组(EPL group)、肾络通组(SLT group)，每组12只。实验动物自由进食和饮水，温度条件控制在(22±2)℃。适应性饲养1WK后，除假手术组(Sham group)，其余大鼠按照Iwai T的方法制备单侧输尿管梗阻模型。大鼠给以10%水合氯醛注射后，于左侧中腹部切开皮肤，游离左侧输尿管，分别在输尿管上1/3处和中1/3处用丝线结扎，切断输尿管，逐层缝合皮肤。假手术组仅将输尿管游离但不结扎离断。术后第3天肾脏组织病理显示炎性细胞浸润，第5日后肾间质胶原纤维沉积，术后第10天梗阻侧肾脏明显大于对侧，肾间质大量炎性细胞浸润以及胶原纤维沉积，肾小管上皮细胞变性、浊肿、脱落甚至坏死，肾小管部分萎缩，管腔闭塞或扩张，与文献报道相似，符合肾间质纤维化病理改变，模型复制成功。本次实验成功率为92％，UUO术后大鼠死亡5只，用备用大鼠补足。术后开始给药，依普利酮组给以依普利酮100mg/(kg.d)从饲料中加入，肾络通组给以肾络通煎剂26g/(kg.d)入水瓶饮用，假手术组及UUO组给予等容量生理盐水饮用。均每天1次。连续干预10天。观察一般情况。于实验结束时，称重，断头取血，分离血清，用于指标检测；取左侧(梗阻侧)肾脏称重，计算各组肾重/体重比值，进行肾脏组织HE、MASSON染色，观察组织病理学改变。数据资料结果使用SPSS13.0for windows统计软件分析处理。各组数据比较前先进行正态性及方差齐性检验，满足正态性及方差齐性者，采用方差分析，多组比较采用单因素方差分析(One-wayANOVA)，组间比较采用LSD检验。数值变量以均数加减标准差(x±s)表示。显着性差异水平以0.05和0.01为标准。结果：1各组大鼠一般情况比较实验中大鼠死亡5只，用备用大鼠补足。整个实验过程中假手术组大鼠一般情况良好：每日饮食、饮水量稳定，体重逐步增长，毛发有光泽，活动敏捷，对外界刺激反应灵敏。UUO术后1天，造模动物的进食量、饮水量、体重均有所下降。术后6天，UUO组大鼠整体状态欠佳：活动较前明显减少，毛发松散无光泽。与假手数组相比，造模动物体重不增反而下降。UUO手术10天后，造模大鼠体重增长缓慢，且与假手术组有显着性差异(P<0.01, P<0.05)；与UUO组相比，依普利酮组及肾络通组大鼠梗阻侧肾重，肾重/体重指数明显下降(P<0.01, P<0.05)。UUO手术后，造模大鼠进食量、饮水量、24h尿量均有所下降，但各组之间无明显差异(P>0.05)。2各组大鼠肾组织病理形态学改变HE染色显示，假手术组肾脏结构基本正常，肾小管上皮细胞排列整齐，无浊肿，间质无水肿，偶见炎性细胞浸润；UUO组肾间质大量炎性细胞浸润，肾小管明显扩张，上皮细胞变性、浊肿、脱落甚至坏死；依普利酮组及肾络通组小管扩张及上皮细胞水肿坏死与UUO组基本相同，但炎性细胞浸润明显减轻。Masson染色显示，假手术组有少量胶原纤维表达，可见于肾小球/肾小管基底膜及肾间质；UUO组结构紊乱，胶原成分显着增多，以肾间质为主；依普利酮组及肾络通组胶原纤维表达较假手术组增多，但与UUO组相比明显减少。3各组大鼠肾间质炎性细胞计数比较与假手术组比较，UUO组大鼠炎性细胞浸润明显增多(P<0.01)。与UUO组相比，依普利酮组、肾络通组大鼠炎性细胞浸润减少有显着性差异(P<0.01, P<0.05)。与髓质区相比，皮质区炎性细胞浸润明显增多有显着性差异(P<0.01, P<0.05)；与皮质区比较，皮髓交界区质区炎性细胞浸润减少，有显着性差异(P<0.01, P<0.05)。第叁部分肾络通对梗阻性肾病大鼠MCP-1、TNF-α、IL-1β、iNOS等炎性介质表达的影响方法：动物分组、模型复制、给药方法同第二部分，共10天。实验结束时留取血清和肾脏标本，采用ELISA测定血清MCP-1含量，放射免疫法测定血清TNF-α、iNOS、IL-1β含量，Real time-PCR、免疫组化、Western blot检测MCP-1、TNF-αmRNA及蛋白的表达。统计学方法同第二部分。结果：1各组大鼠血清MCP-1、TNF-α、iNOS、IL-1β表达比较与假手术组比较，UUO组中血清MCP-1、TNF-α、iNOS、IL-1β含量明显升高，差异有统计学意义(P<0.01, P<0.05)。与UUO组比较，依普利酮组及肾络通组血清MCP-1、TNF-α、iNOS、IL-1β含量均减少，其中以依普利酮组更为明显，差异有统计学意义(P<0.01, P<0.05)。2Real-time PCR检测MCP-1mRNA、TNF-αmRNA的表达与假手术组比较，UUO组中MCP-1mRNA及TNF-αmRNA表达明显增强(P<0.01)。与UUO组比较，依普利酮组及肾络通组MCP-1mRNA及TNF-α mRNA表达均显着下调，其中以依普利酮组更为明显，差异有统计学意义(P<0.01)。3免疫组化检测MCP-1、TNF-α表达假手术组MCP-1、TNF-α呈弱表达， UUO组中MCP、TNF-α表达明显增强，主要表达于肾小管上皮细胞胞浆。与UUO组比较，依普利酮及肾络通组其表达范围及强度均显着减弱。4Western Blot检测MCP-1及TNF-α蛋白表达与假手术组比较，UUO组MCP-1、TNF-α蛋白表达明显上调。与UUO组比较，依普利酮组及肾络通组其表达均被下调，其中以依普利酮组下调更为明显，差异有统计学意义(P<0.01)。第四部分肾络通对梗阻性肾病大鼠血清醛固酮及SGK-1表达的影响方法：动物分组、模型复制、给药方法同第二部分，共10天。实验结束时留取血清和肾脏标本，采用放射免疫分析法检测血清醛固酮含量，Real-time PCR、Western blot测定肾组织SGK-1mRNA及蛋白表达。统计学方法同第二部分。结果：1放射免疫法检测各组大鼠血清醛固酮含量与假手术组比较，UUO组中血清醛固酮含量明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)；与UUO组比较，依普利酮组血清醛固酮含量有下降趋势，但无统计学意义(P>0.05)，肾络通组血清醛固酮含量明显降低，有统计学差异(P<0.01)。2Real-time PCR检测SGK-1mRNA的表达与假手术组比较，UUO组中SGK-1mRNA表达明显增强。与UUO组比较，依普利酮及肾络通组SGK-1mRNA表达均显着下调。3Western Blot检测SGK-1蛋白表达与假手术组比较，UUO组SGK-1蛋白表达明显上调。与UUO组比较，依普利酮组及肾络通组其表达均被下调，其中以依普利酮组下降更为显着。第五部分肾络通对梗阻性肾病大鼠及α-SMA及NF-κB表达的影响方法：动物分组、模型复制、给药方法同第二部分，共10天。实验结束时留取肾脏标本，采用免疫组化、Western Blot检测α-SMA及NF-кB蛋白表达。统计学方法同第二部分。结果：1免疫组化检测各组大鼠NF-κB、α-SMA表达假手术组NF-κB呈弱表达，主要表达于肾小管上皮细胞；UUO组NF-κB表达明显增强，近曲小管尤为明显；依普利酮组及肾络通组NF-κB表达范围及强度较UUO组均明显减弱。假手术组α-SMA仅表达于血管，肾间质及上皮细胞未见表达；UUO组α-SMA表达明显增强，以扩张的肾小管表达为甚，间质亦可见到阳性表达；依普利酮组及肾络通组α-SMA局部呈中度表达，间质可见少量表达。2Western Blot检测各组大鼠α-SMA、NF-кB表达与假手术组比较，UUO组α-SMA、NF-кB蛋白表达明显上调，差异有统计学意义(P<0.01)。与UUO组比较，依普利酮组及肾络通组其表达均被下调，其中以依普利酮组下调更为明显，差异有统计学意义(P<0.01)。结论：1“毒”和“瘀”是慢性肾病的基本病机，以炎性损伤为特征的“毒”为起因，以纤维化为表现的“瘀”为结果，二者相互关联、相互促进，导致和加重肾间质纤维化，且贯穿于肾脏病的整个病理过程。2结扎单侧输尿管复制肾间质纤维化实验动物模型，肾间质炎性细胞浸润及胶原成分显着增多。肾络通及依普利酮能显着减轻UUO诱导的肾实质损伤，减少炎性细胞浸润，延缓间质纤维化进展。3炎性损伤是梗阻性肾病的重要起始因素，炎性介质在其中发挥重要作用。其中，MCP-1、TNF-α、IL-1β及iNOS等炎性介质是慢性肾脏疾病中介导的肾脏炎症和间质纤维化的重要因子。肾络通和依普利酮能下调其表达，从而抑制梗阻性肾病中炎性损伤和炎性细胞浸润，进而延缓间质纤维化的进展。4醛固酮可通过激活其下游效应介质SGK-1引起肾脏炎性损伤。肾络通和依普利酮能降低血清醛固酮含量，下调SGK-1mRNA和蛋白表达，从而进一步抑制梗阻性肾病炎性损伤~#

韩琳^[5]2007年在《肾上腺髓质素抑制细胞增殖的作用及鳖甲煎丸对其表达的影响》文中研究表明目的:肾间质纤维化(tubulointerstitial,TIF)是各种原因所致肾脏疾病进展至终末期肾功能衰竭的共同病理特征。大量临床病理资料表明,各种原因引起的慢性肾功能损伤与肾小管间质纤维化病变的严重程度较肾小球病变更为密切。所以寻找具有多种治疗作用,在不同途径和阶段拮抗肾间质纤维化形成,无毒或低毒的安全药物对肾脏疾病的治疗有很大的意义。研究表明肾脏小管间质疾病与细胞增殖有关,细胞增殖在肾间质纤维化进程中起重要作用。单侧输尿管结扎模型诱导了严重的小管间质损害,在疾病过程中表现为小管间质细胞增生,间质单核细胞浸润并伴有小管上皮细胞增生和间质肌成纤维(myofibroblast, MyoF)增生。细胞的过度增殖与血管紧张素II(Angiotensin, AngII)及转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)有关并可被其受体拮抗剂阻断。肾上腺髓质素(adrenomedullin,ADM)是一种新发现的内源性血管活性肽,广泛存在于机体的各个重要脏器和多种组织,其主要的生理功能为扩张血管、降低血压、排钠利尿,在心肾功能调节中发挥重要作用。近期有研究表明ADM具有抑制TGF-β1刺激胶原合成和分泌从而起到拮抗肾间质纤维化的作用,成为国际上的研究热点。中医药在肾脏病的治疗中发挥着很好的作用,动物实验显示活血化瘀中药能抑制血管紧张素II、转化生长因子的表达,减少细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的沉积,起到减轻肾间质纤维化的作用,这种作用与其它血管活性肽的参与是否有关尚不清楚,为了证明其可能的作用机制,我们采用肾上腺髓质素基因敲除(adrenomedullin knockout, AMKO)小鼠复制肾间质纤维化实验动物模型,观察在肾上腺髓质素基因缺失状态下细胞增殖的变化,观察与野生小鼠的区别及血管紧张素II受体拮抗剂(angiotensinII receptor blocker, AT1RB)的治疗作用。并给予间质纤维化模型大鼠活血化瘀、软坚散结的鳖甲煎丸(Biejiajian pill, BJJW)进行干预治疗,观察肾上腺髓质素抑制细胞增殖的作用及鳖甲煎丸对其表达的影响,来探讨鳖甲煎丸拮抗肾间质纤维化的可能的作用机理。第一部分细胞增殖在肾间质纤维化野生小鼠肾脏中的作用方法:选用SPE57BL/6J KWL纯系雌性小鼠(WT),体重16-22g,8周龄,适应性喂养一周,测尿蛋白、尿红细胞为阴性者用于实验。随机分为假手术组(WT-Sham)、模型组(WT-UUO)、缬沙坦组(WT-UUOV)叁组,每组10只。除假手术组外,各组动物结扎左侧输尿管,术前一天分别灌入生理盐水和药物,于手术后第六天全部小鼠经麻醉后摘取左侧肾脏用4%的多聚甲醛固定,石蜡包埋,行HE及Masson染色进行病理学观察,并分别采用免疫组化及原位杂交方法检测PCNA、TGF-β1、Col III的蛋白及TGF-β1基因水平的表达。TGF-β1、PCNA、Col III、β-actin相对含量用相同PCR反应中光带的强度来衡量mRNA在各种基因应答中的表达。结果1肾组织病理学观察结果HE染色显示:假手术组小鼠肾组织切片未见异常。模型组肾组织切片肾脏皮质和髓质间隙增宽,近曲小管上皮细胞水肿、远曲小管扩张,上皮细胞脱落、坏死及细胞管型形成。缬沙坦治疗组小鼠肾脏病理损伤仍然严重,但优于模型组。Masson染色显示:假手术组小鼠肾脏无异常;模型组小管扩张,小管基底膜变薄,并出现了小管萎缩,间质胶原成分明显增多;缬沙坦治疗组胶原成分增多但较模型组轻。2 PCNA、Col III、TGF-β1免疫组化检测结果PCNA:假手术组小鼠肾组织中有少量PCNA阳性细胞表达;与假手术组相比UUO组小鼠PCNA阳性细胞数明显增加(p﹤0.001),与模型组相比缬沙坦治疗组PCNA阳性细胞数明显减少( p﹤0.001)。III型胶原:假手术组肾组织中仅有微量III型胶原表达,与假手术组相比UUO组在小管间质区III型胶原沉积增多(p﹤0.05);缬沙坦组有III型胶原的沉积但较UUO组轻,与UUO组相比有显着性差异(p﹤0.05)。TGF-β1:假手术组肾组织中TGF-β1在肾小管上皮细胞及肾小球内呈弱阳性表达,其余各组表达显着增强,其中,模型组与假手术组相比显着升高(p﹤0.001);与模型组相比缬沙坦组TGF-β1的表达明显减弱(p﹤0.001)。3 PCNA、Col III、TGF-β1mRNA的表达结果3.1 PCNA、Col III、TGF-β1mRNA的表达UUO组RT-PCR半定量光密度测定结果明显高于假手术组(p﹤0.001,p﹤0.05,p﹤0.001),缬沙坦组与UUO组相比明显降低(p﹤0.05,p﹤0.05,p﹤0.05)。3.2 TGF-β1组织原位杂交结果显示TGF-β1mRNA在假手术组小鼠肾小管上皮细胞及肾小球内呈弱阳性表达,UUO组与假手术组比较明显增强(p﹤0.05),尤其在近曲肾小管上皮细胞胞浆内表达明显,缬沙坦治疗组表达增强但弱于UUO组(p﹤0.05)。第二部分肾上腺髓质素在肾上腺髓质素基因敲除小鼠肾脏细胞增殖中的作用方法:选用肾上腺髓质素基因敲除小鼠(AMKO),雌性,体重16-22g,喂养8周(东京医科大学实验动物中心提供),这些小鼠均是在实验室通过基因定位发生了ADM基因缺失的后代。随机分为假手术组(AMKO-Sham)、模型组(AMKO-UUO)、缬沙坦组(AMKO-UUOV),每组5只。除假手术组外,各组动物结扎左侧输尿管,术前一天分别灌入生理盐水和药物,于手术后第六天全部小鼠经麻醉后摘取左侧肾脏进行病理学观察,并分别采用免疫组化方法检测PCNA、TGFβ1、Col III蛋白表达及分别用组织原位杂交、RT-PCR方法检测TGFβ1和PCNA、TGFβ1、Col III在基因水平的表达。结果1肾脏病理学观察结果HE染色显示: AMKO假手术组小鼠肾脏组织切片表现未见异常,UUO组表现为近曲小管上皮细胞水肿、远曲小管扩张,上皮细胞缺失、坏死及细胞管型形成。缬沙坦治疗组略轻于UUO组。Masson染色显示:假手术组小鼠肾脏无异常;UUO组肾组织切片表现为小管扩张,小管基底膜变薄,并出现了小管萎缩,间质胶原成分明显增多;缬沙坦治疗组胶原成分增多但较UUO组为轻。与WT小鼠相比, AMKO各组小鼠胶原成分明显增多,经缬沙坦治疗有所改善。2 PCNA、ColIII、TGF-β1免疫组化检测结果PCNA免疫组化结果显示:假手术组(AMKO-Sham)小鼠中有少量PCNA阳性细胞表达,但与野生小鼠假手术组(WT-Sham)比较数量增加;AMKO-UUO组小鼠PCNA阳性细胞数与AMKO-Sham相比显着增多(p﹤0.001);经缬沙坦治疗后,PCNA阳性细胞的数量较AMKO-UUO组明显减少(p﹤0.001)。与WT-UUO、WT-UUOV组小鼠相比AMKO-UUO、AMKO-UUOV组小鼠PCNA阳性细胞数增多。III型胶原:AMKO-Sham组小鼠中无表达,模型组(AMKO-UUO)小鼠在小管间质区III型胶原沉积增多(p﹤0.001),基因敲除小鼠UUO组比野生小鼠UUO组III型胶原的表达明显,通过缬沙坦治疗,AMKO-UUOV组的III型胶原沉积较AMKO-UUO组减轻(p﹤0.001)。TGF-β1:结果显示在肾小管上皮细胞及肾小球内呈弱阳性表达,其余各组表达显着增强,其中,模型组与假手术组相比显着升高(p﹤0.01);缬沙坦组TGF-β1的表达较模型组弱(p﹤0.01),肾上腺髓质素基因敲除小鼠各组表达与野生小鼠相比均增强。3 PCNA、Col III、TGF-β1mRNA的表达结果3.1 PCNA、Col III、TGF-β1mRNA的RT-PCR半定量光密度测定结果显示:UUO组明显高于假手术组(p﹤0.05,p﹤0.05,p﹤0.05),缬沙坦组与UUO组相比明显降低(p﹤0.05,p﹤0.05,p﹤0.05)。肾上腺髓质素基因敲除小鼠各组表达与野生小鼠相比均增强。2.2 TGF-β1组织原位杂交结果显示:TGF-β1mRNA在假手术组肾小管上皮细胞及肾小球内呈弱阳性表达,UUO组与假手术组比较明显增强(p<0.05),尤其在近曲肾小管上皮细胞胞浆内表达明显,缬沙坦治疗组表达增强但弱于UUO组(p﹤0.05)。肾上腺髓质素基因敲除小鼠TGF-β1mRNA表达与野生小鼠相比增强。第叁部分鳖甲煎丸对肾间质纤维化实验大鼠细胞增殖的影响方法:选用SD大鼠40只,雌性,体重180±10g。适应性喂养一周,测尿蛋白、尿红细胞为阴性者用于实验。随机分为假手术组(Sham)、模型组(UUO)、鳖甲煎丸组(UUOB)、缬沙坦组(UUOV),每组10只。除假手术组外,各组动物结扎左侧输尿管并在术前一天灌胃给药,假手术组与模型组分别灌入等量的生理盐水,共给药14天。于实验第14天全部杀检,实验结束时,断头取血,分离血清;采用苦味酸法、二乙酰—肟法,分别测定血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN);取左侧肾脏称重并进行组织病理学观察,取部分肾组织置于70%的乙醇中固定,并送流式细胞检测,测定PCNA阳性细胞蛋白表达量、细胞凋亡及细胞周期。并分别采用免疫组化、RT-PCR方法检测PCNA在蛋白及基因水平的表达。结果1一般情况、肾重/体重、血肌酐、尿素氮检测结果模型组大鼠在手术后体重增长缓慢,毛色差。实验结束时,左侧肾脏体积增大,肾重/体重模型组比假手术组明显增高(p﹤0.001),缬沙坦组及鳖甲煎丸组与模型组比较显着降低(p﹤0.05,p﹤0.05),其中缬沙坦组较鳖甲煎丸组略低,但两组间无显着性差异(p﹥0.05)。血肌酐测定结果显示,模型组明显高于假手术组(p﹤0.001﹚,缬沙坦组、鳖甲煎丸组血肌酐与模型组比较显着降低(p﹤0.001,p﹤0.001﹚,其中鳖甲煎丸组的血肌酐低于缬沙坦组,但无统计学意义(p﹥0.05)。尿素氮测定结果显示,模型组较假手术组明显升高(p﹤0.01),缬沙坦组、鳖甲煎丸组与模型组相比显着降低(p﹤0.01,p﹤0.01﹚,其中鳖甲煎丸组尿素氮低于缬沙坦组,但无统计学意义(p﹥0.05)。2肾组织病理学观察结果HE及天狼猩红偏振光染色结果显示:模型组间质大量炎细胞浸润和纤维组织增生,肾小管部分萎缩、管腔闭塞或扩张,肾小球数目明显减少,面积缩小。肾小囊粘连或扩张,小囊周围大量纤维组织增生。各治疗组间质可见多少不等的炎细胞浸润,少量纤维组织增生,肾小管轻度扩张,部分肾小球轻度萎缩,小囊扩张,肾小球数量无明显改变。图像分析显示:模型组肾间质纤维化程度较假手术组明显加重(P﹤0.001);缬沙坦组、鳖甲煎丸组与模型组比较,肾间质纤维化面积明显减少(P﹤0.001,P﹤0.001),提示鳖甲煎丸及缬沙坦均有拮抗肾间质纤维化的作用。其中,鳖甲煎丸组略优于缬沙坦组,但无显着性差异(p﹥0.05)。3 PCNA免疫组化检测结果结果显示:假手术组大鼠肾组织中有少量PCNA阳性细胞表达; UUO组大鼠PCNA阳性细胞数表达较假手术组显着增多(p﹤0.001),鳖甲煎丸、缬沙坦治疗组较UUO组PCNA表达明显减少(p﹤0.001 ,p﹤0.001),鳖甲煎丸少于缬沙坦组,但两组相比无显着性差异(p﹥0.05)。3 PCNA mRNA的RT-PCR半定量光密度测定结果结果显示:PCNA mRNA的表达UUO组明显高于假手术组(p﹤0.001),各治疗组与UUO组相比明显降低(p﹤0.01,p﹤0.01),其中鳖甲煎丸组低于缬沙坦组,但两组相比无统计学意义(p﹥0.05)。5鳖甲煎丸对UUO大鼠肾脏PCNA阳性细胞蛋白表达量、细胞凋亡和细胞周期的影响5.1各组大鼠PCNA细胞蛋白表达量的改变结果显示:PCNA蛋白表达量模型组较假手术组显着升高(p﹤0.001),而鳖甲煎丸组和缬沙坦组PCNA的蛋白表达量较模型组明显降低(p﹤0.05,p﹤0.05﹚,鳖甲煎丸组PCNA的蛋白表达量略低于缬沙坦组,但两组相比无统计学意义(p﹥0.05)。提示两种药物均有抑制细胞增殖的作用。5.2各组大鼠PCNA细胞凋亡率及凋亡/增殖比值的改变5.2.1 PCNA细胞凋亡率的改变结果显示:PCNA细胞凋亡率在假手术组最低,模型组明显高于假手术组(p﹤0.001),而鳖甲煎丸组和缬沙坦组PCNA细胞凋亡率明显低于模型组(p﹤0.05,p﹤0.05),其中鳖甲煎丸组PCNA的细胞凋亡率略低于缬沙坦组,但两组比较无显着性差异(p﹥0.05)。5.2.2 PCNA阳性细胞凋亡/增殖的比值的改变结果显示:单侧输尿管结扎术后,大鼠PCNA凋亡/增殖的比值模型组较假手术组显着降低( p﹤0.01),鳖甲煎丸组、缬沙坦组较模型组显着升高( p﹤0.05, p﹤0.05),两治疗组比较鳖甲煎丸组略高于缬沙坦组,但两组之间比较无统计学意义(p﹥0.05)。提示两种药物均有促进PCNA细胞凋亡,从而抑制细胞增殖,延缓肾间质纤维化发生的作用。5.3各组大鼠PCNA细胞周期的改变5.3.1 PCNA处于S期的细胞比例比较结果结果显示:PCNA处于S期的细胞比例在假手术组最低,其它各组都较假手术组升高,其中模型组最高,与假手术组比较有显着性差异(p﹤0.001),经鳖甲煎丸、缬沙坦治疗后处于S期的细胞比例较模型组明显降低(p﹤0.05,p﹤0.05),其中鳖甲煎丸组高于缬沙坦组,但两组比较无显着性差异(p﹥0.05)。5.3.2 PCNA处于G0/G1期的细胞比例比较结果结果显示:PCNA处于G0/G1期的细胞比例在假手术组最高,其它各组都较假手术组降低,其中模型组最低,与假手术组比较有显着性差异(p﹤0.001),经鳖甲煎丸、缬沙坦治疗后处于G0/G1期的细胞比例较模型组明显升高(p﹤0.01,p﹤0.01),其中鳖甲煎丸组低于缬沙坦组,但两组比较无显着性差异(p﹥0.05)。5.3.3 PCNA处于G2/M期的细胞比例比较结果结果显示:各组处于G2/M期的细胞比例相比变化不明显,各组相比均无显着性差异。总之,以上结果提示鳖甲煎丸、缬沙坦组两种药物可抑制PCNA细胞有丝分裂,使大量PCNA细胞阻滞在G0/G1期,阻止其由G1期进入S期,从而抑制了细胞增殖。第四部分鳖甲煎丸对肾间质纤维化实验大鼠肾脏TGF-β1、Col III表达的影响方法:选用动物,分组及模型复制,给药方法,标本处理同第叁部分,采用免疫组化、RT-PCR方法检测鳖甲煎丸对TGF-β1、Col III在蛋白及基因水平表达的影响。结果1 TGF-β1、Col III免疫组化检测结果1.1 ColⅢ的蛋白表达、分布及半定量分析结果显示:ColⅢ主要表达于肾间质。假手术组大鼠肾间质ColⅢ呈弱阳性表达,其余各组表达显着增强,为条索状或成片块状。其中,模型组与假手术组相比ColⅢ的阳性面积及积分光密度值均显着性升高(p﹤0.001,p﹤0.001);缬沙坦组、鳖甲煎组与模型组相比,ColⅢ的阳性面积及积分光密度值均显着性下降(p﹤0.001,p﹤0.001 ;p﹤0.001,p﹤0.001),提示鳖甲煎、缬沙坦均可抑制梗阻侧肾组织中ColⅢ的蛋白表达,其中,鳖甲煎组优于缬沙坦组,但无显着性差异(p﹥0.05,p﹥0.05)。1.2 TGF-β1的蛋白表达、分布及半定量分析结果显示:假手术组在肾小管上皮细胞及肾小球内TGF-β1蛋白的表达均为弱阳性;其余各组表达显着增强,见于肾小管上皮细胞、间质细胞及肾小球内。其中,模型组较假手术组TGF-β1表达的阳性面积及积分光密度值均呈显着性升高(P﹤0.001,P﹤0.001);缬沙坦组、鳖甲煎组与模型组相比,TGF-β1的阳性面积及积分光密度值均显着性下降(P﹤0.001,P﹤0.001;P﹤0.001,P﹤0.001),提示鳖甲煎丸、缬沙坦均可抑制梗阻侧肾组织中TGF-β1的蛋白表达。其中,鳖甲煎组优于缬沙坦组,但两组相比无显着性差异(p﹥0.05,p﹥0.05)。2 Col III、TGF-β1mRNA的RT-PCR半定量光密度测定结果2.1 Col IIImRNA的表达结果显示:UUO组明显高于假手术组(p﹤0.001),各治疗组与UUO组相比明显降低(p﹤0.05,p﹤0.01),其中鳖甲煎组低于缬沙坦组,但无统计学意义(p﹥0.05)。2.2 TGF-β1 mRNA的表达结果显示:UUO组明显高于假手术组(p﹤0.001),各治疗组与UUO组相比明显降低(p﹤0.05,p﹤0.01),其中缬沙坦组低于鳖甲煎丸组,但无统计学意义(p﹥0.05)以上结果提示鳖甲煎丸、缬沙坦能下调Col III、TGF-β1的蛋白和mRNA的表达,延缓肾间质纤维化的发生。第五部分鳖甲煎丸对肾间质纤维化实验大鼠肾脏肾上腺髓质素表达的影响方法:选用动物,分组及模型复制,给药方法,同第叁部分。留取部分新鲜肾组织匀浆,用放射免疫法检测组织中ADM的蛋白含量,其余标本处理方法同第叁部分,采用免疫组化、原位杂交和RT-PCR方法检测ADM在蛋白及基因水平表达,观察鳖甲煎丸对其表达的影响。结果1肾组织肾上腺髓质素蛋白含量的测定结果显示:假手术组大鼠肾组织中肾上腺髓质素含量高于模型组(p﹤0.001),鳖甲煎丸组、缬沙坦组的含量较模型组升高(p﹤0.001,p﹤0.05﹚,鳖甲煎丸组肾上腺髓质素的含量高于缬沙坦组,但无统计学意义(p﹥0.05)。2肾组织肾上腺髓质素免疫组化检测结果结果显示:肾上腺髓质素在假手术组表达较为广泛,在皮质及髓质均有表达且以髓质表达为明显,主要表达于肾小管上皮细胞胞浆,UUO组肾上腺髓质素的表达较假手术组明显减弱,在髓质肾小管上皮细胞无阳性表达,仅在皮质部分区域有微弱表达,其阳性表达面积、积分光密度与假手术组比较有显着性差异(p﹤0.001,p﹤0.001﹚;鳖甲煎丸组、缬沙坦组肾上腺髓质素的表达较UUO组明显增强,在皮质及髓质的肾小管上皮细胞胞浆广泛表达,肾小球有微量表达,其阳性表达面积、积分光密度与模型组比较有显着性差异(p﹤0.001,p﹤0.001;p﹤0.001,p﹤0.001﹚,其中,鳖甲煎丸组的表达强于缬沙坦组,但两组相比无显着性差异(p﹥0.05,p﹥0.05)。提示鳖甲煎丸、缬沙坦能上调肾组织肾上腺髓质素的蛋白表达。3 ADM mRNA的表达、分布及半定量分析结果3.1组织原位杂交ADM mRNA的表达结果显示:假手术组主要表达于肾小管上皮细胞胞浆,呈弱表达,但远曲小管稍明显。UUO组表达明显减弱,仅见于近曲小管上皮细胞,其阳性面积及积分光密度值与假手术组相比均呈显着性降低(p﹤0.001,p﹤0.001﹚。鳖甲煎丸组、缬沙坦组肾上腺髓质素的表达的阳性面积及积分光密度值与模型组相比均呈显着性升高(p﹤0.001,p﹤0.001;p﹤0.001,p﹤0.001﹚,远曲小管上皮细胞由于单侧输尿管结扎因素大量脱落而减弱,但近曲小管表达明显增强。鳖甲煎丸组优于缬沙坦组,但两组相比无显着性差异(p﹥0.05,p﹥0.05)。3.2 ADM mRNA的RT-PCR半定量光密度测定结果结果显示: ADM mRNA的表达在假手术组最强,UUO组的ADM mRNA表达较假手术组明显减弱(p﹤0.001),鳖甲煎组、缬沙坦组ADM mRNA的表达较UUO组明显增强(p﹤0.05,p﹤0.05)。鳖甲煎丸组优于缬沙坦组,但两组相比无显着性差异(p﹥0.05)。结果提示鳖甲煎丸、缬沙坦能上调ADM的mRNA的表达。结论本实验采用野生小鼠、肾上腺髓质素基因敲除小鼠和SD大鼠成功复制了肾间质纤维化模型,给与鳖甲煎丸进行治疗并设立缬沙坦对照组,综合分析实验结果,可以得出以下结论:1增殖细胞核抗原可反映间质纤维化进程中细胞的增殖程度,在UUO模型中,其表达明显增强。TGF-β1的蛋白和mRNA的表达明显上调,与细胞增殖密切相关;III型胶原的表达在模型组亦增强,加重了间质纤维化的程度。2血管紧张素II受体拮抗剂缬沙坦能通过阻断血管紧张素II及抑制TGF-β1的过度表达,减轻肾组织的病理损害,减少病变肾组织ECM成分的积聚,延缓肾间质纤维化的进程。3采用肾上腺髓质素基因敲除小鼠复制肾间质纤维化实验动物模型,观察在肾上腺髓质素基因缺失状态下细胞增殖的变化,结果显示肾上腺髓质素在细胞增殖过程中起着重要的作用,能够下调PCNA的表达。4 ADM基因缺失小鼠较野生小鼠纤维化程度更明显,可被血管紧张素II受体拮抗剂缬沙坦部分抑制,说明ADM与缬沙坦的作用有一定交叉,这可能是通过抑制TGF-β1的过度表达而实现的。5 ADM通过抑制诱导TGF-β1而抑制细胞外基质积聚减轻纤维化程度,同时ADM可能通过抑制TGF-β1而抑制细胞增殖表现出对肾脏的保护作用。6鳖甲煎丸可以增加肾组织中的ADM的含量,上调ADM在蛋白及基因水平的表达,并抑制TGF-β1的蛋白和基因表达从而抑制细胞增殖、减少胶原的合成,起到防治纤维化的作用。这可能是中医药治疗肾脏疾病的可能作用机制之一。7流式细胞检测结果提示鳖甲煎丸和缬

杨敏^[6]2007年在《黄芪卫矛合剂对糖尿病肾病大鼠肾脏内皮细胞损伤的干预研究》文中认为糖尿病肾病(diabeticnephropathy,DN)是糖尿病(diabetesmellitus,DM)重要的微血管并发症之一,也是导致慢性肾功能不全的主要原因。目前DN的发病机制尚不清楚,亦缺乏有效的治疗手段。因此,积极地寻找有效方法治疗DN对于延长患者寿命,提高生活质量具有重大意义。本论文从文献综述、理论和实验研究叁方面加以探讨,实验研究方面选用了体现益气行血、消症化积治法的黄芪卫矛合剂,重点观察其对单侧肾切除合并注射链脲佐菌素DN大鼠模型肾脏内皮细胞损伤的干预作用。1文献研究:就近年来现代医学对于DN的发病机理、治疗用药、研究方法;中医药防治DN作用机制进展;内皮细胞和DN关系;实验性DN动物模型的建立及研究方法等方面研究动态进行了较为系统的总结和综述。2理论研究:在中医理论指导下,结合现代研究成果,对消渴病肾病的病名、病机理论进行了阐述,认为消渴病肾病是以肾元亏虚、气阴两伤为本,气血瘀滞、痰湿内停为标,久病入络、肾生症瘕为发病关键;初步阐明了微型症瘕假说与肾脏内皮细胞损伤机制的相关性,确立了“益气行血、消症散结”为DN基本治法,为消渴病肾病的研究思路及治法提供了理论依据。3实验研究:目的:观察黄芪卫矛合剂对实验性糖尿病肾病大鼠肾脏内皮细胞损伤的干预作用及机制。方法:采用单侧肾切除加链脲佐菌素(STZ)尾静脉注射建立糖尿病肾病动物模型,随机分为模型组(M)、黄芪卫矛合剂治疗组(H)、科素亚治疗组(K),另设假手术组为空白对照组(F)。0、4、8、12周动态观察大鼠一般状态、体重、尿量、空腹血糖(FBG)、糖化血红蛋白(HbA1c)、血脂、24小时尿蛋白定量、肾功能的变化,光镜观察肾小球及肾小管间质形态学和肾小管周围血管(PCT)网改变;采用双抗体夹心酶联免疫吸附(ELISA)法检测血清层粘连蛋白(LN)和Ⅳ型胶原(typeⅣcollagen)含量,硝酸还原酶法检测肾组织一氧化氮(NO)含量;放射免疫法检测内皮素-1(ET-1)的含量;采用Western-blot的方法测定肾组织中肝细胞生长因子(HGF)和转化生长因子β1(TGF-β1)的蛋白表达。结果:①黄芪卫矛合剂能显着降低DN大鼠空腹血糖和糖化血红蛋白,并具有降低血清胆固醇(TC)、甘油叁酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)而调节脂代谢的作用,与模型组比较有显着差异(P<0.05,P<0.01);能够降低DN大鼠升高的血清BUN和Scr,与模型组比较有显着差异(P<0.05);降低实验性DN大鼠24小时尿蛋白排泄量,与模型组比较有极显着差异(P<0.01)。提示黄芪卫矛合剂对实验性DN大鼠具有良好的调节糖、脂代谢作用,并具有减少尿蛋白排出、保护肾功能的作用。尤其在降糖、调脂、改善肾功能方面疗效优于科素亚组。其降低24小时尿蛋白的作用不如科素亚,但差异无统计学意义(P>0.05)。病理形态观察显示:模型组光镜下可见肾小球基底膜增厚,系膜区弥漫性增宽,细胞外基质(ECM)增多,肾小管纤维化。经黄芪卫矛合剂治疗后,上述病理改变有显着减轻,提示其对DN大鼠肾脏具有保护作用。科素亚对肾小球也有一定保护作用。②ELISA结果表明:糖尿病肾病大鼠血清LN和Ⅳ型胶原的合成和分泌明显增多,揭示了DN大鼠肾脏受到一定程度损害。在抑制肾小球合成和分泌LN和Ⅳ型胶原方面,黄芪卫矛合剂和科素亚皆能明显降低造模后LN和Ⅳ型胶原(与模型组相比P<0.05),在降低Ⅳ型胶原方面黄芪卫矛合剂优于科素亚组,但在降低LN方面两组之间差异不显着(P>0.05)。表明黄芪卫矛合剂能减少肾小球合成和分泌LN和Ⅳ型胶原,是其防治DN的作用机制之一。③硝酸还原酶法检测表明糖尿病肾病模型组NO含量显着降低,放射免疫法检测显示其ET-1水平比假手术组显着升高,提示DN大鼠NO与ET-1的平衡失调,内皮功能紊乱,揭示了DN大鼠肾脏损害进一步发展。中药黄芪卫矛合剂和科素亚能明显提高NO含量,降低ET-1水平,与模型组比较差异均有显着性统计学意义(P<0.05,P<0.01),两组之间比较差异不显着。提示黄芪卫矛合剂能显着改善糖尿病肾病模型所造成的NO表达减少和ET-1释放增多,从而发挥对肾脏内皮细胞的保护作用。表明黄芪卫矛合剂能显着改善糖尿病肾病大鼠模型所致NO的降低和ET-1增高,一定程度恢复二者的平衡紊乱、改善肾脏内皮功能,在此方面与科素亚比较作用相接近。④采用Westernblot蛋白印迹方法检测各组大鼠肾组织HGF和TGF-β1蛋白表达,研究结果显示:模型组大鼠肾组织中TGF-β1蛋白表达较假手术组明显升高(P<0.05),而HGF蛋白表达较假手术组明显降低(P<0.05),黄芪卫矛合剂和科素亚治疗后可明显下调TGF-β1蛋白表达,上调HGF蛋白表达,以调节HGF和TGF-β1的动态平衡,进一步抑制肾脏内皮细胞损伤,促进肾组织修复。结论:本课题中黄芪卫矛合剂采用“益气行血、消症散结”之法,针对DN“微型症瘕”病机设立,可有效防治糖尿病肾病,其作用机理可能是通过降糖、调脂、降低DN模型大鼠尿蛋白,减轻肾组织病理损伤,抑制细胞外基质主要成分LN和Ⅳ型胶原的合成,调节内皮细胞相关细胞因子NO和ET-1,HGF和TGF-β1的动态平衡发挥作用。其中,部分检测结果显示黄芪卫矛合剂优于科素亚,可能与中药多环节、多靶点治疗作用有一定关系。

郭洁^[7]2009年在《血管生成随增龄在小鼠肾脏中的变化及其机制探讨》文中提出第一部分增龄小鼠肾功能及肾小球血管形态的改变背景:年龄相关的肾脏结构和功能的改变在多种物种中已有研究,但肾小球内的毛细血管密度及其肾小球形态改变与增龄小鼠肾功能改变的关系尚未明确。已知老年肾脏随着年龄的增长,肾脏体积缩小,重量进行性减轻,肾单位数量逐渐减少。组织学上可以观察到肾脏出现局灶和节段性的肾小球硬化,并伴有系膜基质的增宽、基底膜增厚以及毛细血管襻的丧失。在小管间质,可以看到肾小管扩张、萎缩,及间质纤维化和炎细胞浸润。同时肾功能改变表现为尿蛋白增高、肾小球滤过率降低等。因此我们推测增龄肾脏肾功能与形态的变化,尤其是肾小球毛细血管密度存在一定相关性。目的:通过观察增龄C57小鼠肾功能及肾小球形态、肾小球毛细血管密度的变化,探讨增龄小鼠肾小球毛细血管密度及肾小球形态的变化与肾功能改变的关系。方法:将无菌条件下饲养的雌性C57小鼠分为以下四组:4月龄组、9月龄组、12月龄组、20月龄组,各组n=6。采用ELISA的方法测定各组小鼠24小时尿微量白蛋白值,同时用生化法测定各组小鼠血清肌酐水平,观察增龄小鼠肾功能变化趋势。同时通过病理染色,光镜下观察肾小球形态学变化,计算肾小球硬化指数。用免疫组化法和Western-Blot法测定各组小鼠肾组织内转化生长因子TGF-β1的分布和表达量。为了评测各组小鼠肾小球毛细血管密度,分别对各组小鼠进行肾脏灌注荧光染料,切片后共聚焦显微镜下成像,定量分析各组小鼠肾小球内的平均毛细血管密度,并分析增龄小鼠毛细血管密度的改变与肾功能改变的相关性。结果:在4月龄、9月龄、12月龄及20月龄四组C57小鼠中,随月龄增大:(1)、血清肌酐值呈增高趋势,4月龄、9月龄、12月龄及20月龄小鼠分别为10.55±0.08、17.60±1.44、20.66±4.61、28.33±10.11(umol/L),20月龄较其它叁组相比,血清肌酐呈明显上升趋势。(2)、肾小球硬化指数(GSI)呈上升趋势,分别为0.53±0.19、0.69±0.18、1.5±0.70及2.48±0.79。(3)、尿微量白蛋白呈升高趋势,分别为0.96±0.69、1.88±0.22、4.46±0.88及9.11±5.96。(4)、肾小球血管灌注后荧光染料后,4月龄、9月龄及20月龄组中的肾小球内平均荧光强度呈减少趋势,分别为50.126±19.387、35.72±12.376及27.016±9.876,组间P＜0.05。(5)、免疫组化及Western-Blot法检测4组小鼠肾组织内转化生长因子TGF-β1均呈上升趋势,20月龄的表达量约为4月龄的2倍。(6)相关性分析显示增龄小鼠肾小球毛细血管的变化与肾功能变化呈负相关。结论:在增龄小鼠中,随月龄增大,小鼠肾功能减退,表现为血清肌酐增高及尿微量白蛋白增高,同时肾小球硬化程度加剧,肾小球内毛细血管密度减少。第二部分血管新生调节因子及其受体在增龄小鼠肾组织内的改变及其与增龄小鼠肾功能改变的关系背景:血管生长因子(Angiopioetin-1、Angiopoietin-2)及其受体(Tie2)和血管内皮生长因子(VEGF)及其受体(VEGFR:Flt-1、Flk-1)系统是重要的血管生成调节系统。这两个系统的异常表达可以引起血管新生及血管存活的异常。研究已经证实,在糖尿病肾病及多种慢性肾小球疾病中,肾脏局部促血管新生因子的表达改变,从而参与慢性肾脏病的发生和发展,但增龄肾脏局部VEGF-VEGFR及Angiopioetin-tie2的表达及与肾功能改变的的关系有待于进一步研究。目的:通过观察不同月龄的C57小鼠肾组织内的血管生成素及其受体、血管内皮生长因子及其受体基因和蛋白水平的表达变化,探讨其在小鼠肾脏衰老过程中的作用。方法:无菌条件下饲养的C57小鼠分为:4月龄、9月龄、12月龄和20月龄,各组n=6。采用免疫组化的方法定位分析血管内皮生长因子VEGF及血管内皮生长因子受体VEGFR2(Flk-1)在肾脏内的表达部位及其随增龄的表达,并运用图象分析软件分析免疫组化结果。采用Western-Blot方法定量分析四组小鼠肾组织内的血管生成素-1(Ang-1)、血管生成素-2(Ang-2)及其受体(Tie2)和血管内皮生长因子(VEGF)的蛋白表达量随增龄的改变。同时用Realtime-PCR的方法定量检测四组小鼠肾组织内Ang-1、Ang-2及其受体(Tie2)和VEGF及其受体VEGFR2(Flk-1)的mRNA的表达量随增龄的改变趋势。运用统计分析软件,对各组小鼠肾组织内Ang-1、Ang-2、Tie2及VEGF和Flk-1的表达与各组小鼠尿微量白蛋白和肾小球毛细血管密度进行相关性分析,以进一步探讨促血管新生因子与增龄小鼠肾功能改变及肾小球毛细血管密度改变的关系。结果:免疫组化证实:20月龄小鼠肾小球内VEGF阳性细胞数增加,各组动物肾小球内VEGF阳性面积占肾小球面积百分比分别为4.43±0.34%,5.21±0.32%,6.37±0.46%,10.45±0.58%,肾小球内Flk-1阳性面积占肾小球面积百分比分别为1.5±0.45%,1.9±0.36%,3.35±1.49%,6.19±2.01%,20月龄较4月龄P均＜0.05。Western-Blot证实:20月龄小鼠与其它叁组比较,肾组织内Ang-1、Ang-2、Tie2、VEGF的表达均呈下降趋势,20月龄VEGF蛋白表达量较4月龄下降35%;Ang-1表达较4月龄下降15%;Ang-2较4月龄下降10%;Tie2较4月龄下降21%,P均＜0.05。Realtime-PCR结果显示:20月龄组较其它叁组,肾组织内Ang-1、Ang-2、Tie2、VEGF、Flk-1的mRNA水平均呈下降趋势。其中VEGF在4、9、12、20月龄组表达(mRNA/GAPDH)分别为2.328±2.281、0.505±0.377、0.32±0.116、0.183±0.151。Flk-1的表达分别为0.939±0.286,0.579±0.135,0.461±0.033,0.387±0.033。Ang-1四组测定值分别为1.109±0.204,0.433±0.098,0.267±0.061,0.193±0.073。Ang-2四组分别为1.296±1.084,0.608±0.946,0.193±0.148,0.128±0.046。Tie2四组测定值分别为4.857±1.437,1.923±0.833,1.638±1.214,1.466±1.355。其中肾脏局部VEGFmRNA及Ang-1mRNA与24小时尿微量白蛋白及血清肌酐呈负相关(r=-0.685,P＜0.05,r=-0.557,P＜0.05;r=-0.853,P＜0.05,r=-0.786,P＜0.05)。结论:增龄小鼠肾组织内促血管生成调节因子表达下调:VEGF及其受体Flk-1、Ang-1/Ang-2及其受体Tie2表达降低,且增龄肾脏局部促血管新生因子的改变与肾功能改变呈负相关。第叁部分增龄小鼠肾脏局部肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)的变化及其意义背景:众所周知,肾脏局部肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)的过度兴奋参与了CKD的发生和进展,同时在衰老肾脏也中存在局部RAAS的激活。RAAS中主要的效应分子是血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)和醛固酮(Aldo),它们均已被证实与肾脏纤维化密切相关。在RAAS的其它成分中,与AngⅡ密切相关的指标是血管紧张素原(AGT)、AⅡ及其受体(AT1和AT2),而对于Aldo比较重要的是Aldo、盐皮质激素受体(MR)以及决定MR特异性的11β-羟类固醇脱氢酶2(11β-OHSD2)。现已有研究证实AⅡ能促进VEGF和血管生成素系统的表达,参与血管的异常增生,同时Aldo也可通过AⅡ促进缺血诱导的血管新生,但衰老肾脏中的血管新生和RAAS的相互关系目前研究甚少。我们推测在衰老过程中肾脏微血管结构异常将导致局部RAAS相对兴奋,从而进一步参与衰老肾脏的异常血管新生。目的:通过测定增龄C57小鼠肾组织内的RAS成分变化,并分析这些变化与增龄小鼠肾功能和肾小球毛细血管网密度变化的关系,探讨RAS系统在肾脏衰老中的作用。方法:将无菌条件下饲养的雌性C57小鼠分为以下四组:4月龄组、9月龄组、12月龄组、20月龄组,各组n=6。采用放免法测定各组小鼠肾组织内及血浆内血管紧张素Ⅱ的浓度,同时运用Realtime-PCR的方法测定各组小鼠肾组织内AT1a、AT1b、AT2、血管紧张素原(AGT)的水平,并通过Western-Blot的方法,测定各组小鼠肾组织内AT1、AT2、醛固酮受体(MR)、11β-羟类固醇脱氢酶的水平,然后分析RAAS成分的这些改变与增龄肾脏形态和功能改变的关系。结果:在4月龄、9月龄、12月龄及20月龄四组C57小鼠中,血浆AngⅡ浓度呈下降趋势(89.223±13.503,62.614±11.488,50.895±16.051,23.066±6.552pg/ml),肾组织内AngⅡ浓度呈上升趋势(255.883±85.432,368.303±13.370,468.346±58.214,611.880±19.831pg/mg),其中20月龄较其它叁组比较P均＜0.05。四组小鼠肾组织内AT1a、AT1b、AT2、ANGTmRNA/GAPDH值均呈上升趋势,AT1a/GAPDH分别为0.94±0.812,0.957±0.567,1.812±0.514,4.05±1.418,20月龄较其它叁组P＜0.05;AT1b/GAPDH分别为0.058±0.018,0.062±0.002,0.674±0.791,1.864±1.371,20月龄组较其它叁组P＜0.05;AT2/GAPDH分别为0.195±0.275,0.381±0.138,3.685±2.047,4.412±2.413,20月龄组较其它叁组P＜0.05;AGT/GAPDH为8.624±8.747,10.600±8.997,15.43±8.843,20.25±8.776,20月龄较其它叁组P＞0.05。Western-Blot结果显示四组小鼠肾组织内AT1、AT2蛋白表达水平呈上升趋势,MR蛋白水平呈下降趋势,11Beta-OHSD蛋白水平无明显变化,AT1/β-actin分别为0.623±0.361,0.834±0.987,0.863±0.875,0.965±0.874,20月龄较4月龄组P＜0.05;AT2/β-actin分别为0.785±0.675,0.809±0.757,0.905±0.784,0.988±0.957,4组间比较P＜0.05;MR/β-actin分别为0.757±0.121,0.62±0.345,0.495±0.387,0.374±0.231,20月龄组较其他叁组P＜0.01;11β-OHSD/β-actin分别为0.830±0.458,0.901±0.875,0.922±0.398,0.944±1.012,其中4组间P＞0.05。相关性分析显示24h尿微量白蛋白与肾脏局部AngⅡ呈正相关(r=0.921,P＜0.01),与血浆AngⅡ呈负相关(r=-0.878,P＜0.01)。结论:增龄小鼠肾脏局部RAAS激活,并且与肾功能改变呈正相关。而血浆中AngⅡ水平下降,与肾功能改变呈负相关。

黄东华^[8]2016年在《肾络通调控Smads信号通路抑制肾间质纤维化的机制研究》文中研究指明第一部分肾络通对肾间质纤维化大鼠肾脏组织形态学的影响目的:本次实验采用单侧输尿管结扎(UUO)的方法建立梗阻性肾病肾间质纤维化的大鼠实验动物模型,以化瘀涤痰通络中药——肾络通对实验大鼠进治疗,并以醛固酮受体阻断剂——依普利酮作为对照药物干预治疗实验大鼠,观察实验大鼠的一般情况和肾组织病理形态学的改变,以探讨化瘀涤痰通络中药肾络通抑制肾间质纤维化的作用机制。方法:1动物分组和模型制备:实验动物自由进食和饮水,温度条件控制在(22±2)℃。适应性饲养1WK后,48只Wistar大鼠随机分为假手术组(Sham group)、UUO组(UUO group)、依普利酮组(EPL group)、肾络通组(SLT group),每组各12只。大鼠单侧输尿管梗阻模型制备参照Iwai T的方法。各组大鼠用10%水合氯醛注射后,于左侧中腹部切开皮肤,游离左侧输尿管,分别在输尿管上1/3和中1/3处用丝线结扎,切断输尿管,后逐层缝合皮肤。假手术组仅将输尿管游离但不结扎切断,轻轻拨动肠管后缝合腹部皮肤。术后第3天肾组织病理显示炎细胞浸润,第5日后胶原间质成分增多,第10日梗阻侧肾脏明显大于对侧肾脏,肾间质大量胶原增生及炎细胞浸润,肾小管上皮细胞变性、浊肿、脱落、坏死,肾小管部分萎缩、管腔闭塞或扩张,与文献报道相一致,符合肾间质纤维化的病理改变,模型复制成功。UUO术后大鼠死亡5只,用备用大鼠补足。2给药:术后即开始给药,依普利酮组给予依普利酮混匀于饲料中按100mg/(kg·d)剂量食入;肾络通组以肾络通煎剂26g/(kg·d)入水瓶饮用,假手术组及UUO组给予等容量生理盐水饮用,均每天1次。连续干预10天。10天后,各组大鼠称重后断头处死,切取梗阻侧肾脏,去除被膜后称重,部分肾组织置于4%多聚甲醛中固定,以备肾脏病理学检测。3指标检测及方法:每日观察并记录各组大鼠的精神状态、活动状况、皮毛变化、饮水量及进食量,分别测量每只大鼠体重、24h尿量;称量大鼠体重并摘取左侧肾脏称重,计算大鼠肾重/体重比值;左侧肾组织,分别行HE、Masson、天狼星红染色,光学显微镜下观察病理改变。4统计学处理:数据资料以均数±标准差(x±s)表示,使用SPSS 16.0for windows统计软件进行统计学处理,数据均在比较前进行正态性及方差齐性检验,满足正太性及方差齐性者,采用单因素方差分析(one-way ANOVA),组间比较采用LSD检验。结果:1各组大鼠的一般情况及梗阻侧肾重/体重比值的测定结果:一般情况:Sham组大鼠一般情况良好,较手术前没有明显变化。UUO术后各模型组大鼠一般情况不佳:毛发光泽度较差,对外界刺激反应不佳,饮食量明显减少。梗阻侧肾重/体重比较:UUO术后各模型组梗阻侧肾脏重量均较Sham组明显增加(P<0.01),而体重却明显降低(P<0.01),故而梗阻侧肾重/体重比值较Sham组明显升高。与UUO组大鼠比较,EPL组及SLT组大鼠梗阻侧肾脏重量均明显降低(P<0.01,或P<0.05),而体重明显升高(P<0.01,或P<0.05),故而梗阻侧肾重/体重比值均较UUO组明显降低(P<0.01,或P<0.05)。2各组大鼠梗阻侧肾脏病理形态学改变:HE染色时显示,Sham组肾脏组织结构无明显异常改变,肾小管上皮细胞结构无改变,排列整齐,肾间质无增宽、水肿等改变,仅可见少量炎细胞浸润;UUO组肾组织结构发生明显改变,肾小管上皮细胞结构异常,多见变性、坏死的病理改变,甚至部分脱落,肾间质可见大量炎细胞浸润,肾小管扩张明显;EPL组及SLT组肾小管上皮细胞变性、坏死及肾小管扩张程度较UUO组稍有减轻,炎细胞浸润的数量明显减少。Masson染色时显示,Sham组仅见少量胶原分布于左侧肾组织中的肾小管基底膜、小血管周围及肾间质部分;UUO组梗阻侧肾脏组织结构排列紊乱,肾间质明显增宽,部分肾小管萎缩,管腔扩张,肾间质中有大量胶原沉积,尤以髓质明显;EPL组及SLT组梗阻侧肾脏组织中胶原含量较Sham组明显增多,但较UUO组却明显减少。天狼猩红染色时显示,Sham组左侧肾脏的组织结构无明显变化,仅有少量胶原分布于肾间质部分;UUO组梗阻侧肾脏肾小管扩张明显,并有大量胶原成分在肾间质沉积;EPL组及SLT组肾间质胶原沉积增多,但较UUO组显着减少。第二部分肾络通对肾间质纤维化大鼠肾脏TGF-β1、CTGF的表达的影响目的:本次实验采用单侧输尿管结扎(UUO)的方法建立梗阻性肾病肾间质纤维化的大鼠实验动物模型,以化瘀涤痰通络中药——肾络通对实验大鼠进治疗,并以醛固酮受体阻断剂——依普利酮作为对照药物干预治疗实验大鼠,采用免疫组化、Western Blot、RT-PCR检测大鼠肾组织TGF-β1、CTGF表达,观察并分析依普利酮及肾络通对TGF-β1、CTGF的调控作用,以探讨化瘀通络中药肾络通抑制肾间质纤维化的作用机制。方法:动物分组、模型制备、给药方法同第一部分,共10天。实验结束时,留取肾脏标本,Real time-PCR、免疫组化、Western blot检测TGF-β1、CTGF及蛋白的表达。统计学方法同第一部分。结果:1 Real-time PCR检测TGF-β1、CTGF的表达:与Sham组比较,UUO组中TGF-β1m RNA、CTGFm RNA表达明显增强(P<0.01,P<0.05)。与UUO组比较,EPL组及SLT组TGF-β1m RNA、CTGFm RNA表达均明显下降,并且EPL组二者下降更为显着(P<0.05)。2免疫组化检测α-SMA、PCNA、TGF-β1、CTGF表达:假手术组α-SMA主要见于血管,呈强阳性,其他部位表达不明显;PCNA阳性细胞有少量表达,TGF-β1、CTGF主要表达于肾小管上皮细胞及肾小球,呈弱表达;UUO组中PCNA阳性细胞显着增多,主要以扩张的远端小管上皮细胞为主,α-SMA表达亦明显增强,主要见于肾小管间质及上皮细胞。TGF-β1、CTGF主要表达于肾小管上皮细胞及肾小球。与UUO组比较,依普利酮及肾络通组PCNA阳性细胞显着减少,α-SMA、TGF-β1、CTGF表达范围及强度均显着减弱。3 Western Blot检测TGF-β1、CTGF蛋白表达:UUO组TGF-β1、CTGF蛋白表达较Sham组明显上调。EPL组及SLT组TGF-β1、CTGF蛋白表达均较UUO组明显下降,并且EPL组下调更为显着,差异有统计学意义(P<0.01)。第叁部分肾络通对肾间质纤维化大鼠肾脏Smads信号通路的影响目的:本次实验采用单侧输尿管结扎(UUO)的方法建立梗阻性肾病肾间质纤维化的大鼠实验动物模型,以化瘀涤痰通络中药——肾络通对实验大鼠进治疗,并以醛固酮受体阻断剂——依普利酮作为对照药物干预治疗实验大鼠,采用免疫组化、Western Blot、RT-PCR检测大鼠肾组织Smad3、Smad4、Smad7表达,观察并分析依普利酮及肾络通对Smad3、Smad4、Smad7的调控作用,以探讨化瘀通络中药肾络通抑制肾间质纤维化的作用机制。方法:动物分组、模型制备、给药方法同第一部分,共10天。实验结束时留取肾脏标本,Real-time PCR检测Smad4m RNA、Smad7m RNA的表达,免疫组化、Western blot检测Smad3、Smad4、Smad7表达。统计学方法同第一部分。结果:1 Real-time PCR检测Smad4m RNA、Smad7m RNA的表达:UUO组大鼠梗阻侧肾组织中Smad4m RNA的表达较Sham组明显增高(P<0.01);而Smad7m RNA的表达则显着下降(P<0.01)。EPL组及SLT组大鼠梗阻侧肾组织中Smad4m RNA的表达均较UUO组明显下降,尤以EPL组下降更为明显(P<0.05);EPL组及SLT组大鼠梗阻侧肾组织中Smad7m RNA的表达均较UUO组显着增高,尤以EPL组升高显着(P<0.05)2免疫组化检测Smad3、Smad4、Smad7表达:Sham组大鼠梗阻侧肾组织中Smad3、Smad4呈弱表达,Smad7表达增强,UUO组大鼠梗阻侧肾组织中Smad3、Smad4表达较Sham组显着上调,而Smad7表达则显着下降,主要表达于肾小管上皮细胞的胞浆中。与UUO组比较,EPL组及SLT组大鼠梗阻侧肾组织中Smad3、Smad4表达范围及强度均显着减弱;Smad7表达范围及强度均显着增强。3 Western Blot检测Smad3、Smad4、Smad7蛋白表达:UUO组大鼠梗阻侧肾组织中Smad3、Smad4蛋白表达较Sham组明显增多(P<0.01);而Smad7蛋白表达则较Sham组明显减少(P<0.01)。EPL组及SLT组大鼠梗阻侧肾组织中Smad3、Smad4蛋白的表达均较UUO组明显下降,尤以EPL组下降更为明显(P<0.01)。EPL组及SLT组大鼠梗阻侧肾组织中Smad7蛋白的表达均较UUO组明显升高,尤以EPL组升高更为显着(P<0.01)。结论:1采用单侧输尿管结扎的方法可成功复制梗阻性肾病肾间质纤维化大鼠动物模型,UUO大鼠肾脏病理显示大量炎细胞浸润及胶原成分大量沉积,符合肾间质纤维化的病理改变。化瘀涤痰通络中药肾络通可减少UUO大鼠肾组织中炎细胞的数量和胶原的沉积,减轻肾间质纤维化的损伤程度,从而延缓了肾间质纤维化的进程。2肾络通和依普利酮均可以通过抑制TGF-β1信号通路,下调CTGF表达,而抑制肾小管上皮细胞的表型转化并减少成纤维细胞的增殖,减少ECM的合成并增加其降解,从而减少ECM的积聚,减轻肾间质纤维化的程度而减缓其发展。3 TGF-β1/Smads信号通路是引起肾间质纤维化的共同作用途径,在UUO肾脏模型中,TGF-β1/Smads信号通路明显被激活,进而引起肾间质纤维化的形成。祛瘀化痰通络中药肾络通可通过抑制Smad3的表达水平,并阻碍其与Smad4的结合,同时上调Smad7的表达,而阻断了TGF-β1信号的传导,进而阻止了UUO大鼠肾间质纤维化的发生发展过程。

刘娜^[9]2008年在《肾衰泻浊丸对慢性肾衰竭大鼠BMP-7/Smads/TGF-β1信号转导通路影响的实验研究》文中认为目的:通过实验研究观察肾衰泻浊丸对腺嘌呤致慢性肾衰竭大鼠的肾脏功能、肾脏组织形态及BMP-7/Smads/TGF-β1信号转导通路的影响,探讨肾衰泻浊丸延缓慢性肾衰竭进展及抗肾间质纤维化的机理。方法:采用腺嘌呤致慢性肾衰竭大鼠模型,观察实验大鼠治疗前后的一般状态、体重,血清BUN,Scr和Hb的变化;将肾脏病理切片进行HE,Masson染色,观察动物模型治疗后肾组织的病理改变及肾间质纤维化情况;采用免疫组织化学法分别检测肾组织中的TGF-β1,Smad2/3,Smad6,BMP-7,BMP-7RⅡ蛋白表达情况;采用Western Blot法检测肾组织内的Smad2/3,Smad6,BMP-7,BMP-7RⅡ蛋白的表达水平;采用半定量RT-PCR检测肾组织内的TGF-β1mRNA,BMP-7mRNA,BMP-7RⅡmRNA的表达水平。结果:肾衰泻浊丸能够改善CRF大鼠的一般状态和体重;能够明显降低血清BUN,Scr水平,与对照组比较有显着性差异;能够升高Hb水平,与对照组比较无显着性差异;能够降低CRF大鼠肾组织中的TGF-β1,Smad2/3蛋白的表达,升高Smad6、BMP-7、BMP-7RⅡ蛋白的表达,与对照组比较有显着性差异;能够下调肾组织中TGF-β1mRNA的表达,上调BMP-7mRNA,BMP-7RⅡmRNA的表达,与对照组比较有显着性差异。结论:肾衰泻浊丸可能是通过增高慢性肾衰竭大鼠肾组织中Smad6、BMP-7、BMP-7RⅡ的蛋白表达,降低Smad2/3、TGF-β1的蛋白表达,从而抑制了TGF-β1信号向细胞核内转导的通路。肾衰泻浊丸通过影响BMP-7/Smads/TGF-β1信号通路的转导而减轻肾间质纤维化可能是其延缓慢性肾衰竭进展的机制之一。

赵贤俊^[10]2003年在《解毒通络保肾胶囊对糖尿病大鼠肾脏保护作用机制的研究》文中研究说明糖尿病肾病（DN）是糖尿病（DM）主要的慢性并发症之一，是导致慢性肾功能不全的常见原因，在终末期肾病病人中约叁分之一是由DN引起的。本论文从文献综述、实验研究两方面对解毒通络保肾胶囊防治DN的机理进行了较系统的研究。1 文献综述1.1 糖尿病肾病的中医药研究概况从DN的中医溯源、中医病名的探讨、病因病机、辨证论治、分期辨证论治、专法专方治疗和单味中药及提取物的治疗等方面的研究进展情况进行了综述，并对当前在诊断及疗效评定标准、辨证分型和科研等方面存在的问题进行了述评和展望。1.2 糖尿病肾病的中医药实验研究近况依据DN的发病机理，即肾组织糖代谢紊乱、脂代谢紊乱、血管活性物质、生长因子与化学趋化因子、反应氧中间产物及实验动物模型等几方面，对近年来中医中药防治DN机理的实验研究成果、研究动态进行了综述，并进行了评述和展望。1.3 肾素-血管紧张素系统、转化生长因子-β及结缔组织生长因子与糖尿病肾病的发病机制就近年来国内外在DN发病机制中，肾素-血管紧张素系统（RAS）、转化生长因子-β1（TGF-β1）和结缔组织生长因子（CTGF）作用机制的最新研究成果及研究动态进行了综述。2 实验研究2.1 解毒通络保肾胶囊对实验性糖尿病大鼠肾脏功能的影响采用链脲佐菌素（STZ）诱导大鼠实验性DM模型，设正常对照组、DM对照组、阳性对照组（DM＋苯那普利）和实验组（DM＋解毒通络保肾胶囊），实验第12周末，观察各项指标。结果表明，解毒通络保肾胶囊明显改善DM大鼠的一般状态，具有一定的降低血糖和血清胆固醇作用，与DM对照组比较具有显着的统计学意义（P<0.01，P<0.05）；能够抑制DM大鼠早期肾脏肥大及肾小球高滤过；降低DM大鼠升高的血清尿素氮、肌酐和内生肌酐清除率，与DM对照组比较具有显着性差异（P<0.01，P<0.05）；显着降低实验大鼠尿白蛋白排泄率（UAER）和24h尿蛋白排泄量，与DM对照组比较差异显着（P<0.05，P<0.01）。提示解毒通络保肾胶囊对实验性DM大鼠具有良好的调节糖脂代谢、抑制肾小球高滤过和肾脏肥大、减少尿蛋白排出、保护肾功能的作用。2.2 解毒通络保肾胶囊对实验性糖尿病大鼠肾脏组织形态学变化的影响本实验通过光镜、电镜观察各组实验性DM大鼠12周末肾组织形态学变化，并利用免疫组化方法观察解毒通络保肾胶囊对DM大鼠肾小球细胞外基质（ECM）的主要成分Ⅳ型胶原（Col Ⅳ）和纤维连接蛋白（FN）沉积的影响。结果表明：DM对照组光镜下可见肾小球系膜区弥漫性增宽，PAS阳性的均质蛋白性物质明显增多，肾小球ECM增多，系膜细胞轻度增生，肾小球基底膜（GBM）增厚等表现，透射电镜观<WP=8>察结果为肾小球基底膜呈阶段性增厚，有的模糊不清，上皮足突广泛融合或部分融合，滤过膜间隙增大，系膜区扩大，系膜细胞增多。经解毒通络保肾胶囊治疗12周后的实验组上述病理改变比DM对照组比较显着减轻；免疫组化结果表明，DM对照组Col Ⅳ与FN免疫染色从强度到面积都明显增加，可达正常对照组的5倍以上，且其染色浓重的区域通常与细胞增生区域有关。解毒通络保肾胶囊治疗12周后的实验组Col Ⅳ及FN在肾小球内表达从染色到面积均明显减轻。提示解毒通络保肾胶囊能够明显改善实验性DM大鼠肾组织的病理变化，对DM肾脏具有保护作用，并能抑制DM大鼠肾小球系膜细胞ECM的合成，减轻其积聚，从而改善DM肾小球硬化。2.3 解毒通络保肾胶囊对实验性糖尿病大鼠肾脏肾素-血管紧张素系统的影响的研究用放射免疫法和生物化学法检测各组实验动物肾脏标本中的肾组织肾素活性（TRA）、血管紧张素转换酶（ACE）活性和血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）含量。结果表明：DM对照组肾组织AngⅡ含量明显增加，肾组织ACE活性明显增强，与正常对照组比较有显着的差异（P<0.01），但TRA增强不明显，与正常对照组比较无统计学意义（P>0.05）；血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）苯那普利治疗12周后的阳性对照组肾组织AngⅡ含量显着下降，ACE活性明显减弱，与DM对照组比较差异显着（P<0.01），同时TRA显着增强，与正常对照组和DM对照组比较均有统计学意义（P<0.01）；实验组DM大鼠肾组织中AngⅡ含量、ACE活性较DM对照组明显下降（P<0.01），但TRA升高不显着，与阳性对照组比较差异显着（P<0.01），与正常对照组和DM对照组比较均无统计学意义（P>0.05）。提示解毒通络保肾胶囊具有一定的抑制DM大鼠TRA和肾组织中ACE活性，从而减少肾组织中AngⅡ含量的作用。2.4 解毒通络保肾胶囊对糖尿病大鼠肾脏转化生长因子-β1表达的影响采用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）方法，检测各组实验大鼠肾脏皮质中TGF-β1基因的表达含量，观察解毒通络保肾胶囊对实验性DM大鼠肾脏TGF-β1 mRNA表达的影响，目的是探讨该中药复方制剂防治DN的分子机制。结果表明：DM对照组12周末大鼠肾皮质TGF-β1 mRNA水平明显高于正常对照组（P<0.01），达2.5倍；阳性对照组和实验组TGF-β1 mRNA水平较DM对照组均明显下降（P<0.05），两组之间比较差异不显着（P>0.05）。提示解毒通络保肾胶囊具有较强的抑制DM大鼠肾脏皮质TGF-β1 mRNA过度表达，其防治DN的作用可能部分通过抑制TGF-β1 mRNA过

参考文献：

[1]. 转化生长因子β_1及其Ⅰ和Ⅱ型受体与肾脏疾病关系的研究[D]. 张玉侠. 中国医科大学. 2000

[2]. 转化生长因子β_1及其Ⅰ、Ⅱ型受体在人类肾小球疾病中的表达及促使肾组织硬化的机理[J]. 戚其学, 张玉侠, 王力芬, 赵霞, 冯婕. 中国血液流变学杂志. 2007

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[4]. 肾络通对梗阻性肾病大鼠炎性介质表达的影响[D]. 王筝. 河北医科大学. 2014

[5]. 肾上腺髓质素抑制细胞增殖的作用及鳖甲煎丸对其表达的影响[D]. 韩琳. 河北医科大学. 2007

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[8]. 肾络通调控Smads信号通路抑制肾间质纤维化的机制研究[D]. 黄东华. 河北医科大学. 2016

[9]. 肾衰泻浊丸对慢性肾衰竭大鼠BMP-7/Smads/TGF-β1信号转导通路影响的实验研究[D]. 刘娜. 黑龙江中医药大学. 2008

[10]. 解毒通络保肾胶囊对糖尿病大鼠肾脏保护作用机制的研究[D]. 赵贤俊. 北京中医药大学. 2003

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