韩英[1]2001年在《胃癌细胞耐药相关分子的表达、信号转导途径和离子通道特性的研究》文中研究表明肿瘤的多药耐药已成为肿瘤治疗的一大难关。目前已发现多种多药耐药相关分子，如Pgp、MRP、LRP、BCRP、GSH/GSH、TopoⅡ以及凋亡相关蛋白或抗凋亡蛋白等，但这些还远不能圆满解释肿瘤多药耐药的发生机理。因此，寻找新的耐药相关分子和逆转耐药的新途径已成为肿瘤研究的热点。1994年，我所采用体外阶梯诱导的方法，将人胃癌细胞系SGC7901暴露于含长春新碱的培养液中，经逐步诱导得到一株耐药细胞系SGC7901/VCR，其耐药浓度为0.2ug/ml。研究表明，SGC7901/VCR稳定高表达Pgp、MGrlAg等耐药相关分子，同时对多种化疗药物交叉耐药。提示SGC7901/VCR是一个在体外研究胃癌多药耐药的较好模型。本研究拟以该细胞模型为基础，借助全细胞膜片钳、激光共聚焦显微镜、流式细胞仪等技术，对胃癌耐药细胞的离子通道和信号转导途径进行研究，以期揭示新的耐药机制，并为寻找新的耐药逆转措施奠定良好的理论基础。 目的：首先采用阶梯诱导法对已有的SGC7901/VCR细胞继续进行诱导，建立不同耐药指数的耐药细胞亚系，并在此基础上：（1）观察PKC、PKA与胃癌细胞耐药的相关性；（2）观察细胞耐药后离子通道的变化，以及信号转导途径的调节；（3）观察本所研制的与耐药相关的单克隆抗体MGr1对胃癌耐药细胞PKC活性的影响；（4）观察本所发现的胃癌相关抗原MG7Ag在耐药细胞亚系与亲本细胞的表达差异，以及对细胞内药物浓度的影响。 方法：（1）用体外阶梯诱导的方法建立不同耐药指数的胃癌耐药细胞亚 第四军医大学博士学位论文 一 系，并利用免疫细胞化学及流式细胞仪方法进行兔疫学鉴定；门）用兔疫细 胞化学及免疫蛋白印迹方法检测PKC的表达，用竟争蛋白结合法检测PKC、 PKA活性的变化；O）采用 Mh’实验观察 PKC的激活剂和抑制剂对胃癌耐 药细胞药物敏感性的影响，采用流式细胞仪检测PKC的激活剂和抑制剂对胃 癌耐药细胞胞内药物蓄积的影响：N）用免疫荧光双标记及共聚焦显微镜技－术观察PKC与MGrlAg在耐药及药敏细胞的相关表达；u）用穿孔膜片钳方 法观察细胞耐药后离子通道的变化及信号转导途径的调节；（6）采用免疫荧 光化学方法观察肿胀激活状态下P＊C同工酶亚型的亚细胞分布变化：（）采 用钾通道KVI．5及KvZ＊的多克隆抗体，用免疫细胞化学方法检测KVI．5及 KVZ．1 的表达；（8）用流式细胞仪观测钾通道阻断剂对细胞内药物浓度的影 响；①）采用免疫组化和流式细胞仪检测MG7Ag在胃癌耐药细胞及其亲本 细胞的表达差异；（ 0）采用 MM实验观察单克隆抗体 MG7对胃癌耐药细 胞药物敏感性的影响，采用流式细胞仪检测MG7对胃癌耐药细胞胞内药物蓄 积的影响。 结果： 门）建立了不同耐药指数的耐药细胞亚系 SGC7901／VCR（0．3Ug／ttilL SGC7901／VCR（口．7ug／inl）、SGC7901／VCR（＊＂g／ml），耐药相关分子 Pgp、 MGrlAg等在耐药细胞亚系中的表达随耐药指数的增加而升高。细胞耐药后 形态也发生了明显的变化，细胞体积变大，呈多角状，绒毛变多变长，细胞 与细胞之间类似于神经细胞突触样的联系增多：细胞内线粒体丰富，细胞与 细胞之间有部分融合现象。 （二）普通型 PKC的四种亚型在胃癌耐药细胞亚系及其亲本细胞均有表 达：随耐药浓度的增加，P＊C。的表达呈逐渐升高的趋势，而＊＊Cp、p 11及 Y的表达无明显变化；给予抗 PKC Q的抗体与耐药细胞共同孵育后，耐 药细胞内药物浓度增加，且有浓度依赖性：而抗叫Ce、p 11或Y的抗体对 细胞内药物浓度无明显影响。 臼）随耐药指数的增加，PKC的活性也呈逐渐增加的趋势，以细胞质的 PKC活性增高为主。给予 PKC的激活剂 PMA omin，细胞膜 PKC活性明显 增高，细胞质PKC活性降低，30ITiln后随时间的延长全细胞的PKC活性均 减低：给予P＊C的抑制剂＊7不同时间后均出现P＊C活性降低。单克隆抗体 ．4． 第四军医大学博士学位论文 一 MGr－l与耐药细胞共同孵育后，耐药细胞PKC的活性减低，以细胞质的PKC 降低比较明显。 （4）与其亲本细胞比，耐药细胞活性PKA百分比明显减低。 6）胃癌耐药细胞 SS790lNCR门．0 Ug／l）与其亲本细
佚名[2]2003年在《国家自然科学基金委员会生命科学部2003年度资助自由申请科学基金项目一览表》文中研究表明项目 名称l 微生物学学科(72项)甲烷古菌资源和分子系统学研究通过分子分类修正和澄清链霉菌属分类系统中国西南地区粘菌的分类和区系研究中国乳菇属的分类研究中国毛霉科犁头霉属等七属的系统分类研究北京东灵山主要阔叶树内生真菌研究中国梅衣类地衣分类研究中国蜜环
瓮占平[3]2007年在《电压门控式钾离子通道改变对卵巢癌细胞系增殖活性的影响》文中进行了进一步梳理目的：探讨电压门控式钾离子通道在卵巢上皮性癌细胞株SKOV3、3AO及A2780中的表达状态。方法：采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测电压门控式钾离子通道Kv1.1及Kv1.3基因的表达；应用免疫细胞化学方法检测电压门控式钾离子通道Kv1.1及Kv1.3通道蛋白在SKOV3、3AO及A2780细胞上的表达。结果：卵巢上皮性癌细胞株SKOV3、3AO及A2780叁种细胞均表达Kv1.1及Kv1.3钾离子通道基因。Kv1.1扩增片断长度为380bp，Kv1.3扩增片断长度为382bp。且发现SKOV3细胞Kv1.1mRNA与GAPDHmRNA光密度比值为0.90±0.06；3AO细胞Kv1.1mRNA与GAPDHmRNA光密度比值为0.92±0.04；A2780细胞Kv1.1mRNA与GAPDHmRNA光密度比值为0.93±0.02；比较叁种细胞Kv1.1mRNA的表达量差异无显着性(P＞0.05)。SKOV3、3AO及A2780细胞Kv1.3mRNA与GAPDHmRNA的光密度比值分别为1.23±0.04、1.22±0.06及1.20±0.03，叁种细胞株Kv1.3mRNA的表达量比较也无明显差异(P＞0.05)。免疫细胞化学染色发现，SKOV3、3AO及A2780细胞Kv1.1及Kv1.3抗原染色均为阳性，叁种细胞质膜呈现棕黄色，提示电压门控式钾离子通道Kv1.1及Kv1.3蛋白表达在SKOV3、3AO及A2780细胞膜上。结论：卵巢上皮性癌细胞株表达电压门控式钾离子通道，且其表达量在不同的卵巢上皮性癌细胞株中无明显差异。目的：探讨电压门控式钾离子通道改变对卵巢上皮性癌细胞株SKOV3、3AO及A2780细胞增殖及细胞周期的影响。方法：采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法，检测不同浓度及类型钾离子通道阻滞剂阻断卵巢上皮性癌细胞上钾离子通道后，卵巢上皮性癌细胞增殖活性的改变；应用流式细胞仪技术检测不同浓度及类型钾离子通道阻滞剂对卵巢上皮性癌细胞周期转换的影响。结果：一、不同类型钾离子通道阻滞剂对卵巢上皮性癌细胞株增殖活性的影响1．4-氨基吡啶为电压门控式钾离子通道特异性阻滞剂。MTT检测发现不同浓度的4-氨基吡啶作用SKOV3、3AO及A2780细胞48小时后，可以明显抑制叁种细胞的增殖活性。1、5、10mmol／L的4-氨基吡啶对SKOV3细胞的抑制率分别为35.09％、54.65％及69.13％，与对照组相比差异有显着性(P＜0.01)；1、5、10mmol／L的4-氨基吡啶对3AO细胞的抑制率分别为41.43％、61.94％及70.93％，与对照组相比差异有显着性(P＜0.01)；1、5、10mmol／L的4-氨基吡啶对A2780细胞的抑制率分别为72.41％、94.60％及95.34％，与对照组相比差异有显着性(P＜0.01)；4-氨基吡啶对A2780细胞增殖的抑制作用较SKOV3、3AO细胞明显(P＜0.05)。2．北非蝎毒素为钙离子敏感性钾离子通道特异性阻滞剂。MTT检测发现不同浓度的北非蝎毒素作用SKOV3、3AO及A2780细胞48小时后，对叁种细胞的增殖活性无明显影响。5、10、15nmol／L北非蝎毒素对SKOV3细胞的抑制率分别为2.64％、2.95％及4.01％，与对照组相比差异无显着性(P＞0.05)；5、10、15nmol／L北非蝎毒素对3AO细胞的抑制率分别为2.11％、2.64％及3.48％，与对照组相比差异无显着性(P＞0.05)；5、10、15nmol／L北非蝎毒素对A2780细胞的抑制率分别为2.85％、3.17％及3.91％，与对照组相比差异无显着性(P＞0.05)。3．格列本脲为ATP敏感性钾离子通道特异性阻滞剂。MTT检测发现不同浓度的格列本脲作用SKOV3、3AO及A2780细胞48小时后，对叁种细胞的增殖活性无明显影响。50、100、1501xmol／L的格列本脲对SKOV3细胞的抑制率分别为3.06％、3.91％及5.49％，与对照组相比差异无显着性(P＞0.05)；50、100、150μmol／L格列本脲对3AO细胞的抑制率分别为3.27％、3.38％及4.01％，与对照组相比差异无显着性(P＞0.05)；50、100、150μmol／L格列本脲对A2780细胞的抑制率分别为3.32％、3.40％及3.13％，与对照组相比差异无显着性(P＞0.05)。4．将4-氨基吡啶、北非蝎毒素、格列本脲叁种不同类型的钾离子通道阻滞剂对SKOV3、3AO及A2780叁种细胞增殖的抑制率相比较，4-氨基吡啶对叁种细胞增殖的抑制与北非蝎毒素及格列本脲比较差异有显着性(P＜0.05)；北非蝎毒素及格列本脲比较差异无显着性(P＜0.05)。二、不同类型钾离子通道阻滞剂对卵巢上皮性癌细胞株周期的影响1．流式细胞仪检测发现不同浓度的4-氨基吡啶作用SKOV3、3AO及A2780细胞72小时后，细胞周期的G_0／G_1、S、G_2／M期细胞分布均发生变化，细胞周期停滞在G_0／G_1期。1、5、10mmol／L的4-氨基吡啶作用于SKOV3细胞后，细胞周期的G_0／G_1期细胞数由39.68％分别增加到53.28％、62.31％及78.08％，S期细胞数由57.29％分别减少到45.37％、36.25％及20.19％，G_2／M期细胞数由3.02％分别减少到1.34％、1.43％及1.72％各浓度组与对照组相比差异有显着性(P＜0.05)；1、5、10mmol／L的4-氨基吡啶作用于3AO细胞后，G_0／G_1期细胞数由39.68％分别增加到58.24％、66.35％及78.13％，S期细胞数由57.29％分别减少到39.45％、32.44％及20.68％，G_2／M期细胞数由3.02％分别减少到2.31％、1.21％及1.19％，各浓度组与对照组相比差异有显着性(P＜0.05)；1、5、10mmol／L的4-氨基吡啶作用于A2780细胞后，G_0／G_1期细胞数由39.68％分别增加到61.27％、78.08％及81.21％，S期细胞数由57.29％分别减少到37.17％、20.19％及17.26％，G_2／M期细胞数由3.02％分别减少到1.56％、1.72％及1.53％，各浓度组与对照组相比差异有显着性(P＜0.05)；4-氨基吡啶对叁种细胞的周期转换影响比较无明显差异(P＞0.05)。2．应用不同浓度的北非蝎毒素作用SKOV3、3AO及A2780细胞72小时后，细胞周期的G_0／G_1、S、G_2／M期细胞分布无明显变化。5、10、15 nmol／L的北非蝎毒素作用SKOV3细胞后，G_0／G_1期细胞数由39.68％分别改变为39.23％、38.98％及39.36％，S期细胞数由57.29％分别改变为58.22％、59.59％及58.27％，G_2／M期细胞数由3.02％分别改变为2.54％、1.42％及2.36％，各浓度组与对照组相比差异无显着性(P＞0.05)；5、10、15nmol／L的北非蝎毒素作用3AO细胞后，G_0／G_1期细胞数由39.68％分别改变为40.12％、41.23％及42.24％，S期细胞数由57.29％分别改变为56.85％、55.80％及54.89％，G_2／M期细胞数由3.02％分别改变为3.03％、2.97％及2.86％，各浓度组与对照组相比差异无显着性(P＞0.05)；5、1 0、15nmol／L的北非蝎毒素作用A2780细胞后，G_0／G_1期细胞数由39.68％分别改变为38.35％、38.04％及39.21％，S期细胞数由57.29％分别改变为57.96％、58.23％及58.10％，G_2／M期细胞数由3.02％分别改变为3.68％，3.73％及2.68％，各浓度组与对照组相比差异无显着性(P＞0.05)。3．应用不同浓度的格列本脲作用SKOV3、3AO及A2780细胞72小时后，细胞周期的G_0／G_1、S、G_2／M期细胞分布也无明显变化。50、100、150μmol／L的格列本脲作用SKOV3细胞后，G_0／G_1期细胞数由39.68％分别改变为38.87％、39.12％及39.36％，S期细胞数由57.29％分别改变为57.65％、58.25％及58.45％，G_2／M期细胞数由3.02％分别改变为3.47％、2.62％及2.18％，各浓度组与对照组相比差异无显着性(P＞0.05)；50、100、150μmol／L的格列本脲作用3AO细胞后，G_0／G_1期细胞数由39.68％分别改变为39.58％、39.69％及41.25％，S期细胞数由57.29％分别改变为57.37％、57.38％及56.77％，G_2／M期细胞数由3.02％分别改变为3.05％、2.93％及1.98％，各浓度组与对照组相比差异无显着性(P＞0.05)；50、100、150μmol／L的格列本脲作用A2780细胞后，G_0／G_1期细胞数由39.68％分别改变为39.92％、40.02％及40.63％，S期细胞数由57.29％分别改变为56.81％、56.33％及57.12％，G_2／M期细胞数由3.02％分别改变为3.26％、3.65％及2.24％，各浓度组与对照组相比差异无显着性(P＞0.05)。4．将4-氨基吡啶、北非蝎毒素、格列本脲叁种不同类型的钾离子通道阻滞剂对SKOV3、3AO及A2780细胞周期转换的影响相比较，4-氨基吡啶与北非蝎毒素及格列本脲相比较，差异有显着性(P＜0.05)，北非蝎毒素及格列本脲比较差异无显着性(P＞0.05)。结论：电压门控式钾离子通道阻滞剂对卵巢上皮性癌细胞系的增殖活性有抑制作用。电压门控式钾离子通道在卵巢上皮性癌细胞增殖及细胞周期转换起着重要作用；而钙离子敏感性钾离子通道及ATP敏感性钾离子通道对卵巢上皮性癌细胞株增殖、细胞周期转换无明显影响。
王琳[4]2008年在《热疗对紫杉醇抑制肺肿瘤细胞的促进作用及其机制》文中研究指明肺癌的发病率和死亡率正在迅速上升,在很多发达国家,肺癌的发病率占男性常见恶性肿瘤的第一位,女性常见恶性肿瘤的第二、叁位;肺癌的组织学类型也在发生显着变化,腺癌的发病率不断上升。虽然手术治疗、化学治疗、放射治疗、免疫治疗及综合治疗等都取得了长足发展,但在美国肺癌患者5年的生存率仅为15%,欧洲不过是10%,发展中国家则不到8.9%。化疗药物紫杉醇(TAX)抗肿瘤效果显着,取得了较好的临床疗效。肿瘤热疗在肿瘤综合治疗中显示了良好的效果,加热不会增加药物的细胞毒性效应,所以,热疗增加肿瘤细胞对化疗的敏感性受到越来越多的重视,因此,本研究旨在验证热疗促进TAX对肺肿瘤细胞抑制作用的发生及其机制。研究方法1.热疗与TAX联合应用对肺部细胞生物学特性的影响采用人肺腺癌A549细胞、人小细胞肺癌NCI-H446细胞和人呼吸道上皮BEAS-2B细胞,每种细胞分别采用3种方式处理,即对照组、TAX组和43℃+TAX组(见表1);倒置显微镜观察细胞形态,照相记录,噻唑蓝比色法检测细胞增殖率;提取细胞总蛋白,按LDH Kit要求检测LDH活力,划痕实验检测细胞损伤修复能力,荧光Hoechst33342/PI双染法以及提取细胞DNA Ladder检测细胞凋亡。2.细胞内重要信号传导通路在热疗与TAX诱导肺肿瘤细胞增殖过程中的作用及其相互关系采用人肺腺癌A549细胞和人小细胞肺癌NCI-H446细胞,每种细胞分别采用6种方式处理,即对照组、TAX组、43℃+TAX组(见表1)和SP600125组(43℃+TAX组加入JNK信号转导通路抑制剂SP600125)、wortmannin组(43℃+TAX组加入Akt通路抑制剂wortmannin)、NAC组(43℃+TAX组加入ROS抑制剂NAC);分别检测各组ROS、p-JNK、p-Akt以及Caspase-3等的表达变化,并用流式细胞术检测细胞凋亡率和细胞周期的变化,同时做体内实验的验证。3.HSP70在热疗与TAX抑制肺肿瘤细胞作用中的地位采用人肺腺癌A549细胞、人小细胞肺癌NCI-H446细胞和人呼吸道上皮BEAS-2B细胞。每种细胞分别采用4种方式处理,即对照组、TAX组、43℃+TAX组和43℃组(见表1);检测各组HSP70的表达变化,同时做体内实验的验证。4.GTSP1在热疗与TAX抑制肺肿瘤细胞过程中的作用构建重组质粒pcDNA3.0-GSTP1,转染A549细胞,热疗联合TAX处理转染和未转染细胞,倒置显微镜观察细胞形态,照相记录,噻唑蓝比色法检测细胞增殖率,流式细胞术检测各组细胞周期的变化。5.统计学分析采用SPSS 12.0进行统计分析,统计学处理采用t检验、单因素方差分析,多重比较采用LSD法,构成比的比较采用卡方检验,以α=0.05为检验水准。结果1.热疗与TAX联合应用对肺部细胞生物学特性的影响1.1热疗可以减少TAX对正常细胞的损伤作用(P＜0.05),明显增强TAX对肺肿瘤细胞的抑制作用(P＜0.05);1.2热疗造成肺肿瘤细胞膜损伤,使得大量LDH外漏,所以检测细胞内LDH发现,43℃+TAX组的LDH较对照组和TAX组明显减少(P＜0.05);1.3划痕后24h,对照组细胞开始向划痕区生长,其余各组划痕区中央均未见细胞生长,且有部分细胞死亡,TAX组细胞存活数目多于43℃+TAX组;划痕后48h,对照组细胞填满划痕区,TAX组细胞部分存活,存在较宽的划痕区,43℃+TAX组细胞大多死亡;1.4用Hoechst 33342结合PI染料对细胞进行双染色,在荧光显微镜下观察,呈现低绿色/低红色的是正常细胞,高绿色/低红色的是凋亡细胞,坏死细胞则为低绿色/高红色,对照组细胞呈低绿色和低红色,证明细胞并未发生坏死和凋亡,TAX组细胞则绿色数量增加,红色没有变化,证明已有凋亡发生,43℃+TAX组细胞呈现明显的亮绿色,证明细胞发生了明显的凋亡,而并没有发生坏死;1.5 43℃+TAX组细胞其DNA条带出现典型的DNA片段梯带现象(DNA ladder),而对照组细胞未出现DNA梯状条带,TAX组细胞的DNA梯状条带不明显,说明热疗可以诱导肺肿瘤细胞发生凋亡。2.细胞内重要信号传导通路在热疗与TAX抑制肺肿瘤细胞过程中的作用及其相互关系2.1 ROS产生水平的变化荧光法检测各组细胞内ROS,证明热疗可以明显提高细胞内ROS的表达(P＜0.05),ROS的增多可以改变细胞内氧化还原水平,损伤细胞膜,作为信号在细胞内传递,引起细胞内信号转导通路的一系列变化。2.2 MKK4表达和p-JNK水平的变化43℃+TAX组的JNK信号转导通路被激活,产生的MKK4和p-JNK高于对照组和TAX组(P＜0.05),SP600125组的p-JNK水平被抑制(P＜0.05),wortmannin组二者表达均未见明显变化(P＞0.05),NAC组二者的水平均低于43℃+TAX组(P＜0.05),说明热疗过程中产生的ROS可以激活JNK信号转导通路。2.3 p-Akt水平的变化43℃+TAX组的Akt信号转导通路被抑制,p-Akt的水平低于对照组和TAX组(P＜0.05),wortmannin组的p-Akt水平完全被抑制(P＜0.05),SP600125组的p-Akt水平低于43℃+TAX组(P＜0.05),NAC组的p-Akt水平明显高于43℃+TAX组(P＜0.05),说明热疗过程中产生的ROS可以抑制Akt通路的活化,同时,JNK信号转导通路的激活影响Akt通路的活化。2.4 Caspase-3表达水平的变化43℃+TAX组的Caspase-3表达水平高于对照组和TAX组(P＜0.05),SP600125组的Caspase-3表达水平低于43℃+TAX组(P＜0.05),wortmannin组的Caspase-3表达水平高于43℃+TAX组(P＜0.05),NAC组的Caspase-3表达水平完全被抑制(P＜0.05),说明热疗诱导的细胞凋亡是ROS通过JNK和Akt 2条通路传给caspase途径而引发的,且ROS、JNK信号转导通路对caspase有活化作用,Akt通路对其有抑制作用。2.5细胞凋亡率和细胞周期的变化43℃+TAX组G_0/G_1期和G_2/M期细胞增多,S期细胞减少(P＜0.05),wortmannin组S期细胞更少(P＜0.05),SP600125组和NAC组S期细胞数目增加(P＜0.05),G_2/M期细胞减少(P＜0.05);43℃+TAX组细胞凋亡率增加(P＜0.05),wortmannin组细胞凋亡率进一步增加(P＜0.05),而SP600125组和NAC组细胞凋亡率减少(P＜0.05)。3.HSP70在热疗与TAX抑制肺肿瘤细胞作用中的地位对照组和TAX组的HSP70表达水平几乎一致(P＞0.05),43℃组和43℃+TAX组的HSP70表达水平均较前两组增加(P＜0.05),且43℃+TAX组的HSP70表达水平低于43℃组(P＜0.05),说明热疗诱导产生的HSP70,对不同性质的细胞产生不同的效应,热疗联合TAX可能激活和/或抑制其他通路的激活,减弱了HSP70对肺肿瘤细胞的保护作用,但这个现象在正常细胞中没有观察到。4.GTSP1在热疗与TAX抑制肺肿瘤细胞过程中的作用成功构建pcDNA3.0-GSTP1真核表达载体后,转染A549细胞,获得转染与未转染的两种A549细胞,MTT结果示,GSTP1本身对细胞生长没有影响,转染与未转染细胞增殖率一致(P＞0.05),GSTP1能促进化疗药物的代谢,不同浓度TAX作用后,未转染组细胞增殖率低于转染组细胞(P＜0.05),43℃热疗联合不同浓度TAX作用后,未转染组细胞增殖率高于转染组细胞(P＜0.05);43℃热疗联合TAX作用于转染与未转染细胞,流式细胞仪检测发现,G_0/G_1期和G_2/M期细胞增多,S期细胞减少(P＜0.05)。结论及创新点1.在热疗的作用机制研究中,首次使用人呼吸道上皮BEAS-2B细胞作为研究对象,证明热疗可以减少化疗药物对正常细胞的损伤作用;热化疗联合应用可以明显增加化疗药物对肺肿瘤细胞生长的抑制作用,损伤肺肿瘤细胞膜,抑制肺肿瘤细胞的迁移,诱导肺肿瘤细胞凋亡的发生;2.通过使用通路抑制剂证明,热疗可以诱导ROS的产生,继而激活JNK信号转导通路和抑制Akt通路的活化,通过caspase途径诱导细胞凋亡的发生,热疗主要作用于肺肿瘤细胞的S期,并可使肺肿瘤细胞阻滞于G_2/M期,从而促进TAX对肺肿瘤细胞的抑制作用,同时发现,在热疗中,JNK信号转导通路的激活可以调节Akt通路的活化状态,以上结论在体内实验中得到证实;3.热疗诱导产生的HSP70,对不同性质的细胞产生不同的效应,热化联合的协同作用可能激活和/或抑制其他通路的激活,减弱了HSP70对肺肿瘤细胞的保护作用,因此比热疗能更好地抑制肺肿瘤细胞的生长,但在正常细胞中尚未观察到这个现象;4.首次构建了pcDNA3.0-GSTP1真核表达载体,并在A549细胞中进行表达;GSTP1能促进化疗药物的代谢,导致肺肿瘤细胞对化疗药物的抵抗性增高,热疗可以提高肺肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。
佚名[5]2004年在《肿瘤药理与化疗》文中研究表明5-氟尿嘧啶纳米微球抗肿瘤作用的实验研究姜文奇李苏王安训管忠震中山大学肿瘤防治中心内科目的:研究载5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-Fu)的聚乙二醇.聚谷氨酸苄酯PEG-PBLG)纳米微球对口腔鳞癌及结肠癌的体内抗瘤作用。方法采用超透析法制备-FU/PEG-PBLG纳米胶束,透射电镜观察纳米微球的形态,应用5-FU/PEG-PBLG纳米微球治疗口腔鳞癌或结肠癌裸鼠移植瘤,观察移植瘤的生长状态及组织病理学改变。结果5-FU/PEG-PBLG纳米微球为核-壳型结构,大小约230 nm;于对照组比较,
邓锒梅[6]2010年在《Sorcin相互作用蛋白的筛选及其与胃癌多药耐药的相关研究》文中认为研究背景与目的：胃癌是最常见的恶性肿瘤之一,晚期胃癌患者化疗的有效率约20%-40%。胃癌的多药耐药(multidrug resistance,MDR)是造成化疗失败的极为重要的原因,如何逆转胃癌MDR,提高化疗效果是当前亟需解决的关键问题。近年来虽然胃癌MDR机制被广泛研究,一些新的耐药相关分子如核糖体S13和锌带基因ZNRD1等不断被发现,但仍未能全面阐明其产生机制和找到有效的靶点完全逆转胃癌MDR,提示可能存在不为我们所知的胃癌MDR机制,有必要进一步寻找新的耐药机制及耐药相关基因。在我们的早期研究中,首次发现可溶性耐药相关钙结合蛋白Sorcin在胃癌耐药细胞株SGC 7901/VCR中表达明显增强,用Sorcin寡核苷酸下调其在SGC7901/VCR中的表达,可以部分逆转SGC7901/VCR细胞的多药耐药性,从而证明Sorcin与胃癌多药耐药密切相关。然而,目前国际上关于Sorcin在多药耐药细胞中的具体机制仍不十分清楚。目前研究认为细胞中绝大多数酶的功能和调控过程是以蛋白质复合体或蛋白质网络协同作用实现的,蛋白质的相互作用是目前研究的热点。因此,本课题旨在通过分离、鉴定Sorcin相互作用蛋白质,探讨其在胃癌多药耐药中的作用机制,为逆转胃癌多药耐药提供新靶点。方法：(1)通过脂质体介导将pcDNA3.1-Sorcin-FLAG融合表达载体瞬时转染至HEK293T细胞,RT-PCR和Western blotting分别检测转染细胞中Sorcin mRNA和蛋白表达水平；利用FLAG标签的亲和层析技术提纯Sorcin蛋白复合体；1D-SDS-PAGE技术预分离蛋白复合体；ESI-Q-TOF串联质谱分析鉴定Sorcin相互作用蛋白质；(2)采用免疫共沉淀结合Western blotting在SGC7901/VCR细胞中验证3个可能与Sorcin相关的蛋白质(GSTP1、HSP70、Tubulin);采用RT-PCR和Western blotting分别检测SGC7901/VCR和SGC7901两种细胞中HSP70 mRNA和蛋白表达水平的差异；HSP70siRNA下调HSP70在SGC7901/VCR中的表达,并给予不同浓度的长春新碱干预,采用MTT法分析细胞存活率,Hoechest 33258及流式细胞学检测细胞凋亡；采用RT-PCR检测长春新碱处理后凋亡相关基因bcl-2及bax mRNA的表达,初步探讨HSP70在胃癌多药耐药细胞中可能的作用机制。结果：(1)共鉴定出72个Sorcin相关蛋白质,功能分类包括蛋白质代谢酶类、分子伴侣、生物氧化相关酶类,细胞骨架蛋白、信号转导相关蛋白,酶解相关蛋白和一些功能未知蛋白等；(2)在Sorcin免疫复合物中检测到HSP70、Tubulin、GSTP1蛋白,与质谱分析结果一致；与SGC7901细胞相比,HSP70在胃癌多药耐药细胞SGC7901/VCR中表达明显增强；HSP70 siRNA转染SGC7901/VCR细胞后,RT-PCR和Western blotting结果显示HSP70表达下调；经过长春新碱处理后,与阴性对照组及空白对照组相比,HSP70 siRNA转染组对长春新碱敏感性增加,细胞凋亡明显增加；经长春新碱处理后,SGC7901细胞中bcl-2 mRNA表达较长春新碱处理前下调约42.7%,HSP70 siRNA转染的SGC7901/VCR细胞较阴性siRNA转染的SGC7901/VCR细胞bcl-2 mRNA表达下调约28.6%；而长春新碱处理前后各组细胞bax mRNA表达均无明显变化。结论：(1)成功鉴定出72个Sorcin相互作用蛋白质；(2)免疫共沉淀结合Western blotting的结果证实Sorcin与HSP70、Tubulin、GSTP1存在相互作用；(3)HSP70在SGC7901/VCR细胞株中呈高表达；HSP70 siRNA抑制HSP70的表达可促进长春新碱诱导的bcl-2基因表达的下调,从而上调bax/bcl-2比值,促进长春新碱诱导的细胞凋亡,增强胃癌多药耐药株SGC7901/VCR对长春新碱的敏感性,HSP70有望成为逆转胃癌多药耐药的新靶点。
参考文献：
[1]. 胃癌细胞耐药相关分子的表达、信号转导途径和离子通道特性的研究[D]. 韩英. 第四军医大学. 2001
[2]. 国家自然科学基金委员会生命科学部2003年度资助自由申请科学基金项目一览表[J]. 佚名. 生命科学. 2003
[3]. 电压门控式钾离子通道改变对卵巢癌细胞系增殖活性的影响[D]. 瓮占平. 山东大学. 2007
[4]. 热疗对紫杉醇抑制肺肿瘤细胞的促进作用及其机制[D]. 王琳. 郑州大学. 2008
[5]. 肿瘤药理与化疗[C]. 佚名. 第叁届中国肿瘤学术大会论文集. 2004
[6]. Sorcin相互作用蛋白的筛选及其与胃癌多药耐药的相关研究[D]. 邓锒梅. 中南大学. 2010
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