辽宁省中医院 110032
摘要：目的：探讨二苯乙烯苷（TSG）对H2O2导致大鼠海马神经元氧化损伤的保护作用及机制。方法：将培养9d的大鼠海马神经元随机分为正常组、模型组、给药组（10，50，100 μmol·L-1 TSG）。正常组不做任何处理，模型组给予50μmol·L-1 H2O2，作用24h；给药组在给予H2O2前24h加入不同浓度的TSG；CCK-8法检测各组海马神经元的存活能力；硫代巴比妥酸检测丙二醛含量；黄嘌呤氧化酶法检测超氧化物歧化酶活性；RT-PCR法检测各组海马神经元中CREB和BDNF mRNA的表达。结果：给药组大鼠海马神经元的存活能力和SOD活性较模型组显著增强（P<0.01）；MDA含量显著降低（P<0.01）；CREB和BDNF mRNA的表达明显升高（P<0.01）。结论：TSG对H2O2诱导的大鼠海马神经元氧化损伤有明显的神经保护作用，这可能与激活了CREB/BDNF通路有关。
关键词：H2O2；神经元氧化损伤;研究
中图分类号：R285.5 文献标识码：A
1材料与方法
1.1试剂 二苯乙烯苷购自中国药品检验院，溶于聚乙二醇-400（天津科密欧）配成各浓度待用。DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium ,Gibco公司)，胎牛血清( fetal calf serum, FBS, Gibco 公司), 青-链霉素(penicillin-strepotomycin, P/S, Thermo公司)，H2O2（上海桃浦化学试剂公司）；一抗为兔抗NF-M（北京博奥森）；二抗为Cy3 标记驴抗兔 IgG (北京博奥森)，DAPI 染色液（碧云天），Cell Counting Kit CCK-8 试剂盒（Dojindo），丙二醛（MDA）测试盒（南京建成生物工程研究所），超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所），RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo），PCR Master Mix Kit（Thermo）。
1.2仪器 倒置荧光生物显微镜 (FM-500，上海普丹)，CO2培养箱 (SCO2W-2，SCO2W-2)， PCR仪 (MG96G，杭州朗基)，凝胶成像系统 (2500R，上海天能)，紫外可见分光光度计 （UV9100，邢台润联），酶标仪（dnm-9602a，邢台润联）
1.3动物 SD雄性大鼠体重（200±20）g，购自辽宁长生生物技术有限公司，合格证号：SCXK（辽）2010-001，光明：黑暗=1:1，室温（22±2）℃，相对湿度55%~65%。喂养1周稳定后用于实验。
1.4大鼠海马神经元的分离与培养 取各组大鼠大脑并分离出海马，剪碎并用0.25%胰蛋白酶于37°C消化15min，终止消化后经筛网过滤，得到细胞悬液。细胞悬液以5×109·L-1的密度接种于经多聚赖氨酸包被过的24孔板中，加入含有10% FBS和1% P/S的DMEM高糖培养基，置于37°C，5% CO2-95% 空气培养箱中培养。3~4d后加入3μmol·L-1的阿糖胞苷，1d后更换新的培养基，以后每3d半量换液。培养9d后用兔抗NF-M抗体进行免疫荧光染色，并在倒置荧光显微镜下进行观察 [1]。
1.5造模与分组 将原代培养的神经元随机分为3组：正常组，造模组（培养基中加入50 μmol·L-1 H2O2，作用24h），给药组（在加入50 μmol·L-1 H2O2前给予10，50，100 μmol·L-1 TSG，作用24h）。
1.6 CCK-8检测细胞的活力 将神经元以5×109·L-1的密度接种于经多聚赖氨酸包被过的96孔板中，并以上述分组每组设3个复孔。培养到9d后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，37℃孵育4h，并在450nm 处检测吸光度。重复3次。
1.7MDA含量和SOD活性的测定 脂质过氧化的降解产物之一的MDA可与硫代巴比妥酸（TBA）缩合，形成红色产物，在532nm处惊醒比色测定来检测MDA相对含量变化；黄嘌呤氧化酶反应体系产生超氧阴离子自由基，并经氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂作用下呈红色，并用分光光度计检测吸光度来计算样品中SOD活性。将海马神经元以5×109·L-1的密度接种于经多聚赖氨酸包被过的96孔板中，并以上述分组每组设3个复孔。培养到9d后，按照试剂盒说明书所述方法检测MDA含量和SOD活性。重复3次。
1.8 RT-PCR检测CREB/BDNF通路相关基因的表达 将各组海马神经元置于含有完全培养基6孔板中，每孔2ml。用Trizol法提取各组RNA，按照RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit反转成cDNA；按照PCR Master Mix Kit 所示构建PCR反应。CREB/BDNF通路相关基因序列如表1。反应条件：预变性95℃2min；变形95 ℃30s，退火58 ℃30s，延伸72℃1min，扩增40个循环；终延伸72℃5min。以GAPDH 作为内参。结果用琼脂糖凝胶电泳及凝胶成像系统分析，用Image J图像分析软件对条带进行光密度扫描，结果用相对光密度表示，相对光密度=光密度目的基因/光密度GAPDH。重复3次。
表 1. CREB/BDNF通路相关基因序列
NF-M（红）染色神经元，DAPI（蓝）染色细胞核
2.2TSG促进大鼠海马神经元的存活能力 与正常组相比，模型组的细胞存活率为67.0%（P<0.01）;而给予了不同剂量TSG的给药组的细胞存活率明显升高（P<0.01）,且以给予50 μmol·L-1 TSG的实验组细胞活力更为显著。因此，以下实验均以50μmol·L-1 TSG作为给药组(简称TSG组)。
2.3 TSG 对海马神经元MDA含量的影响 与正常组相比，模型组的细胞MDA含量为1.95（P<0.01）;而给予了TSG的给药组的细胞MDA含量明显降低，含量为1.38（P<0.01）。结果提示，TSG可能对氧化损伤的海马神经元具有保护作用。
2.4 TSG对海马神经元SOD活性的影响 为了更好地检测TSG对氧化应激造成损伤的神经元的保护作用，我们进一步检测各组神经元中SOD的活性。如图2所示，模型组的SOD活性显著下降（P<0.01），而给予了TSG的神经元中SOD显著上升（P<0.01）。
2.5TSG调节海马神经元内CREB/BDNF通路相关基因的表达与正常对比组比较，模型组CREB与BDNF mRNA的表达明显下降（P<0.01）；与模型组相比，TSG组CREB与BDNF mRNA的表达分别上升了，具有显著性差异（P<0.01）。提示TSG可能对海马神经元内CREB通路有影响。
3讨论
神经元是构成神经系统结构和功能的基本单位。许多研究表明[2]神经元的氧化损伤是机体衰老或者老年痴呆的原因之一。本实验发现模型组的海马神经元较正常组的存活能力显著下降，MDA含量明显上升，SOD活性显著下降。说明海马神经元被损伤，并进一步来探讨TSG对氧化损伤模型的保护作用，为TSG抗衰老或者抗老年痴呆等作用的研究提供基础。
本实验中我们对造模前的神经元给予了不同浓度的TSG，结果发现，TSG对海马神经元发挥了一定的神经保护作用，促进了神经元的存活和降低了神经元的损伤并与剂量成正相关。此神经保护作用可能与TSG激活了CREB/BDNF信号通路有关，但具体的机制需要进一步研究。
参考文献
[1] 李少恒，胡昱，姚璎珈，等. 蛇床子素对神经干细胞体外分化的影响[J]. 医药导报，2015，34(7): 856-860
[2]张岳，余瑾，张艺，等. 衰老可导致间充质干细胞氧化损伤修复能力降低[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(10): 1801-8
论文作者:胡航
论文发表刊物:《解放军预防医学杂志》2015年第12期供稿
论文发表时间:2016/2/24
标签：神经元论文; 损伤论文; 作用论文; 活性论文; 模型论文; 密度论文; 大鼠论文; 《解放军预防医学杂志》2015年第12期供稿论文;