1. 徐州医学院附属医院麻醉科 江苏徐州 221002；2.江苏省肿瘤生物治疗研究所 江苏徐州 221002
摘要：目的 观察大鼠脑缺血再灌注损伤后PP2和依达拉奉联用对大鼠脑损伤的保护作用。方法 选用雄性大鼠150只，体重250-300g，除假手术组外，其余各组均采用线栓法制备大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型。造模成功后随机分为7组，每组18只：假手术组（Sham组），缺血再灌注组（I/R组），溶剂对照组（DMSO组），生理盐水组（NS组），PP2组，依达拉奉组（MCI-186组）；联合用药组（Co-drug组）。处理24h后断头取脑，观察大鼠脑梗死面积，检测MDA、SOD含量，用TUNEL法检测脑组织缺血半暗带的凋亡，用Western blot方法检测激活的Caspase-3蛋白的表达。结果 与I/R组相比，PP2组、MCI-186组及Co-drug组梗死面积有显著减少（P<0.05），Co-drug组梗死面积减少最为明显（P<0.01）；与Sham组比较，I/R组、PP2组、MCI-186组的MDA升高（P<0.05）、T-SOD降低（P<0.05）；与I/R组比较，PP2组、MCI-186组及Co-drug组的MDA降低（P<0.05），SOD升高（P<0.05），TUNEL结果显示，与Sham组相比，I/R组、PP2组、MCI-186组均使得脑组织损伤，Caspase-3表达增加；与I/R组相比，PP2组、MCI-186组、Co-drug组均使得脑组织损伤减轻，Caspase-3表达降低。结论 Co-drug组比单药组更为有效，联合PP2和依达拉奉联用能够明显的改善大鼠脑缺血再灌注造成的损伤。
关键词：Src激酶；PP2；依达拉奉；脑缺血再灌注损伤
临床上常用溶栓来治疗缺血性脑卒中，然而脑组织缺血再灌注时产生的损伤要远远大于本身缺血对脑组织的伤害。一直以来，人们在寻找着减少脑组织缺血再灌损伤的有效措施。研究证明在脑缺血组织中，Src激酶表达异常上调[1]，而Src激酶抑制剂PP2可以通过减少凝血酶对Src激酶的激活、减轻兴奋性氨基酸介导的兴奋毒性、使VEGF和基质金属蛋白酶介导的血管通透性改变，以及细胞因子介导的炎症反应等[2]来减轻对脑组织的损伤作用[3-4]。另外，氧自由基增多、一氧化氮含量上升产生的神经毒性等也是对脑损伤的重要因素。在脑缺血再灌注中，Caspase-3表达异常升高在脑缺血再灌注损伤介导的细胞凋亡中扮演着执行者的角色。许多研究证明依达拉奉是较好的脑缺血再灌注后处理过程中较好的氧自由基清除剂[5-6]。本文将建立大鼠脑缺血再灌注模型，观察PP2联合依达拉奉后处理对大鼠脑的保护作用，以及探讨相关机制。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物选择 雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠由徐州医学院实验动物中心提供。
1.1.2 试剂及药品 2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium，TTC）、DMSO购自美国Sigma公司，依达拉奉注射液购自南京先声药业有限公司，PP2购自美国Calbiochem，Merck公司，TUNEL试剂盒购自美国Roche公司，Caspase-3一抗购自美国cell signaling公司，兔抗大鼠二抗购自南通碧云天生物技术研究所，HRP Substrate Peroxide Reagent购自美国MILLIPORE公司，MDA、T-SOD试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
1.2 方法
1.2.1 脑缺血模型的制备及分组 选择健康雄性SD大鼠150只，10~14周龄，体重250~300g，用改良Longa线栓法[7]经从右侧颈总动脉插线，栓闭塞右侧大脑中动脉，于2 h后拔出线栓制作缺血再灌注模型。大鼠造模清醒后进行Longa评分[7]。得分为1～3分大鼠共126只纳入实验，并用随机数字表法分入对照组和各干预组，每组18只。再选择18只为假手术组，除不插线栓及药物干预外，其他步骤同I/R组。各组均于手术后24 h断头取脑。采用随机数字表法，将大鼠随机分成7组（n=18）：假手术组（Sham组），缺血再灌注组（I/R组），溶剂对照组（DMSO组），生理盐水组（NS组），Src激酶抑制剂组（PP2组），依达拉奉组（MCI-186组）；联合用药组（Co-drug组）。
干预措施 除Sham组和I/R组以外，各组均在复灌6h后给予药物干预：DMSO组给予脑室注射5μl DMSO。NS组给予腹腔注射等容量的NS注射液，PP2组给予脑室注射PP215μl·10μl-1（5μl），MCI-186组给予依达拉奉注射液腹腔注射3mg·kg-1；Co-drug组给予脑室注射PP2 15μl·10μl-1（5μl）、依达拉奉注射液腹腔注射3mg·kg-1。在各个处理因素后24h，断头取脑。
1.2.2 检测脑梗死面积
每组分别取6只大鼠，麻醉后断头取整个大脑，生理盐水清洗一次后立即放入切脑器内，沿冠状面连续切成2.0mm厚的冠状切片6片，置于2％的TTC溶液中，37℃避光染色20 min后取出脑片，将其放入4％多聚甲醛溶液中固定，24 h后拍照，采用Image Pro Plus 6.0图像处理软件计算梗死面积，采用Belayer等[6]的矫正公式计算较正梗死面积百分比。
1.2.3 MDA、T-SOD检测抗氧化能力
取右侧缺血半暗带部分组织匀浆后，按照MDA、T-SOD试剂盒操作步骤，用硫代巴比妥法测定MDA含量，用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性。
1.2.4 TUNEL检测凋亡
每组取6只大鼠再灌注24h后处死取脑，冰生理盐水冲洗后将右侧大脑在冰盘上快速行冠状切开，取脑缺血半暗带部分用于做TUNEL染色。
1.2.5 western blot检测Caspase-3表达
取右侧缺血半暗带部分组织匀浆后进行SDS-PAGE电泳，用Caspase-3一抗4℃孵育过夜，兔抗大鼠二抗2h后，曝光。
数据采用SPSS 19.0统计学软件进行分析，计量资料以均数±标准差（）表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义
2 结 果
2.1检测脑梗死面积 与Sham组比较，I/R组、PP2组、MCI-186组的梗死面积有所增加（P<0.01），与I/R组相比，PP2组、MCI-186组及Co-drug组梗死面积有显著减少（P<0.05）见表1；
2.3 TUNEL检测凋亡
TUNEL结果显示：各组均可见典型凋亡的神经细胞。凋亡细胞周围无炎症反应，表现为单个细胞缺失。同时有细胞坏死，有较为清楚的坏死灶。Sham组各时间点脑组织见个别的凋亡细胞；I/R组、DMSO组、NS组在缺血再灌注24h后可见凋亡细胞明显多于Sham组；PP2组、MCI-186组、Co-drug组凋亡细胞数比I/R组有明显减少，与PP2组、MCI-186组相比Co-drug组凋亡细胞有所下降，见图1。
3 讨 论
脑出血导致的凝血酶的活化是导致脑损伤的主要因素[8]，现已明确，缺血性脑血管溶栓后再灌注导致的脑损伤远比单纯的脑组织缺血更严重。
研究发现在脑缺血性模型中，Src激酶异常上调[9]，Src激酶直接调控着下游的大电导钙激活钾通道的开放和关闭。阻断Src激酶，可以抑制血管平滑肌细胞膜去极化和血管收缩。另外Src激酶的阻断，比如PP2可减少凝血酶对Src激酶的激活、减轻兴奋性氨基酸介导的兴奋毒性、也会导致VEGF和基质金属蛋白酶介导的血管通透性改变，以及细胞因子介导的炎症反应等。这些活动都参与了脑出血急性期的脑损伤和恢复期的自我修复[2]。因此本文采用了PP2做为Src激酶抑制剂，可以从上述多个方面对脑缺血再灌注损伤的多个关键环节起到阻断的作用。
然而在脑缺血再灌注中，氧自由基的增多也是对脑损伤的一个非常重要的因素，单纯地依靠PP2抑制了部分通路还远远不够，产生的大量氧自由基对脑组织的伤害是非常严重的，清除氧自由基也是脑缺血再灌注损伤治疗的非常重要的一步。
依达拉奉是现今用到临床的治疗缺血性脑卒中的药物，其机制有体内的活性氧分子、消除自由基抑制脂质过氧化作用，可抑制脑细胞（血管内皮细胞、神经细胞）的过氧化作用，从而减轻脑缺血和脑缺血引起的脑水肿及组织损伤，改善神经症状，抑制迟发性神经细胞死亡等神经保护作用[10]为了能够提高治疗效果，已经有了联合用药的研究，其中黄浩[11]等用了依达拉奉和尼莫地平连用，发现治疗效果已优于单药单用，等等。结合本文，同时也说明了在后处理过程中，对脑损伤的进展的各个途径进行干预，可以减轻脑损伤的进展，具体机制还有待进一步探索。
本文阐明了PP2联合依达拉奉可以使得脑缺血再灌注的损伤起到比较大程度的保护作用。在本实验中依达拉奉是腹腔注射，而用PP2则是脑室给药，现临床上脑室给药要求精度要高、给药时间要长、拔针时间也要求甚高，给患者带来很大的治疗风险。因此，寻找更加安全并且有效的给药途径、或者PP2的剂型改造，都将给本方法带来更加可行之处。
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论文作者:孔德强1,程乾2
论文发表刊物:《健康世界》2016年第16期
论文发表时间:2016/9/28
标签：激酶论文; 脑缺血论文; 大鼠论文; 损伤论文; 达拉论文; 组织论文; 凋亡论文; 《健康世界》2016年第16期论文;