黄灿平[1]2002年在《猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因在原核和真核系统中的表达与鉴定》文中研究说明猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是新发现的动物传染病，以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸困难为特征。其病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)。我国1996年才报道有PRRS流行，目前流行的范围日益扩大，对养猪业构成了严重威胁。快速、特异的诊断方法对本病流行的控制已成为迫切需要。PRRSV为正链的单股RNA病毒，基因组长15kb，含有8个开放阅读框。其中ORF7编码的核衣壳蛋白(N蛋白)是病毒重要的结构蛋白，具有较强的免疫原性，基因序列保守，有望应用于临床诊断。本研究则从以下两个方面研究N蛋白，旨在改进现有的ELISA检测技术，为有效诊断和防制该病奠定基础。 (一)原核系统表达： 本研究根据PRRSV美洲毒株的基因序列，设计了能够扩增N蛋白基因的一对含有EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切位点的引物，经PCR技术从pBV-MN质粒中克隆出大小为372bp的基因，将此基因克隆到pREST A表达载体中，构建了表达质粒pREST-N。转化入大肠杆菌BL_(21)用IPTG进行诱导表达，结果表达出约17.8kDa的融合蛋白，蛋白大小与N蛋白设计相符，经Western-Blot免疫印迹分析，该表达产物与兔抗PRRSV血清反应，说明PRRSV N蛋白在原核系统获得有效表达。为研制ELISA抗原奠定了基础。 (二)真核系统表达： 构建了pcDNA3-N真核表达重组质粒。将pcDNA3-N真核表达重组质粒通过磷酸钙的方法转染COS-7细胞。经间接荧光染色检测，转染的pcDNA3-N重组质粒在COS-7细胞中能够得到表达，从而为N蛋白基因免疫制备高质量抗N蛋白的抗体奠定了基础。
李玉军[2]2008年在《猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因的表达及其特性》文中提出猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)主要引起怀孕母猪的繁殖障碍以及仔猪的呼吸道症状,自1987年首次报道以来,已形成全球性流行并造成了很大的经济损失。该病的病原为PRRSV,随着毒株的毒力变异,新的强毒株不断出现,并能引起免疫过的猪场发病,而且人工致弱的疫苗毒也能返强而引起临床疾病。目前,针对该病尚无有效的治疗措施,因此加强对该病的监测尤为重要。本文分别用原核和真核表达系统对PRRSV核衣壳蛋白基因进行表达,并对目的基因蛋白的表达进行了分析,证明其具有良好的抗原性,为该病的监测和防控奠定一定的基础。一、猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因在大肠杆菌中的表达用RT-PCR扩增出PRRSV YC/2007株核衣壳蛋白(N)基因,首先克隆到pGEM-T easy载体,再克隆到表达载体pGEX-6P–1中谷胱甘肽- S-转移酶(GST)基因的下游,重组质粒转化大肠杆菌BL21,实现了PRRSV核衣壳蛋白基因在原核表达系统中的表达。经SDS–PAGE和Western blot方法对表达产物进行分析,结果表明GST–N融合蛋白的分子量约为39.5kDa,另外还有一大小为30.5 kDa左右的GST-N融合蛋白的降解产物。证明了表达产物的特异性。二、猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因在杆状病毒表达系统中的表达本试验将PRRSV YC/2007株核衣壳蛋白基因克隆到转座载体pFastBac1中,然后将含有PRRSV核衣壳蛋白基因的表达盒转座到穿梭载体Bacmid中。重组质粒转染Sf9细胞,获得了重组杆状病毒reBac-N。重组病毒感染Sf9细胞后,用IFA和Western blot方法对细胞表达产物进行检测,结果表明:构建的重组杆状病毒能够在昆虫细胞中表达PRRSV YC/2007株的核衣壳蛋白。
参考文献：
[1]. 猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因在原核和真核系统中的表达与鉴定[D]. 黄灿平. 南京农业大学. 2002
[2]. 猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因的表达及其特性[D]. 李玉军. 扬州大学. 2008
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