张军宁[1]2001年在《内、外照射诱导DNA链断裂与修复在肿瘤治疗中的作用》文中研究表明放射治疗是恶性肿瘤的主要治疗手段之一，但目前在临床上仍存在肿瘤放射抗拒性与正常组织晚发性反应两方面的问题。当今辐射诱导的DNA链断裂与修复和辐射诱导的细胞凋亡的研究提供了利用分子途径调节放射反应的可能性，已成为最具有潜在临床应用价值的重点研究课题。 单细胞凝胶电泳技术是近年来发展起来的一种在单细胞水平检测哺乳类有核细胞DNA链断裂与修复的新技术，已广泛应用于放射生物学、遗传毒理、肿瘤治疗评价、细胞凋亡等领域的研究。本课题我们首先建立和改进了测定DNA双链断裂的中性微凝胶电泳技术和测定DNA单链断裂的碱性微凝胶电泳技术；在此基础上，应用其对γ射线外照谢小鼠、裂片核素内照射大鼠、X射线接触者、恶性肿瘤患者和放疗后肿瘤病人的外周血淋巴细胞以及X射线外照射对叁株不同放射敏感性的肿瘤细胞的DNA链断裂与修复进行检测，进一步探讨其作为癌患风险评估的生物学标志及预测肿瘤细胞内在放射敏感性的可行性。主要内容如下：1.分别应用中性单细胞凝胶电泳、碱性单细胞凝胶电泳技术检测了不同剂量γ射线外照射对小鼠外周血淋巴细胞DNA的损伤。结果表明，γ射线外照射对小鼠外周血淋巴细胞DNA具有明显的损伤作用，彗星细胞百分率显着增加，DNA电泳迁移，且迁移的距离与照射剂量之间呈良好的线性关系。2.应用碱性单细胞凝胶电泳技术观察了混合裂变产物急性染毒时对大鼠外周血淋巴细胞DNA的损伤，探讨了混合裂变产物致癌的分子机理和诱发免疫细胞的放射免疫毒理效应，旨在为广泛开展内照射治疗，提供免疫学方面的依据。结果表明，裂片核素内照射对大鼠外周血淋巴细胞DNA具有明显的损伤作用，彗星细胞百分率和DNA的损伤程度随染毒时间的延长、累积剂量增大而逐渐加重，且存在较好的剂量-反应关系。 以上结果提示，单细胞凝胶电泳技术可用于检测辐射所致离体细胞DNAssb和DNAdsb损伤效应，还能用来研究在体细胞的辐射损伤和修复作用，并有望成为新一代生物剂量计。3.应用碱性单细胞凝胶电泳技术检测了正常健康人、肿瘤患者、X射线接触者和肿瘤放疗病人外周血淋巴细胞的DNA单链断裂，探讨其单独作为潜在的人体健康危害早期生物学指标的可能性。结果表明，X射线探伤工人、恶性肿瘤患者、恶性肿瘤放疗患者的 Ai！lll23＝uyAIAMmMsaAf：1：Mlainn 叶周血；。巴细吧生纳分率及DNA迁梆E离均显着增加。结果提示，单细胞疑胶。匝泳 技人杉八’．拈＊＼八 丁擎成为痔患风 勺的生物学标志、适合于肿瘤易感人群 辐射敏 感人群的D生物u。 4．应用克隆形成3土、中仕单细胞iap电泳技术揽则辐射诱导的人红白恤丙细胞株卜。 人结肠Bbe细胞株u－卜门了、鼠肛灭a蕾细胞株Q的咖台DN A g断裂数及双链惭裂 后的修复与细胞内在放射敏感仕之间的关系。结果表明，叁X蜘胞系的 仕依次 为沏）is 1＊＞乙；叁种细跪的DNA jlj＄lf巨离都脯贼＃慢的增加鹏大，呈良 好的剂量效应关系，在相同剂量下辐射诱导的D＼A双链的初始断裂数目也依次为 沏＞is1刁。；于中细胞系经lffiyX 4i］W｝！ugl］－并在PBS中培养不同时间后DNA迁移 距离都有较大幅度的下降，grlsffifllglwth次为 C户LSJ习＞Ia，棚同齐慢～诱 导的DNAXli＆jDj．ocux－－的修复能力也依次为Ce＞ts1＊。结果提示，辐射诱导的DNA 双链撕裂及修复与细胞内 良好的相关性，可望用于人体月呐蔑细胞内在放 射敏感胜的U。 5．觑克隆形碱去、碱性单细胞凝胶电泳技木北钡u剧诱导的人红白帧细胞株K刊、 懈肠腺癌细胞株 is1d、鼠胶质瘤细胞株 C。的滩 DNA单镇掰语骏汉及单链断裂 后的修复与细胞内在放射敏感住之间的关系。结果表明，叁种细胞系的 仕依次 为la）ts－T－117＞C。；壬中细胞系的0＼A i｝ftl＄lf巨离都随着 懂的增加而增大，呈良 好的剂量效应关系，在相同剂量下辐射诱导的队A单链的初始断裂数目也依次为 ～＞！｝卜117兀；；叁种细胞系经lin以射绚照谢并在＊田中培养不同时间后mA迁移 距离 跟的下降，其下降幅度依次为 C＊is厂门7＞ Ia，在相同齐慢…诱 导的DNA一的修复g幼也依次为C6＞LS1＞陆。结果提示，栅龈的DNA 单链断裂及修复与细胞内 盼的相关性，可望用于人体肿瘤细胞内在放 — ———u。 治疗B赡最有效的方法可gbe诱发细胞的凋亡。许多外界因剥呻离辐射、化学 药物、细胞因子等均可触发细胞凋亡，这为B帕的治疗提出了新的策略。为了o运 用放射性脯内删的作用特点，删内照谢袖谢性龌牧诱发Ia翩啪… 射毒理效应的分于机理，从而设想考虑将皎时性核素与单克隆抗体?
卿毅[2]2009年在《放射线抵抗宫颈癌细胞株DNA损伤修复基因表达谱的研究》文中指出宫颈癌是我国女性发病率较高的恶性肿瘤之一,每年新增宫颈癌病例130000余例、死亡50000余例,其发病率与死亡率分别占我国妇科肿瘤的第一位和第二位,对中晚期或术后复发的宫颈癌患者,放射治疗是主要的治疗方法。1998年,我院全国首家应用体外照射联合中子后装治疗宫颈癌,肿瘤局部控制率和5年存活率分别为85.2%和88.7%,取得了良好的疗效,但在治疗过程中,我们观察到部分宫颈癌患者存在放射抵抗的问题,而且在临床实践中也发现治疗过程中有耐放射性改变,因此,研究影响宫颈癌细胞放射敏感性的因素具有十分重要的意义。DNA损伤修复是影响放射敏感性的重要因素,因此深入研究DNA修复基因的表达谱,有助于阐明宫颈癌抵抗放疗的分子机制,为寻找提高宫颈癌放疗敏感性的分子靶点提供实验基础。但DNA损伤修复机制十分复杂多样,小数量的基因不能阐述清楚,需要参与DNA损伤修复过程基因组的大量信息,这样才能真正了解其分子机制。而基因芯片技术是一个强有力的获得癌细胞中成千上万的基因表达的综合性信息的工具,通过该技术可为研究DNA损伤修复基因致宫颈癌放疗抵抗的分子机制提供有效方法。因此本研究首先检测了DNA损伤修复基因APE1在宫颈癌中的表达情况,分析APE1与宫颈癌的临床病理因素及锎-252中子放疗的预后的关系,初步探讨了DNA损伤修复基因APE1与宫颈癌放射抵抗的相关性。然后通过诱导建立宫颈癌耐放射细胞株,采用基因芯片技术对宫颈癌放DNA损伤修复信号通路基因表达谱进行研究,筛选出GADD45α等差异表达基因,构建GADD45α表达载体并初步证明其增加宫颈癌放疗敏感性的作用。研究目的1.探讨DNA损伤修复基因APE1与宫颈癌放射抵抗的相关性;2.探讨DNA损伤修复相关基因致宫颈癌放射抵抗的机制;3.初步探讨GADD45α表达载体增强宫颈癌放疗敏感性的作用。研究内容和方法1. DNA损伤修复基因APE1在宫颈癌中的表达及其与锎-252中子放疗预后的关系:采用采用免疫组化方法APE1在宫颈癌中的表达情况,分析APE1与宫颈癌的临床病理因素及锎-252中子放疗的预后的关系;2.诱导并建立放射线照射耐受株:应用直线加速器和锎-252中子后装治疗机对宫颈癌Hela细胞株进行剂量个体化的反复放射线照射,剂量呈梯度增加,最后使其耐放射性具有一定的稳定遗传能力,建立耐中子射线细胞株HelaNR和耐X射线细胞株HelaXR,并通过克隆形成分析、超微结构观察、细胞倍增时间、细胞周期分布和凋亡这些指标检测其耐放射特性。3.耐放射宫颈癌细胞株DNA损伤修复相关差异表达基因的筛选:采用DNA损伤信号通路基因芯片(OHS-029)检测Hela、HelaNR和HelaXR细胞的基因表达谱,分析其差异表达基因,并采用western blot和Real-time PCR技术验证基因芯片结果的可靠性。4. GADD45α表达载体增强宫颈癌放疗敏感性的初步实验研究:构建特异性pcDNA3.1-GADD45α真核表达载体,Real-time PCR检测转染后宫颈癌细胞GADD45αmRNA表达情况,流式细胞仪检测转染后细胞凋亡情况。研究结果1. DNA损伤修复基因APE1在宫颈癌中的表达及其与锎-252中子放疗预后的关系:宫颈癌组织APE1表达水平明显高于正常宫颈组织和CIN病例(P<0.01)。APE1在正常宫颈组织和CIN病例均呈胞核表达,宫颈癌组织中APE1呈胞核表达(59)、单纯胞浆表达(8)或核浆共同表达(22)。APE1表达强度与FIGO分期、病理分级和淋巴结转移情况有关(P<0.05),与年龄和病理分型无关。APE1亚细胞定位情况与FIGO分期、病理分级有关(P<0.01),与淋巴结转移情况无关。生存分析显示在APE1核表达组(中位生存时间70.9月)和APE1低表达组(中位生存时间75.8月)的生存时间明显长于APE1浆表达组(中位生存时间57.8月)和APE1高表达组(中位生存时间56.5月)(P=0.025,0.001)。2.诱导并建立放射线照射耐受株:(1)克隆形成分析结果发现耐放射株与亲本株相比,SF2值、D0(平均致死剂量)、Dq(准域剂量)值均明显增高,结果说明诱导的耐放射细胞株的放射敏感性降低了,其耐放射性具有一定的稳定遗传能力。(2)通过电子显微镜观察细胞,可发现耐放射细胞的形态与结构均发生了变化,细胞表面可见伪足样突起;细胞浆内可见大量空泡,核蛋白体、线粒体、染色体、粗面内质网、核仁均出现了形态变化,细胞骨架排列紊乱。(3)Hela, HelaNR和HelaXR的细胞倍增时间分别是(28.62±2.77) h、(33.12±3.67) h和(36.94±3.16) h,放射耐受株的细胞倍增时间明显长于亲本株(P <0.05)。(4)我们用流式细胞仪检测细胞周期分布的结果显示,相对于亲本株Hela,中子耐受细胞株HelaNR和X射线耐受细胞株HelaXR的各周期百分比变化并不明显;但在接受4Gy射线照射后,亲本株G2期分布明显升高,G1期分布减少,而放射耐受细胞株G2升高不明显;在接受16Gy射线照射后,放射耐受细胞株G2期也明显升高,但亲本株G2期升高更加明显。这也说明放射耐受细胞株较亲本株的放射敏感性更低。(5)凋亡检测结果显示,随着照射剂量的增加,细胞的凋亡率也升高,但在相同剂量射线照射后,放射耐受株的细胞凋亡率明显低于亲本株细胞,两者间有显着性差异(P <0.05),表明在相同放射剂量的照射下,放射耐受株对放射线更加抗拒,进一步证明了诱导的耐放射株具有放射抵抗性。3.耐放射宫颈癌细胞株DNA损伤修复相关差异表达基因的筛选:与亲本株Hela细胞相比,耐放射株HelaNR和HelaXR细胞基因表达改变的总趋势是一致的,表明中子射线和X射线照射诱导Hela细胞发生放射抵抗,引起相似的DNA损伤修复基因表达的改变。筛选亲本株与耐放射株差异在两倍以上的基因:HelaNR细胞有24个差异表达基因,其中19个上调,有5个下调;HelaXR细胞有41个差异表达基因,其中38个上调,有3个下调。通过生物信息和参考文献挖掘得到GADD45α和BTG2等可能与宫颈癌放射耐受密切相关的基因,并采用western blot和Real-time PCR检测了Hela、HelaNR和HelaXR细胞中GADD45α和BTG2两个基因的蛋白和mRNA表达情况,结果显示:在HelaNR和HelaXR细胞中,GADD45α表达下调,BTG2表达上调,与基因芯片的结果是一致的。4. GADD45α表达载体增强宫颈癌放疗敏感性的初步实验研究:通过测序和在PUBMED上做BLASTn比对,结果表明,重组质粒中插入的序列与已知GADD45α基因序列同源性达到99%,我们成功构建pcDNA3.1-GADD45α真核表达载体,Real-time PCR检测结果显示转染后细胞GADD45αmRNA含量明显增加(P<0.05),说明pcDNA3.1-GADD45α真核表达载体能增加GADD45α基因在这3个细胞株中的表达。进一步用流式细胞仪检测0、4和16Gy X射线照射后Hela细胞的凋亡情况,结果显示随着照射剂量的增加,细胞的凋亡率也升高,但在相同剂量X射线照射后,对照组的细胞凋亡率与脂质体组无显着差异(P>0.05),转染组的细胞凋亡率明显高于对照组和脂质体组,它们之间有显着性差异(P <0.05),表明转染pcDNA3.1-GADD45α质粒,增加Hela细胞GADD45αmRNA表达,可增加X射线照射后细胞的调亡率。结论1. APE1表达强度和亚细胞定位情况与宫颈癌的发生、发展和锎-252中子放疗的预后有关,APE1表达强度与宫颈癌的侵袭和转移有关,提示APE1的DNA损伤修复功能可能是导致宫颈癌放疗抵抗的重要因素;2.我们采用梯度增加剂量照射宫颈癌Hela细胞进行诱导的方法,建立了耐中子射线细胞株HelaNR和耐X射线宫颈癌细胞株HelaXR,并通过检测其放射生物学特性,证明了诱导的耐放射株具有放射抵抗性;3.通过基因芯片技术检测宫颈癌Hela细胞株和诱导的耐放射亚株HelaNR及HelaXR的基因表达谱,筛选出与宫颈癌放射抵抗相关的DNA损伤修复信号通路差异表达基因,为宫颈癌放疗耐受的干预及基因放射治疗提供可能的靶点。4.构建pcDNA3.1-GADD45α真核表达载体,转染入宫颈癌细胞,可显着增加其GADD45α基因的表达,并且能显着增加X射线诱导的细胞凋亡,初步说明了提高宫颈癌细胞GADD45α基因表达可增加其对放射线的敏感性。
张遵真[3]2005年在《DNA氧化损伤修复基因HOGG1低表达细胞株的建立及其应用研究》文中研究指明DNA损伤与修复一直是毒理学和肿瘤学研究的热点,在众多DNA损伤中,以自由基(free radical)引起的DNA氧化损伤(oxidative DNA damage)研究最多,被认为是启动和促进肿瘤发生最为重要的因素。大量研究表明:活性氧(reactive oxygen species,ROS)自由基可以直接攻击生物大分子DNA,诱发DNA链断裂和多种形式的碱基修饰。在各种DNA氧化损伤中,以鸟嘌呤8位碳原子的氧化最常见,其氧化产物8-羟基-脱氧鸟嘌呤(7,8-dihydro-8-oxoguanine,8-OHdG)在体内形成后较为稳定、易于检测,被公认为DNA氧化损伤的生物标志物(biomarker)。此外,8-OHdG最特征、最具生物学意义的危害是:DNA链中的鸟嘌呤G被氧化成8-OHdG后可导致DNA链空间构象的改变,在DNA合成时8-OHdG优先或等效率地与腺嘌呤A配对,从而导致DNA链G:C→T:A颠换,该颠换在肿瘤形成中发生最早,常见于癌基因ras和抑癌基因p53中,故此突变被认为与肿瘤的发生发展、机体细胞的老化和某些退行性疾病的发生都具有密切的关系。 人体细胞中,特异性切除和修复8-OHdG的酶是8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶(human 8-oxoguanine DNA glycosylase,简称HOGG1),具有切除DNA双链中与碱基C配对的8-OHdG的作用,从而恢复基因组中正常的G∶C配对,在维持基因组稳定和肿瘤预防上具有举足轻重的作用,编码该蛋白的基因hOGG1于1997年成功克隆。 人群流行病学研究显示:hOGG1基因在不同人群存在遗传多态性,并与癌症易感性密切相关,其突变或缺失将增加个体罹患肿瘤的风险。
臧亚晨[4]2016年在《ELL2在前列腺癌细胞DNA损伤修复中的作用及其机制的实验研究》文中研究表明背景和目的前列腺癌的发病率逐年升高,内分泌治疗在初期能获得满意疗效,但在一段时间后雄激素阻断治疗变为无效,肿瘤重新开始进展,最终发展为去势抵抗性前列腺癌(CRPC),造成肿瘤局部复发,并多伴有全身转移。一旦当CRPC形成,的目前治疗手段疗效有限,肿瘤出现会快速转移,预后极差。因此,阐明前列腺癌发生进展的分子机制,为前列腺癌的治疗提供新的思路和方法有着迫切的临床需要。ELL2是前列腺癌的一个抑癌基因,在前列腺良性组织内高表达,ELL2的缺失或突变可诱导前列腺癌发生,是前列腺内环境稳定的重要因子。而肿瘤的发生,及其侵袭、转移、耐药等生物学行为均与DNA损伤和修复密切相关。本研究旨在明确ELL2对前列腺癌细胞DNA双链损伤的保护作用及探索其对DNA损伤修复的相关调节机制,从而为前列腺癌的基础研究提供新的视点,也为临床治疗前列腺癌提供新的思路。方法1.选取前列腺癌C4-2、LNCa P、PC-3和22RV1细胞株,设计针对ELL2的si RNA,将其和对照si RNA转染入细胞或者将已构建的Flag-ELL2质粒转染入细胞,再通过不同浓度的阿霉素和γ射线诱导DNA双链损伤,收集细胞行western blot检测DNA损伤标记物γH2AX的表达,并行彗星实验检测彗星的尾距。2.利用基于I-Sce I的DR-GFP同源重组检测系统和H1299d A3-1#1非同源末端连接检测系统,通过si RNA下调ELL2表达后,再转染外源性I-Sce I质粒,流式细胞仪检测GFP阳性细胞百分比,分析ELL2对两个修复通路的影响。3.将GFP标记的ELL2或GFP,和RFP标记的Ku70、Ku80或RFP转染入C4-2细胞中,利用Olympus共聚焦激光系统800μW能量的405nm微激光在细胞核原位制DNA双链断裂,并观察GFP-ELL2、RFP-Ku70、RFP-Ku80在DNA断裂末端聚集产生foci的应答效应。4.将Flag-ELL2、GFP-Ku70、GFP-Ku80转染入HEK293细胞中,进行外源性蛋白质免疫共沉淀;将阿霉素处理过和未处理过的C4-2细胞进行核质分离提取核蛋白,进行内源性蛋白免疫共沉淀,鉴定ELL2是否和Ku70/80蛋白相结合。5.通过si RNA下调ELL2表达后,将GFP-Ku70或GFP-Ku80转染入C4-2细胞中,利用微激光制造DNA双链断裂,在共聚焦显微镜下连续动态观察并记录DNA损伤后8分钟内GFP-Ku70或GFP-Ku80应答形成foci的情况。利用软件分析foci强度并绘制强度时间曲线。观察ELL2对Ku70/Ku80在DNA断端聚集的影响。6.设计只针对内源性ELL2而对外源性ELL2没有作用的si RNA,转入细胞后,将Flag-ELL2或Flag,和GFP-Ku70/Ku80共同转入细胞,连续动态观察并记录微激光制造损伤后8分钟内GFP-Ku70或GFP-Ku80应答形成foci的情况,观察挽救性上调ELL2表达后对Ku70/Ku80在DNA断端聚集的影响。结果1.在前列腺癌多个细胞系中,ELL2表达下调后,western blot检测到阿霉素或γ射线诱导的DNA损伤标记物γH2AX表达增加,彗星实验中慧星尾距明显增加。ELL2过表达后,γH2AX表达显着减弱。2.在HR检测系统中,转染I-Sce I质粒后引起了DNA双链断裂,并发生了HR修复,而下调ELL2表达并不影响DNA双链断裂的HR修复。在NHEJ检测系统中,转染I-Sce I质粒后引起了DNA双链断裂,并发生了NHEJ修复,下调ELL2表达使得DNA双链断裂的NHEJ修复水平减弱。3.ELL2、Ku70、Ku80对微激光诱导的DNA双链断裂有迅速应答效应,并且ELL2与Ku70/80共同聚集在DNA双链断裂部位。4.外源性Co-IP显示ELL2与Ku70、Ku80结合形成蛋白复合物,且ELL2与Ku80的结合程度较Ku70高。内源性免疫共沉淀结果显示阿霉素诱导的DNA损伤促进了ELL2与Ku70、Ku80的结合。5.下调ELL2的表达使Ku70/80在DNA双链断裂的断端聚集形成foci的强度减弱,挽救性过表达ELL2可增强Ku70/80在DNA双链损伤断端的聚集。结论1.ELL2对前列腺癌细胞的DNA损伤具有修复作用。2.下调ELL2表达后使DNA双链断裂的NHEJ修复途径减弱,而对HR修复途径没有影响。3.ELL2可以和Ku70、Ku80结合形成蛋白复合物,DNA损伤促进了它们的结合。ELL2对Ku70/80蛋白表达水平没有影响。4.ELL2和Ku70、Ku80在DNA双链断裂发生后,迅速聚集在DNA双链断裂部位形成foci,并且ELL2可以调节Ku70和Ku80在DNA断端的聚集来调控NHEJ修复。
史修波[5]2007年在《节律基因Period2对紫外线损伤细胞的研究》文中进行了进一步梳理紫外线是引起DNA损伤常见的物理因素。根据日光中紫外线波长的不同，可将其分为3种：UVA(315—400nm)、UVB(280—315nm)和UVC(200—280nm)。其中UVC较前两者造成的DNA损伤重一些。过量的紫外线照射皮肤可诱发皮肤癌。近日节律广泛存在于生物体内，其周期在24小时左右，故称为近日节律(circadian rhythm)。人体的许多生理、生化参数均有近日节律的特点，如睡眠一觉醒、体温、血压、心率等，均表现出明显的近日节律。Period2是近日节律基因家族的重要一员。研究发现，Period2和肿瘤的发生发展有密切的关系。本实验室发现，Period2过表达能够减轻γ射线对细胞的损伤作用，降低细胞对γ射线的敏感性。紫外线也能够引起细胞的损伤，其机制可能与γ射线引起DNA破坏类似。据此推测，Period2基因可能在紫外线引起细胞损伤方面有一定的作用。本文首先诱导体外培养的细胞产生近日节律，在Period2表达处于峰值和谷值的时候给与紫外线照射。流式细胞术、克隆形成实验和彗星电泳实验的结果发现，不同组细胞的凋亡率、细胞周期分布和细胞的生长能力具有显着性的差异。然后，将Period2真核表达质粒转染入体外培养细胞中，增加细胞的Period2表达。发现Period2高表达的细胞与对照组细胞相比，紫外线引起的凋亡率、细胞周期分布和细胞的生长能力改变具有显着性的差异。紫外线照射可引起DNA的单链断裂、双链断裂及环丁烷嘧啶二聚体形成，这种损伤可经DNA修复系统进行修复。通过彗星实验，提示Period2基因过表达有抑制紫外线DNA损伤并促进DNA修复的作用。
冯倩华[6]2018年在《基于刺激响应型介孔纳米材料的抗肿瘤药物递送系统的基础研究》文中提出纳米药物递送系统以其肿瘤定位、高效低毒、缓控释放药物的优势在临床应用中具有很大的潜力,目前已成为肿瘤的预防、诊断、治疗和监控研究的热点。基于纳米材料的某些物理或化学特性所发展起来的肿瘤新型治疗模式(光热治疗、光动力学治疗、磁热治疗等)为肿瘤治疗提供了新的策略。利用物理刺激响应的纳米材料作为药物载体,在材料表面修饰靶向分子或对物理刺激响应的门控元件,可用于药物的靶向递送、智能控释和多机制诊疗。本文构建了一系列刺激响应型介孔纳米药物递送系统,开展了系列基础研究:1.近红外光触发的中空介孔硫化铜纳米粒介导的肿瘤诊疗系统的研究化疗药物阿霉素(DOX)对肿瘤特异性差,且易产生耐药性,降低了治疗指数。本研究构建了近红外光触发的“智能门控”型中空介孔硫化铜纳米粒介导的肿瘤诊疗一体化系统(DOX/HMCu2-xS-HA)。HMCu2-xSNPs(0<x<1)作为一种新型的近红外光响应型材料,在近红外光(NIR)照射下可产热和活性氧,同时进行光热治疗(PTT)、光动力学治疗(PDT)及光声成像(PAT)。另外,HMCu2-xSNPs的中空空腔和孔道结构均可荷载客体物质,比表面积大,对DOX的负载能力强。HMCu2-xS NPs外部所修饰的透明质酸(HA)可以同时作为靶向分子和盖帽剂,有效防止HMCu2-xSNPs内部客分子在体循环过程中泄漏并主动靶向定位至肿瘤部位。体外释药结果表明制剂需经透明质酸酶降解后,在酸性pH和NIR触发下促进DOX的释放,实现靶向多刺激响应型门控释药。细胞摄取实验表明,DOX/HMCu2-xS-HA纳米粒表面的HA可以促使载药系统经CD44受体介导的内吞作用主动靶向进入肿瘤细胞中。体内光声成像结果表明HMCu2-xS-HA在NIR照射下于肿瘤组织部位出现光声信号,且在给药3h左右信号达到最高峰。故HMCu2-xSNPs可成为一种优良的光声成像造影剂,可用来准确定位肿瘤部位/大小/形态来引导肿瘤治疗。体内抗肿瘤活性研究中DOX/HMCu2-xS-HA组在NIR照射下将相对瘤体积大幅度降低至0.94 ± 0.11,实现了肿瘤靶向的光疗(PTT&PDT)与化疗的协同治疗,具有显着的抗肿瘤治疗效果。2.中空介孔硫化铜介导的铜螯合剂抗癌药物递药体系的构建及评价铜离子依赖型抗癌药物博来霉素(BLM)的抗癌作用主要有赖于过渡金属和O2等的存在下形成BLM-Cu(Ⅰ)-O2,即“激活态BLM”。药物载体中空介孔硫化铜HMCu2-xNPs(0<x<1)在高热下因溶度积(Ksp)增大将导致少量铜离子(Cu(Ⅰ)和Cu(Ⅱ))的释放。本课题将铜离子依赖的BLM负载入HMCu2-xSNPs中,在光热效应下形成BLM-Cu(Ⅱ)复合物,构建近红外光远程调控的铜离子依赖型化疗&光疗纳米平台。温度响应型相转变材料薄荷醇(LM)可作为一种门控分子将BLM包封在纳米粒内部,实现了药物“零泄漏”。首先合成HMCu2-xNPs作为药物载体,通过酰胺键反应在其表面修饰上肿瘤靶向分子叶酸(FA),之后共负载LM与BLM。该递药系统(FA-HMCu2-xS/BLM/LM)通过叶酸受体介导的内吞作用靶向到肿瘤组织。在NIR照射下,HMCu2-xSNPs可以同时进行光热治疗与光动力学治疗。随后,FA-HMCu2-xS导致的高热及活性氧导致溶酶体破裂,使得客分子从溶酶体向细胞质中分布。体内外抗肿瘤实验结果表明FA-HMCu2-xS/BLM/LM具有很好的细胞杀伤作用,在NIR照射下将荷瘤裸鼠的相对瘤体积大幅度降低至0.35 ± 0.12。这是由于NIR下铜离子(Cu(Ⅰ)和Cu(Ⅱ))与铜离子依赖的化疗药物BLM从FA-HMCu2-xS中同时释放、络合形成“激活态BLM”,进一步导致铜离子依赖的BLM介导的DNA断裂,显着增强了抗肿瘤治疗效果。该纳米药物递送系统实现了肿瘤靶向的光疗(PTT&PDT)与化疗的协同治疗,在药物控释及肿瘤治疗中具有重要意义和价值。3.pH/超声双响应型药物递送系统的构建及其空化-声疗特性的研究本课题中我们发现介孔碳酸钙纳米粒(MCCNPs)在肿瘤酸性pH环境和超声的内外双刺激下可以瞬时崩解。利用此性质,以MCCNPs为基体构建了pH/超声双响应型药物递送系统,在MCC NPs内部负载声敏剂血卟啉单甲醚(HMME),外部通过酰胺键反应修饰透明质酸(HA)作为肿瘤靶向分子和门控元件。该递药系统(HMME/MCC-HA)通过CD44受体介导的内吞作用被肿瘤细胞摄取。MCCNPs在肿瘤弱酸性环境和外界超声刺激下瞬时崩解,同时伴随大量CO2产生和HMME释放。随后,由于酸性溶酶体内H+消耗等原因导致渗透压升高,最终诱导溶酶体破裂,促进客分子向细胞质中分布。体内抗肿瘤活性研究中HMME/MCC-HA组在超声辐照下将荷瘤裸鼠的相对肿瘤体积大幅度降低至0.87±0.13,显着增强了抗肿瘤治疗效果。一方面,超声下大量C02气泡的产生和爆破产生了空化作用诱导细胞损伤和坏死,并通过旁观者效应造成周围血管损伤。另一方面,超声下声敏剂HMME产生ROS进行声动力学治疗(SDT)诱导细胞凋亡。因此,HMME/MCC-HA可以实现空化治疗和声疗的协同治疗,进行肿瘤同位点多机制治疗。更重要的是,由于该制剂具有肿瘤靶向性,且正常组织缺乏酸性环境和外界超声刺激,故可极大降低对正常组织的毒副作用。另外,MCCNPs在肿瘤弱酸性环境下的优异的超声造影能力可对肿瘤组织定位,实现诊疗一体化。
梁桂霞[7]2014年在《喹恶啉类对大肠杆菌DNA损伤的机制研究》文中研究指明喹恶啉类化合物(Quinoxalines)为人工合成的一类抗菌药,均属喹嗯啉-1,4-二氧化物的衍生物,主要代表药物有卡巴氧(Carbadox, CBX)、喹乙醇(Olaquindox, OLA)、乙酰甲喹(Mequindox, MEQ)、喹烯酮(Quinocetone, QCT)和喹赛多(Cyadox, CYA)。其中前四种为20世纪合成的化合物,喹赛多为后来研发的喹嗯啉类新品种,具有抗菌促生长作用显着、毒副作用低、使用范围广的优点而受到广泛关注。本实验室通过对喹赛多的体外抑菌试验和抗菌机理的研究,表明喹赛多具有较强的抑菌作用和与喹恶啉类的其他药物一样具有相似的损伤细菌DNA的作用。但是关于喹恶啉类化合物损伤DNA的明确的抗菌作用机制至今未得到很好的揭示。本课题选取喹恶啉类中的喹赛多和喹乙醇为代表,及对其敏感的大肠杆菌为研究对象,从喹赛多和喹乙醇对DNA的直接作用和对DNA合成和修复有关的酶两方面进行药物作用机理的研究。菌体内外观察药物对DNA直接作用的损伤情况,并选取与DNA合成和修复过程有关的一些关键酶：E.coli DNA拓扑异构酶Ⅰ、E.coli DNA旋转酶、E.coli DNA聚合酶和E.coli DNA连接酶为研究对象,体外借助凝胶电泳检测和荧光检测技术考察喹恶啉类对细菌DNA损伤的机制进行研究。1.喹恶啉类药物MIC和MBC的测定本实验选用鸡源大肠杆菌CVCC2943,分别在厌氧和有氧条件下检测该菌株对喹赛多、喹乙醇、卡巴氧、乙酰甲喹的敏感性。实验采用微量肉汤稀释法检测药物对大肠杆菌CVCC2943的最小抑菌浓度(MIC)以及最小杀菌浓度(MBC)。结果测得喹赛多在厌氧条件下的MIC值为1μg/mL,MBC值为4μg/mL,有氧条件下MIC值为16μg/mL,MBC值为128μg/mL;喹乙醇在厌氧条件下MIC值为4μg/mL,MBC值为16μg/mL,有氧条件下MIC值为16μg/mL,MBC值为128μg/mL；卡巴氧在厌氧条件下MIC值为0.25μg/mL,MBC值为1μg/mL,有氧条件下MIC值为2μg/mL;乙酰甲喹在厌氧条件下MIC值为0.5μg/mL,MBC值为2μg/mL,有氧条件下MIC值为2μg/mL,MBC值为16μg/mL。从结果中可看出喹赛多和喹曝啉类的其他药物一样具有很好的厌氧选择活性。由于喹赛多低毒、低残留的特点,并且为新研发的喹嗯啉类药物,喹乙醇为已有的喹噫啉类药物,其抗菌作用的具体机理的研究也没有相关报道,结合本实验室对喹乙醇的已有研究,所以本课题选择喹赛多和喹乙醇为代表来研究喹嗯啉类致细菌DNA损伤的机制。2.喹赛多和喹乙醇对DNA损伤的直接作用研究以往对喹嗯啉类抗菌作用机制的研究多采用同位素标记和电子显微镜观察核酸的变化,本实验采用凝胶电泳检测DNA的损伤,分为药物体外对pBR322质粒DNA的作用和将药物与细菌一起孵育后提取质粒DNA,观察药物对DNA的损伤情况。体外分为有氧和厌氧两种条件,厌氧条件下又分为将药物直接与DNA作用和药物在黄嘌呤氧化酶的代谢下与DNA作用。结果表明无论在有氧还是厌氧下,药物不经黄嘌呤氧化酶代谢均不能使DNA发生断裂。厌氧下喹赛多和喹乙醇经黄嘌呤氧化酶还原可使DNA发生明显的断裂,使DNA发生明显断裂的终浓度均为8μg/mL,当共同孵育30min时,DNA有轻微的断裂,孵育1小时后,DNA就有明显的损伤。体外检测说明喹赛多和喹乙醇经代谢后可直接损伤DNA。体内首先将质粒pBR322转入到细菌中,再与药物一起孵育后提取质粒DNA,结果揭示当喹赛多浓度为4μg/mL时,对细菌体内的质粒DNA有轻微的降解,随着药物浓度的增加,降解的程度增强,当喹赛多浓度为16μg/mL时,菌体质粒DNA发生明显的降解。而喹乙醇作用组当浓度为32μg/mL时,对细菌体内的质粒DNA有轻微的降解,并且随着喹乙醇浓度的增加,质粒DNA损伤的程度并无太大的变化。3.喹赛多和喹乙醇对DNA合成和修复酶的影响实验分别采用凝胶电泳检测和荧光信号强度的变化来检测喹赛多和喹乙醇两种药物对E.coli DNA拓扑异构酶Ⅰ、旋转酶、聚合酶和连接酶活性的影响。前两种酶通过它们各自对超螺旋DNA的解旋作用来作为酶活性的检测指标,后两种酶通过对荧光强度的变化计算各自的反应初速度这一动力学参数来作为它们的活性指标。对拓扑异构酶和旋转酶的检测以超螺旋pBR322 DNA为研究对象,结果显示无论是药物直接与两种酶反应还是药物在代谢酶的作用下与两种酶反应,两种酶均不能对各自的底物DNA进行解旋,说明喹赛多和喹乙醇对E.coli DNA拓扑异构酶I和旋转酶的活性没有抑制作用,药物并不是通过抑制两种酶的活性来阻碍DNA的合成。对E.coli DNA聚合酶和连接酶活性的检测是通过反应初速度的变化来判断,结果表明喹赛多和喹乙醇无论是直接与DNA聚合酶反应还是在代谢后与该酶反应,聚合酶催化的DNA聚合反应的初速度有明显的下降,说明药物对聚合酶的活性有明显的抑制作用,并且随药物浓度的增加抑制作用增强,药物作用30min便可产生抑制。脱一氧喹赛多和脱二氧喹赛多对聚合酶活性的影响,结果显示当在N1位脱去氧原子时,聚合酶催化的聚合反应初速度有明显的下降,但当N4位脱去氧原子或NI位和N4位均脱氧时,聚合酶催化的聚合反应初速度无明显变化。说明N1脱一氧喹赛多也可抑制聚合酶的活性。两种药物直接与连接酶反应后可对该酶催化的DNA连接反应的初速度产生一定的下降作用,但当药物代谢后对该酶催化的连接反应的初速度无明显变化,说明药物原型也可对连接酶的活性产生抑制。由此可得出喹赛多和喹乙醇在黄嘌呤、黄嘌呤氧化酶还原体系下经还原代谢直接损伤DNA。喹赛多和喹乙醇对DNA损伤的另一途径是两种药物原型可直接对DNA聚合酶和连接酶的活性产生抑制,而这两种酶在DNA的合成、修复和重组中是不可缺少的酶,因此最终造成DNA产生损伤。喹赛多和喹乙醇经还原代谢后也可对聚合酶的聚合反应初速度产生影响,结合对喹赛多N1位脱氧后对聚合酶的影响,说明喹赛多代谢后产生的N1位脱氧喹赛多可抑制聚合酶的活性,但是N4位脱氧喹赛多和脱二氧喹赛多不能抑制聚合酶的活性,并且两种药物代谢后对连接酶的活性也不能产生抑制。
向德兵[8]2007年在《Ad5/F35重组腺病毒介导APE1 siRNA增强大肠癌放化疗敏感性的实验研究》文中提出大肠癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,其发病率呈上升趋势,易于发生局部淋巴结和远处转移,目前主要采取以手术和放、化疗为主的综合治疗,但是临床上多数肿瘤的放、化疗疗效较低,且同样治疗条件下,不同肿瘤患者即使肿瘤类型、病理分级、部位等都相同,治疗效果也存在较大差异,表明肿瘤细胞的内在放、化疗敏感性(intrinsic chemoradiotherapy sensitivity)有显着不同。DNA损伤修复系统作为机体抵抗各种损伤的分子基础,对于维护基因组的稳定与完整起着至关重要的作用,然而对于通过损伤DNA杀死癌细胞的放、化疗,这一过程无疑削弱了治疗效果。DNA损伤修复基因脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶(apurinic/ apyrimidinic endonuclease, APE1)具有核酸内切酶及氧化还原双功能,是细胞放射性损伤和基因毒性药物烷化剂致伤的重要修复因子,并通过氧化还原机制调节多种转录因子的DNA结合活性及下游靶基因表达,而这些转录因子与肿瘤放化疗抵抗密切相关。因此本研究以APE1为靶点,构建人APE1 siRNA重组腺病毒载体Ad5/F35-APE1 siRNA,研究其体内外对大肠癌细胞感染效率和对APE1基因表达的“敲除”作用,及其体内外增强大肠癌放化疗敏感性的作用及其分子机制。研究目的1.探讨APE1基因在大肠癌发生发展中的作用,以确证APE1为大肠癌治疗潜在的分子靶点;2.探讨以APE1为靶点的基因治疗在大肠癌治疗及放化疗增敏中的临床应用前景;3.探讨新型嵌合型腺病毒载体Ad5/F35在大肠癌基因治疗中的临床应用前景。研究内容和方法1. APE1在大肠癌组织表达及其临床意义:采用免疫组化方法检测大肠癌组织APE1蛋白表达,分析APE1表达与大肠癌临床病理因素的关系,为进一步以APE1为靶点的基因治疗提供临床病理基础。2. Ad5/F35-APE1 siRNA重组腺病毒构建及鉴定:选用新型嵌合型腺病毒Ad5/F35为载体,首先设计合成APE1 siRNA cDNA序列与线性化pDC316-U6-EGFP质粒连接后构建腺病毒穿梭载体pDC316-EGFP-U6-APE1 siRNA,经测序鉴定确认,与骨架质粒pBHG35共转染293细胞,同源重组产生重组腺病毒Ad5/F35-APE1 siRNA,经PCR鉴定毒种正确后大量扩增纯化,TCID50法测定腺病毒滴度。采用流式细胞术检测Ad5/F35-APE1 siRNA对大肠癌细胞感染效率;Western blot和免疫组化检测其对大肠癌细胞APE1基因的沉默作用;采用[γ-32P]ATP标记寡核苷酸法检测AP内切酶活性。3. Ad5/F35-APE1 siRNA重组腺病毒增强大肠癌放疗敏感性的实验研究:分别采用经典的克隆形成分析和裸鼠移植瘤模型检测大肠癌LOVO细胞体内外的放射效应;碱性彗星分析法检测DNA损伤;TUNEL法检测LOVO细胞凋亡;Western blot和免疫荧光染色检测APE1蛋白表达;凝胶迁移法(EMSA)测定NF-κB的DNA结合活性。4. Ad5/F35-APE1 siRNA重组腺病毒增强大肠癌5-FU化疗敏感性的实验研究:MTT法检测不同剂量5-FU作用LOVO细胞存活率的改变;TUNEL法检测LOVO细胞凋亡;Western blot和免疫荧光染色检测APE1蛋白表达; EMSA测定NF-κB的DNA结合活性。研究结果1. APE1在大肠癌组织表达及其临床意义:正常大肠粘膜APE1呈胞核阳性表达。大肠腺瘤和大肠癌组织APE 1表达特征发生改变,呈胞核表达、单纯胞浆表达或核浆共同表达,大肠癌组织APE1胞浆异位表达率为73.6%,大肠腺瘤APE1胞浆异位表达率为83.3%,二者无显着性统计学差异,但均显着高于癌旁大肠粘膜和正常大肠粘膜(P<0.01)。大肠癌组织APE1胞浆异位表达率与临床分期和淋巴结转移有关。2. Ad5/F35-APE1 siRNA构建及鉴定:分别通过测序分析和PCR鉴定腺病毒穿梭载体pDC316-EGFP-U6-APE1siRNA和腺病毒载体Ad5/F35-APE1 siRNA正确,成功构建了APE1 siRNA腺病毒表达载体Ad5/F35-APE1 siRNA,滴度达1.6×1010 IU/mL。Ad5/F35腺病毒对大肠癌细胞的感染效率显着高于Ad5型腺病毒,20 MOI的Ad5/F35-EGFP和Ad5/F35-APE1 siRNA腺病毒对LOVO细胞的感染效率可达99%,而20 MOI的Ad5-EGFP对LOVO细胞的感染效率只有15%左右;体内研究发现,5×108 IU的Ad5-EGFP、Ad5/F35-EGFP、Ad5/F35-APE1 siRNA腺病毒裸鼠移植瘤瘤内局部注射3 d后,Ad5/F35-EGFP和Ad5/F35-APE1 siRNA腺病毒组可见大量EGFP阳性细胞,而Ad5-EGFP腺病毒组可见少量EGFP阳性细胞。Ad5/F35-APE1 siRNA能显着抑制大肠癌细胞APE1蛋白表达和AP内切酶活性,且呈剂量依赖性。3. Ad5/F35-APE1 siRNA增强大肠癌放疗敏感性的实验研究:Ad5/F35-APE1 siRNA显着增强大肠癌LOVO细胞体内外的放射敏感性。体外实验结果显示Ad5/F35-APE1 siRNA的放射增敏比分别为:SER(D0)为1.23,SER(Dq)为5.75;且Ad5/F35-APE1 siRNA加强放疗诱导的LOVO细胞凋亡。碱性彗星分析结果显示Ad5/F35-APE1 siRNA抑制放疗后大肠癌细胞DNA修复能力。体内实验结果显示Ad5/F35-APE1 siRNA放疗组肿瘤生长较Ad5/F35-EGFP放疗组明显被抑制,单纯Ad5/F35-APE1 siRNA组肿瘤抑制率为15.06%,对照Ad5/F35-EGFP放疗组肿瘤抑制率为41.41%,Ad5/F35-APE1 siRNA放疗组肿瘤抑制率为70.90%。放疗呈剂量依赖性诱导LOVO细胞APE1蛋白表达增强,同时伴有NF-κB的DNA结合活性增强,Ad5/F35-APE1 siRNA抑制LOVO细胞NF-κB组成性和放疗诱导的激活。4. Ad5/F35-APE1 siRNA重组腺病毒增强大肠癌5-FU化疗敏感性的实验研究:感染Ad5/F35-APE1 siRNA腺病毒比感染对照腺病毒的LOVO细胞对5-FU的敏感性明显增强,IC50分别为1.69μM和7.04μM;且Ad5/F35-APE1 siRNA加强5-FU诱导的LOVO细胞凋亡。5-FU呈剂量依赖性诱导LOVO细胞APE1蛋白表达增强,同时伴有NF-κB的DNA结合活性增强,Ad5/F35-APE1 siRNA抑制LOVO细胞5-FU诱导的APE1蛋白表达以及NF-κB组成性和5-FU诱导的激活。结论1. APE1胞浆异位表达可能与大肠癌的发生、侵袭和转移有关,APE1是大肠癌治疗潜在的分子靶点,具有重要的临床应用价值。2. Ad5/F35腺病毒对大肠癌细胞的感染效率显着高于Ad5型腺病毒,更适用于大肠癌的基因治疗。3.放疗和5-FU呈剂量依赖性诱导大肠癌细胞APE1蛋白表达增强,同时伴有NF-κB的DNA结合活性增强,Ad5/F35-APE1 siRNA抑制放疗和5-FU诱导的APE1表达和NF-κB激活,APE1可能在肿瘤放化疗抵抗中起重要作用。4. Ad5/F35-APE1 siRNA可特异性沉默大肠癌细胞APE1蛋白表达,沉默效率达到95%。5.以APE1为靶点的基因治疗体内外显着增强大肠癌细胞放射敏感性,主要是通过2种机制实现的,一方面通过抑制大肠癌细胞放疗后的亚致死损伤修复能力;另一方面通过抑制NF-κB等放疗抵抗有关的转录因子活性。6.以APE1为靶点的基因治疗体外显着增强大肠癌细胞5-FU化疗敏感性,其机制可能主要是通过抑制大肠癌细胞碱基切除修复和NF-κB等放疗抵抗有关的转录因子活性。
欧阳思维[9]2014年在《组蛋白泛素化和乙酰化修饰在DNA损伤修复中作用的研究》文中认为目的:神经退行性变是由大脑和脊髓的神经元的进行性丧失引起的。它随着时间的推移而恶化,可导致多种神经功能障碍。DNA损伤修复失败会导致细胞凋亡或基因突变,已发现多种DNA损伤修复相关蛋白的缺失可导致神经退行性病变。RNF8是一个含有485个氨基酸的核多肽,其C末端的RING结构域使得RNF8具有E3泛素连接酶活性,而其N末端的FHA结构域在DNA损伤修复中扮演着重要的角色。泛素连接酶RNF8通过泛素化组蛋白参与DNA双链断裂(DSBs)损伤修复,但RNF8缺陷是否能导致神经退行性病变还不得而知。本研究的目的就是通过对RNF8基因敲除小鼠的研究明确RNF8是否参与神经元的DNA双链断裂损伤修复以及在神经退行性病变中的作用;明确RNF8基因敲除小鼠是否存在脑的高级功能异常。方法:杂交RNF8+/-小鼠获得的小鼠提取基因组DNA,通过PCR技术鉴定基因型,将同窝WT小鼠和RNF8-/-小鼠作为对照,监测小鼠从1月龄至12月龄的体重并记录。4月龄小鼠分为两组,一组未做任何处理,另一组IR(2Gy)处理小鼠6hr后,一部分小鼠灌注固定,小鼠脑冰冻切片;另一部分取小鼠大脑皮层和海马提取组蛋白。通过免疫荧光染色检测γ-H2AX、MDC1、53BP1和BRCA1在神经元内的表达水平。通过RNA干扰技术敲除HT22细胞的RNF8。Western Blots检测ub-H2A和ub-H2B在WT和RNF8-/-小鼠、HT22细胞和MEF细胞中的表达水平。通过中性单细胞凝胶电泳检测DNA双链断裂损伤。通过免疫组化染色技术检测GFAP的表达水平。通过Fluoro-Jade C染色检测变性神经元。通过TUNEL染色检测神经元凋亡。通过焦油紫染色和银染检测神经形态学变化。小鼠分为两组,一组未做任何处理,另一组IR(2Gy)处理。继续饲养数月。处理前,用开场探索实验和跳台逃避实验检测小鼠神经功能变化。结果:RNF8-/-小鼠体重低于同窝野生型小鼠,其体型较小,发育迟缓。出现过早死亡和对辐射敏感。除此之外,RNF8基因敲除小鼠还表现为毛发无光泽,行动迟缓,身体运动能力和协调能力下降。免疫荧光染色结果显示,IR(2Gy)诱导损伤后,γ-H2AX、MDC1表达,而53BP1和BRCA1在RNF8-/-小鼠神经元不表达。Western Blots结果显示,IR(2Gy)诱导损伤后,RNF8-/-小鼠、HT22细胞和MEF细胞中ub-H2A和ub-H2B表达水平上调无差异。中性单细胞凝胶电泳结果显示,IR(2Gy)处理后,RNF8-/-小鼠神经元的慧尾含量(Tail DNA%,TDNA%)、彗星尾距(Tail Moment,TM)变化有差异(P<0.05),Olive 尾距(Olive Tail Moment,OTM)的变化有显着性差异(P<0.01)。免疫组化的结果显示,RNF8-/-小鼠大脑GFAP表达在IR(2Gy)处理前后增加有显着性差异。Fluoro-Jade C染色结果显示,RNF8-/-小鼠出现零星的变性神经元,IR(2Gy)处理后,变性神经元增加较WT小鼠明显(P<0.01)。TUNEL染色结果显示,RNF8-/-小鼠出现凋亡细胞,IR(2Gy)处理后,凋亡细胞增加较WT组明显(P<0.01)。焦油紫染色结果显示,IR(2Gy)处理后,在RNF8-/-小鼠大脑皮层椎体细胞数量显着减少(P<0.05);RNF8-/-小鼠大脑皮层和海马核固缩、空泡、核边集和嗜神经现象多见。银染可见,在RNF8-/-小鼠大脑中发现零星分布的染色较深、形态不规则的神经元分布于海马周围。IR(2Gy)处理后,RNF8-/-小鼠异常神经元增加显着(P<0.01),大脑皮层和海马神经元轴突变性多见,出现明显的螺旋状扭曲、肿胀,甚至断裂;且RNF8-/-小鼠多见海马周围颗粒状物质围绕染色较深的斑块和一些轴突、树突明显但核区染色不明显的神经元。开场探索实验结果显示,IR(2Gy)处理后2个月和4个月,RNF8-/-小鼠水平活动能力下降有显着性(P<0.05);照射后6个月显着下降(P<0.01)。RNF8-/-小鼠照射后2个月和6个月,中央区域停留时间较照射前有显着变化(P<0.01);照射后4个月,RNF8-/-小鼠中央区域停留时间变化有显着性(P<0.05)。跳台逃避实验显示,IR(2Gy)处理后3个月,RNF8-/-小鼠潜伏期缩短,错误次数增加有显着性(P<0.05),照射后6个月,RNF8-/-小鼠潜伏期和错误次数显着变化(P<0.01)。结论:RNF8介导组蛋白泛素化参与DSBs修复,对维持神经元基因完整性至关重要。RNF8缺陷导致RNF8-/-小鼠神经细胞DNA损伤修复能力下降,更容易通过DNA损伤诱导细胞凋亡。RNF8-/-小鼠出现神经病理现象,其认知能力、活动能力、探索能力和记忆力均下降。目的组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACIs)是一类通过促进肿瘤细胞分化、诱导其凋亡的抗增殖剂。丙戊酸(VPA)是HDACIs的一种,曾被广泛用于抗惊厥,而近年来研究发现它还作为DNA修复抑制剂作用于肿瘤细胞。此研究的目的是确定VPA在治疗膀胱癌中的治疗效果;探寻在膀胱癌细胞中,VPA是否能介导抑制细胞的生长和诱导凋亡。此外,通过与丝裂霉素C(MMC)、顺铂(DDP)和阿霉素(ADM)联合使用,检测VPA与DNA损伤药物的协同效应。方法3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑嗅盐(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MMT)法检测丙戊酸对T24、BIU87、5637细胞的增殖的抑制作用。赫斯特(Hoechst)33258染色被用来检测VPA处理后膀胱癌细胞的形态学变化。MTT法分析丙戊酸与DNA损伤药物DDP、MMC和ADM的协同效应。流式细胞术检测VPA和或DDP处理72hr后对膀胱肿瘤细胞的生长抑制和调亡的诱导作用。Western Blots检测T24、BIU87、5637细胞中存活素和组蛋白H3乙酰化的表达水平。膀胱灌注N-甲基亚硝基脲(N-methyl-N-nitrosourea,MNU)诱导建立膀胱癌模型,HE染色检测VPA和或DDP的抑制作用。结果丙戊酸可以明显抑制T24、BIU87、5637细胞的增殖,细胞生长的抑制作用随药物浓度增加、作用时间延长而增强。Hoechst 33258染色显示,正常细胞的细胞核呈弥散的荧光分布,而凋亡细胞的细胞核呈现出高度密集的颗粒状荧光。通过VPA和VPA+DDP处理后的细胞出现大量细胞凋亡。MTT分析结果显示了VPA和DNA损伤药物DDP、MMC和ADM对抑制膀胱癌细胞的协同效应,其协同系数CDI均小于1。通过流式细胞术,Annexin V和PI双染检测经过VPA、DDP和VPA+DDP处理72hr后,凋亡细胞比例增加而活细胞比例显着降低。Western Blots结果显示,VPA抑制T24细胞中存活素的表达,使组蛋白H3乙酰化的表达显着上调。膀胱灌注VPA可抑制膀胱癌的发展(P<0.05)。膀胱灌注VPA+DDP治疗膀胱癌效果显着(PC0.01)。结论VPA表现出抗增殖活性,且在人膀胱癌细胞中有力的诱导凋亡,但没有明显的不良副作用。此外,VPA能使存活素表达下调,增加膀胱癌对DNA损伤药物的敏感性。膀胱内使用VPA或VPA与DDP联合使用能够阻止大鼠的MNU诱导膀胱癌的肿瘤进展。这些发现可能证明VPA与DNA损伤药物联合使用能有效提高膀胱癌的治疗。
魏莉[10]2005年在《ATM基因siRNA真核表达载体的构建及其对宫颈癌放疗增敏作用的实验研究》文中研究说明毛细血管扩张-共济失调突变基因(ataxia-telangiectasia mutated,ATM)是近年来发现的在细胞DNA双链损伤修复时具有启动效应的基因,其编码的ATM蛋白属于磷脂酰肌醇(-3)激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,Pl3K)家族。ATM蛋白是一种重要的细胞周期检验点激酶,参与磷酸化并激活、调控多种参与细胞周期调控和DNA损伤修复的蛋白,这些蛋白包括BRCA1、p53,细胞周期检验点激酶Chk2,细胞周期检验点蛋白RAD17、RAD9以及DNA修复蛋白NBSl等。在细胞DNA双链受损时,这些蛋白被ATM蛋白磷酸化,是激活细胞周期调控程序、启动细胞DNA修复以及维持染色体的稳定性所必须的。研究还发现ATM蛋白具有抑制细胞凋亡发生的重要功能。因此ATM是细胞受到DNA双链损伤时的重要调控因子。此外,已有研究证实ATM基因有明确的辐射保护作用,对ATM基因的灭活将去除其对细胞的保护作用,提高细胞对辐射的敏感性。综上所述,抑制或敲除ATM基因在肿瘤基因治疗中有重要意义。 RNA干扰(RNA interference,RNAi)是一种广泛存在于高等植物和动物中的由双链RNA介导的、序列特异的同源基因转录后基因沉寂(PTGS)现象。一般认为:RNAi效应作用机制是由含19-23个核苷酸对的小RNA片段,
参考文献：
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