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【摘 要】阿尔茨海默病（AD）的发病机制十分复杂，对于AD发病机制尚未有定论。近年来，有研究指出中枢炎症可能是AD病因中的重要机制之一。本研究采用一种广为使用的AD动物模型—APP/PS1双转基因小鼠，通过考察其大脑皮层内的炎性因子IL-1β、IL-6的含量变化，以及小胶质细胞的激活状态，研究该痴呆模型小鼠学习记忆障碍的中枢炎症机制。研究结果表明，与空白小鼠相比，在新物体识别实验中，模型组APP/PS1小鼠出现学习记忆障碍，在一定程度上模拟了阿尔茨海默病的症状。在模型组APP/PS1小鼠大脑皮层的炎症因子IL-1β，IL-6水平显著升高。模型小鼠大脑皮层小胶质细胞活化标志物CD11b的表达显著增加。
【关键词】阿尔茨海默病；APP/PS1；炎症
1.研究背景
阿尔茨海默病（英文：Alzheimer’s Disease，简称：AD，拉丁语：Morbus Alzheimer）是一种发病进程缓慢、随着时间不断恶化的持续性神经功能障碍。主要表现为渐进性记忆障碍、认知功能障碍、人格改变及语言障碍等神经精神症状，严重影响社交、职业与生活功能。据统计，在我国60岁以上的老人约有1.29亿，占总人口的10.15%，这些老年人的AD患病率约6.5%，患病人数约600万。而85岁以上的老人患病率更是高达25%，这对于正在快速进入老龄化社会的中国，无疑是一项重大的考验。
阿尔茨海默病（AD）是一种常见的与年龄相关的精神疾病，是一种中枢神经系统（CNS）退行性疾病，特点是记忆力减退和多种认知障碍，一般确诊后3-9年导致患者死亡。AD病的发病机制十分复杂，现存的机制学说包括“Aβ级联假说”，“Tau蛋白学说”，“线粒体功能障碍学说”等等。然而，现存机制学说还难以解释AD的病因，开发合适的治疗AD药物还十分困难，因此，关于AD 病因的其他机制的研究十分重要。近年来，有报道指出中枢炎症损伤也可能在AD的病因中起重要作用。有研究认为，中枢神经系统中短期内，小胶质细胞激活后吞噬、降解Aβ。长期激活的小胶质细胞释放大量有破坏性的炎性细胞因子，造成中枢炎症。
中枢炎症与AD病因的关系到底是怎样的呢？本研究选取APP/PS1双转基因小鼠，研究AD病因中的中枢炎症机制。这种模型小鼠具有稳定的遗传背景，早发型老年痴呆的病理学症状，是过去十年间最广为使用的AD模型。在研究中，我们通过新物体识别实验（Novel Object Recognition，NOR）评估模型小鼠的学习记忆障碍，并通过ELISA测定痴呆小鼠大脑皮层炎性因子IL-1β及IL-6的含量，并进一步通过免疫组化的方法测定小胶质细胞激活标志物CD11b的表达以评估痴呆小鼠小胶质细胞的激活水平。
2.研究方法与过程
2.1 实验材料
2.1.1 实验动物
8月龄APP/PS1双转基因小鼠及同月龄C57BL/6J小鼠，由SPF级实验动物中心饲养，保持环境温度20-24℃，湿度50%-60%，自由摄食饮水，12小时循环光照。每次实验使用4只小鼠，为保证实验数据准确性和可靠性高，进行了2次实验，共使用8只小鼠，对实验数据和结果进行验证。
2.1.2实验试剂
水合氯醛，氯化钠，多聚甲醛，磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，小鼠 IL-1β Elisa kit，小鼠 IL-6 Elisa ki，中性树胶，大鼠抗小鼠CD11b抗体，大鼠二步法检测试剂盒，DAB显色试剂盒。
2.1.3 实验仪器
台式微量离心机：赛默飞世尔公司，LEGEND MICRO 21R；
多功能酶标仪：美国ThermoScientific公司，Varioskan Flash；
倒置荧光显微镜：日本奥林巴斯公司，IX71；
冰冻切片机（AS-620）：Thermo Shandon Limited Co.（United Kingdom）
2.2 实验方法
2.2.1新物体识别实验
实验装置为一木制的正方形开放场。新物体辨别实验均分为适应阶段和测试阶段，且实验中用到的物体均是动物未见过的。每次实验将4只小鼠放入开放场中适应环境3min，每天两次，进行2天。
测试当天，先将动物放入实验场中自由探索3 min再次适应环境。取出动物，将2个完全相同的物体（A1、A2）置于距边缘等距离的位置上。将小鼠置于距两物体相等的位置，记录5min内探索两物体的时间（tA1、tA2）。1h后，将其中一物体换成一个颜色、形状及材质均不相同的新物体（B），将小鼠再次放入，记录探索两物体所用时间（tA1、tB）。计算每部分实验的优先指数Preferential index。
优先指数计算公式如下：Preferential index（1h）=tB/（tA1+tB）*100%
2.2.2实验取材流程
小鼠首先进行行为学检测。新物体识别实验结束后，分为A、B两部分进行取材：
A、小鼠迅速断头取脑，置于用冰块保持低温的表面皿上，去除组织表面的血渍，迅速分离皮层，用液氮迅速冻存，置于-80℃冰箱备用，用于ELISA实验。
B、灌流：将小鼠腹腔注射3.5%水合氯醛麻醉，仰位固定于手术台上，开胸暴露心脏。将灌流穿刺针从心尖部位插入左心室，同时右心耳剪一小口，先用约200-300ml生理盐水灌流，待右心耳流出的液体变得无色澄清时，换用4℃，4%多聚甲醛缓冲液灌流，灌流后取脑，于4%多聚甲醛中固定，置于-80℃冰箱备用，用于免疫组织化学染色实验。
2.2.3酶联免疫吸附测定法（ELISA）
（1）组织处理
A.将组织样本用PBS（0.01M，PH7.4）冲洗，洗去组织表面残留的血液或杂质。
B.将组织块称重，记录后剪碎，便于匀浆得更充分
C.将组织按一定的比例加入预冷的PBS（临用前加入蛋白酶抑制剂），匀浆，匀浆时置于冰浴中。（按组织重量：PBS体积=1：9的比例匀浆，例如1g的组织样本对应9mL的PBS，具体体积根据实验需要适当调整，检测后计算样品浓度时乘以相应的稀释倍数）
D.吸取匀浆液到离心管，4℃ 5000×g 离心20min，取上清，用于后续测定。
（2）测试前，将所有试剂充分混匀，避免产生泡沫。
（3）根据试验孔（空白和标准品）数量，确定所需的板条数目，样品（含标准品）和空白都做2个复孔。
（4）加样：每孔加入100μl稀释后的Cytokine standard 至标准品孔，每孔加入100μl样品至样品孔，设置空白孔，用Dilution buffer R（1×）代替样品和标准品。
（5）加检测抗体：每孔加入50μl稀释后的Biotinylated antibody。混匀后，盖上封板膜，37℃温育90min。
（6）洗板：扣去孔内液体，每孔加入300μl 1× washing buffer；停留1min后弃去孔内液体。重复4次，每一次在滤纸上扣干。
（7）加酶：加酶：每孔加入100μl稀释后的Streptavidin-HRP。盖上封板膜，37℃温育30min。
（8）洗板：重复步骤5.
（9）显色：每孔加入100μl TMB，37℃避光温育10min 之间，根据孔内颜色的深浅（深蓝色）来判定终止反应。通常显色在10-20min可以达到很好的效果。
（10）终止反应：每孔迅速加入100μl Stop solution终止反应。
（11）读板：终止后10分钟内用检测波长450nm读值。
2.2.4免疫组织化学染色
（1）-80℃冰箱中取出后，用冰冻切片机进行切片，室温放置30min后，4 ℃丙酮固定10min，PBS冲洗三次，每次5min。
（2）滴加3%H2O2去离子水，以阻断内源性过氧化酶的活性，室温下湿盒中孵育10min，PBS冲洗三次，每次3min。
（3）10%山羊血清，37℃，孵育10min，只需轻甩去多余液体，1：100滴加CD11b一抗，4℃湿盒内过夜，PBS冲洗三次，每次5min。
（4）滴加检测试剂，37℃，孵育60min，PBS冲洗三次，每次5min。
（5）滴加新配制的DAB溶液，显微镜下观察，见切片中出现棕黄色显色，立即自来水冲洗，终止染色。
（6）苏木素溶液轻度复染15s，立即用自来水冲洗3min后，切片置1%盐酸乙醇中插提2-3次，自来水下冲洗6min。
（7）脱水、封片：75%、85%、90%和95%乙醇脱水3min，无水乙醇I、II中各浸泡5min，二甲苯I、II中各浸10-15min，中性树胶封片，显微镜下观察。
实验结果分析使用Image pro plus 6.0图像分析软件，对每张图片的IOD（积分光密度）进行统计分析。
2.3统计学方法
实验数据以均数±标准物（mean ±SEM）表示。采用SPSS 19.0 统计软件进行相关统计学分析，使用 t-test 进行比较。P< 0.05 则认为差异存在显著性意义。
3.研究结果与分析
3.1 分析APP/PS1痴呆模型小鼠新物体识别实验中优先指数的变化
实验结果表明，与空白组相比，APP/PS1痴呆模型小鼠测试阶段新物体的优先指数显著降低。
图 1：新物体识别实验中优先指数的变化
（n=8，mean ± SEM）。与空白组相比，**p<0.01。
3.2 分析APP/PS1痴呆小鼠大脑皮层炎性因子含量的变化
ELISA测定结果表明：与空白组相比，模型组小鼠大脑皮层炎症因子IL-1β、IL-6含量显著增加，出现中枢炎症症状。见下图：
图 3：小鼠大脑皮层中IL-1β含量的变化
（n=5，mean ± SEM）。与空白组相比，**p<0.01。
3.3 分析APP/PS1痴呆小鼠大脑皮层CD11b含量的变化
免疫组化染色结果表明，APP/PS1双转基因痴呆模型小鼠大脑皮层小胶质细胞活化标志物CD11b的表达显著增加。
图 6：小鼠大脑皮层中CD11b蛋白含量的变化（n=5，mean ± SEM）。与空白组相比，**p<0.01。
3.4实验结果
与空白小鼠对比，在新物体识别实验中，8月龄APP/PS1小鼠在新物体识别实验中优先指数降低，APP/PS1小鼠出现学习记忆障碍，在一定程度上模拟了阿尔茨海默病的症状。
与空白小鼠对比，在APP/PS1小鼠大脑皮层的炎症因子IL-1β，IL-6水平及CD11b的含量显著升高。
4 研究结论
综上所述，我们的研究结果显示，APP/PS1双转基因小鼠大脑皮层中小胶质细胞激活，释放大量的炎性因子如IL-1β和IL-6。大脑皮层中存在炎症反应，这可能是APP/PS1小鼠出现学习记忆障碍的机制之一。
参考文献：
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[2]朱丽娟，季雪莲，阿尔茨海默病的发病机制及其研究进展[J]，《医药》2016年第04月 20卷195-195页
[3] 郑达奇，阿尔茨海默病[J]，《医药》，2016年第01月 04卷 104-104
[4] 蔡志友、晏勇，小胶质细胞与阿尔茨海默病[J]，《生命科学》，2008年第1期 95-100页
论文作者:傅正一
论文发表刊物:《中国医学人文》(学术版)2018年7月上第13期
论文发表时间:2018/12/11
标签：小鼠论文; 大脑皮层论文; 物体论文; 炎症论文; 胶质论文; 阿尔论文; 模型论文; 《中国医学人文》(学术版)2018年7月上第13期论文;