李军勇[1]2001年在《蛋白质C端序列分析方法学研究》文中研究表明蛋白质序列分析是蛋白质化学研究中的核心技术。运用Edman降解进行蛋白质N端顺序测定已成为十分完善的技术，并已经实现了自动化。C端与N端一样，在蛋白质分子结构分析中具有重要的地位，对其顺序测定具有重要的意义，不仅可以对N端封闭的蛋白质进行序列测定，而且对基因克隆有指导意义。纵观蛋白质C端测序方法的发展，由于化学法中的(异)硫氰酸法反应机理与Edman降解十分类似，方法，所以是最有前景的方法。然而，由于C端羧基的化学性质不活泼，致使Schlack-Kumpf降解法的研究进展缓慢。但通过近十年的研究表明该方法是很有希望成为常规C端顺序测定的方法。同时近十年来随着质谱技术的发展，使得质谱在分析大分子化学物质成为可能后，在蛋白质顺序分析领域里取得了很多重要进展。 在蛋白质C端(异)硫氰酸法顺序测定技术中，标准氨基酸乙内酰硫脲(TH-AA)的制备是必须首先要解决的问题。本文以L-氨基酸为原料，采用乙酸酐作活化试剂，TMS-ITC作为偶联试剂，制备了19种TH-AA，另外TH-Pro的制备是用NH_4SCN作为偶联试剂获得成功的。反应产物通过RP-PHLC进行分离纯化，同时进一步用紫外光扫描进行鉴定。 (异)硫氰酸法又称为Schlack-Kumpf降解，本文在关键的偶联试剂方面进行了不懈的努力，先后对理论上有可能成为偶联试剂的四种化学试剂进行了摸索，最后确定了其中两种是可行的：(1)叁丁基硅异硫氰酸酯(TBuS-ITC)；(2)叁苯基锗异硫氰酸酯(TPGe-ITC)。以上两种偶联试剂都是本文作者合成，并得到了质谱验证。测序过程包括：(1)用乙酸酐活化蛋白质和多肽C端羧基，形成蛋白质和多肽恶唑烷酮衍生物；(2)与偶联试剂发生偶联反应，生成蛋白质和多肽异硫氰酸酯衍生物，然后环化形成蛋白质乙内酰硫脲衍生物；(3)用摘要裂解试刘裂解得到缩短了一个氨基酸残基的多肤和C端氨基酸乙内酞硫服。木文采用合成的1()肤(Nlx厂NYQKDALGFL一C00ll)和16肤(NI!2一K人KEsD人(;FLMFvYLv一eooll)为模型肤，并将其偶联到DITC玻璃珠上进行方法学研究。用TBus一1 Tc对10肤进行c端序列测定，成功地鉴定了其c端前4个氨基酸，初始回收率为53.106，重复回收率为5 7.6%。 利用偶联到川 Tc玻璃珠上的10肤，对TPGe一1 TC作偶联试剂的活化剂用量、活化时间、偶联温度和偶联时间进行了优化，确定了最佳反应条件。然后以16肤为模型肤用优化的条件进行c端序列分析，取得了较好的一试骑结果，鉴定了该肤c端前8个氨基酸，其初始回收率为6‘.4%，重复回收率为79.6%。
王宇恩[2]2003年在《C-端序列分析方法学研究与HWAP-Ⅰ生物活性方面的研究》文中研究说明蛋白质序列分析是蛋白质研究中的核心技术。N端测序已经成为十分完善的技术，并已经实现了自动化。C端与N端一样，在蛋白质分子结构分析中具有重要地位，不仅对N端封闭的蛋白质进行序列测定，而且对基因克隆具有指导意义。尽管Schlack-Kumpf降解法的研究进展缓慢，但是近十年研究表明该方法是很有希望成为C端顺序测定的常规方法。 在蛋白质C端(异)硫氰酸法顺序测定技术中，标准氨基酸乙内酰硫脲(TH-AA)的制备是必须首先要解决的问题。本文以L-型氨基酸为原料，采用乙酸酐做活化试剂，TBS-ITC为偶联试剂，制备了20种TH-AA，反应产物通过RP-HELC进行了分离纯化。 本文同时在偶联试剂方面进行了探索，采用合成的13肽(NH_2-KKESDFLMFVYLV-COOH)为模型肽，并偶联到DITC玻璃珠上进行了方法学研究。通过实验条件的优化对C-端序列分析的化学方法进行了微量化探索，在0.5nmol规模可获得叁个氨基酸C-端序列信号。改变偶联试剂的浓度发现在0.2mol／L可获得最佳的偶联效果。同时应用两种偶联试剂TBS-ITC和TPGe-ITC进行了C-端序列测定的比较，在1nmol规模上对模型肽前4个残基进行了序列分析。其中用TBS-ITC进行序列测定的初始回收率为60.8％，重复回收率为76.7％，用TPGe-ITC进行序列测定的初始回收率为68.8％，重复回收率为81.4％。结果证明TPGe-ITC比TBS-ITC是一种更好的偶联试剂。
高彦飞, 王红霞[3]2007年在《蛋白质及多肽C端测序的研究进展》文中研究指明C端序列是蛋白质和多肽的重要结构与功能部位,对蛋白质的生物功能甚至起决定性作用。另外,C端剪切也是蛋白质重要的翻译后修饰之一。随着蛋白质组学研究的不断深入,蛋白质C端测序对其功能研究将发挥越来越重要的作用。一些新的蛋白质C端测序方法已建立,提高了灵敏度和重复性,能够在蛋白质组水平应用。本文较系统地介绍了蛋白质C端测序3种方法:羧肽酶法、化学法及串联质谱法的原理、特点、应用及在蛋白质组学研究中的新进展。随着C端测序新方法的不断建立,将在蛋白质组研究中发挥更大的作用。
刘忞博[4]2013年在《基于生物质谱的蛋白质C末端肽段定性与定量新方法》文中进行了进一步梳理本论文主要针对蛋白质C末端进行了系统的研究。基于生物质谱技术,发展了一整套蛋白质C末端的富集、鉴定及相对定量的新技术及新方法,用于高效、准确地揭示蛋白质C末端多方面的生命信息,包括准确的C末端序列测定以及C末端肽段的相对定量,由此对蛋白质C末端在生命活动过程中所起的重要生物意义以及蛋白质降解过程有更好的认识。蛋白质的C末端在蛋白进行各项生命活动过程中都起着极其重要的作用。它不仅标志着DNA转录翻译成蛋白质过程的初步完成,更是参与和调控了蛋白质的各种生理功能。但是目前通过组学手段大规模的鉴定蛋白质C末端的方法仍然局限于经典的质谱鉴定策略,并没有一套完善的富集与鉴定蛋白C末端的方法。对于数据库内不存在的蛋白质新C末端的鉴定,以目前的鉴定方法仍然很难实现。所以在蛋白质C末端越来越受到人们重视的同时,目前也亟需在方法学上有进一步的突破。本论文结合恶唑酮化学,使蛋白质C末端可以特异性地带有标签,在此基础上发展了一系列的衍生化试剂,用于蛋白质C末端的富集、定性及相对定量,并且能够对生命体中内源性降解产生的新C末端进行鉴定甚至是De novo测序。此外,对于“自下而上”技术路线中一个关键的步骤---酶解的效率不够高的难题,发展了物理吸附型的酶解反应器并从原理上探讨了其工作机理。所以本论文致力于建立高效、实用的C末端新的分析策略,解决当今蛋白质C末端组学上面临的技术难题。本论文工作的主要成果和突出贡献如下：第一章绪论简要概述了基于大分子生物质谱的蛋白质组学研究对象及其研究意义。对于目前广泛使用的各种定性和定量技术及其中存在的主要问题作了基本的介绍。特别着重对提高酶解环节效率的固定化酶解反应器进行了详尽的描述。论文详细阐述了蛋白质C末端的研究意义以及在研究中所面临的主要困难,并按照各种富集鉴定方法所采用的原理进行了分类并一一作了归纳和总结。最后,提出了本论文选题的目的和意义所在。第二章针对蛋白质C末端难以通过传统的生物质谱鉴定方法确认和鉴定,并且无法在质谱中识别内源性新产生的蛋白质C末端的难题,发展了一种基于恶唑酮化学的同位素标记策略,实现在复杂的生物样品中同时进行蛋白质C末端的鉴定和相对定量。该方法结合了恶唑酮化学法和轻重双标的精氨酸同位素标记。通过恶唑酮反应,精氨酸特异性地与蛋白的α-羧基结合。将蛋白酶解之后,带有同位素标签的C末端肽段在质谱中会以对峰的形式呈现,从而与其他的酶解肽段区分开来。通过进一步的串联质谱分析,得到C末端肽段的序列信息。使用精氨酸作为衍生化试剂,可以增强C末端肽段的碱性,大大提高了肽段在质谱中的离子化效率。此外,轻重双标的同位素标记还可以实现蛋白C末端肽段的相对定量。当标有轻重同位素标记的样品混合后进行质谱分析,同位素峰的信号强度之比即代表了来源于不同样本之间C末端肽段的相对含量比例。通过标准肽段以及标准蛋白定量方法的检验,显示出该方法有着良好的动态线性范围。研究表明在2个数量级的范围内都保持一致的线性和很高的重现性。相关系数(R2)都在0.99以上,且变异常数(CV)控制在11%以内。随后该方法运用于腾冲嗜热菌的研究之中,用于考察在不同温度条件培养下的腾冲嗜热菌的蛋白C末端的表达水平的差异。共有68条C末端肽段被成功鉴定到,其中有53条在两个温度下的腾冲嗜热菌中都被鉴定到并有相对定量信息。在有表达差异的C末端肽段中,大部分都归属于各种酶蛋白,所以我们推想,温度确实是一个影响腾冲嗜热菌生物活性的重要因素。此外,该方法同样可以去寻找和验证生命体内的内源性新C末端(neo-C-termini).总共有24条非C末端肽段作为可能是内源性新产生的C末端肽段被成功鉴定。大部分都定位于完整蛋白的N末端或者C末端附近,说明了蛋白的N端和C端有着非常高的反应活性,在生命活动中也起着非常重要的作用。第叁章作为第二章工作的延续和深入,针对C末端肽段在整个样品中的相对含量较低,并且蛋白质丰度动态范围过大,不利于质谱鉴定等问题,发展了与目前应用的反向富集相反的正向富集策略。在恶唑酮化学的基础上,使一端连有生物素(biotin),一端连有精氨酸的双功能化试剂与蛋白的C末端特异性的结合。标记的蛋白在酶解后,通过链霉亲和素(streptavidin)与生物素之间的亲和作用,将C末端肽段进行特异性的富集。这样的富集策略,可以大大减少样品的复杂程度,提高C末端的鉴定效率以及鉴定通量。首先在标准肽段和标准蛋白层面上,对恶唑酮反应条件以及链霉亲和素富集的条件进行了摸索和优化,标记反应的效率能够提高到90%以上,并且富集的特异性也得到了保证,在标记肽段和非标记肽段1：50混合的情况下,仍然能够达到很好的富集效果。衍生化试剂中由于含有精氨酸,可以增强C末端肽段的碱性,这大大提高了肽段在质谱中的离子化效率。此外针对于标记肽段在二级谱图中一些特殊的碎裂结果,对蛋白数据库检索方式也进行了优化。标记上的精氨酸和生物素在二级质谱图中也会呈现出类似于b,y离子的子离子峰,但是在搜库中并没有加以利用,所以我们设置了生物素作为第21种氨基酸,并修改了蛋白的数据库,在蛋白C末端之后人为的加上了精氨酸和生物素的序列,以提高C末端肽段的质谱鉴定效率。随后我们将该方法应用于实际样品的C末端检测中,选取腾冲嗜热菌为模式生物,经过叁次的技术重复后,总共有183条C末端肽段被成功的鉴定到,比先前鉴定得到的数据规模有了极大的提高。第四章针对传统的酶解过程中较低的酶解效率以及自降解现象导致整个技术流程的灵敏度和效率过低的问题,从固定化酶解反应器角度入手,系统而深入地讨论了物理吸附类型的酶解反应器的工作过程。我们同时考虑了静电相互作用和亲疏水性作用对物理吸附带来的不同效应。首先为此合成了一系列由不同高分子层包裹的纳米硅球,详细地评估了不同纳米硅球在催化酶解过程中发挥的效率问题。我们合成了外层分别包覆聚二烯丙基二甲基氯化铵(poly diallyldimethylammonium chloride, PDDA)和聚苯乙烯磺酸(poly styrene sulfonate, PSS)的纳米硅球。这两种硅球表面聚合物的电荷性质不同,在酶解体系(25 mM碳酸氢铵,pH约为8)中分别带有正电荷及负电荷,而聚合物包裹又保证了纳米硅球的尺寸和形貌的一致性。此外还合成了表面连有疏水性有机长链的纳米硅球,该类硅球在酶解体系中保留了原硅球表面所带的负电荷,同时在水溶液体系中又具有疏水性的特点。不同材料分别用于标准蛋白细胞色素C和卵清白蛋白的酶解实验研究。这两种蛋白在酶解溶液体系中带有不同的电荷,但都属于疏水性蛋白。我们发现不同的材料对于具有不同等电点的蛋白有着明显差异的酶解效率。所以静电作用确实在吸附过程中是作为决定性的驱动力作用,在静电相互作用的存在下,亲疏水性作用只是一个次要因素。如果蛋白酶和待酶解的底物蛋白都带有与材料相反的电荷,那么在静电相互作用的影响下,它们能够同时被吸附在固相载体的表面,在材料周围局部范围内提高了蛋白酶以及蛋白的浓度,从而使得酶解过程在较短的时间内达到平衡,提高了酶解效率。另一方面,如果酶和底物两者带有异种电荷,那么它们始终不能同时被一种材料吸附,所以相比于传统的溶液酶解,此类的吸附酶解反应器的效率并不能有所提高。除了确定物理吸附型酶解反应器中起决定作用的吸附因素之外,对于吸附-酶解的动力学过程也尝试了基本的研究。我们发现不管是异种电荷相吸还是同种电荷相斥,基于静电相互作用的吸附平衡总是能够在很短的时间内达到,所以如果将酶解反应器看做是一个吸附-酶解的二级反应的话,蛋白的酶解过程是整个吸附酶解反应中的决速步骤。这对今后进一步的研究酶解动力学问题起着很好的指导作用,为发展下一代的吸附型酶解反应器建立了一定的理论基础和指导帮助。综上所述,本论文围绕蛋白C末端研究中鉴定和富集方面的热点、难点问题,以恶唑酮化学结合各种标记试剂为技术手段,以发展相关的蛋白质组学C末端研究新技术新方法并进行实际的应用研究为目标,建立了将化学衍生标记应用于质谱分析的策略,为解决蛋白质组学中C末端肽段的富集、识别、质谱鉴定以及相对定量提供了新颖有效的研究手段和方法。
杨仁全[5]2005年在《SARS病人组织中SARS冠状病毒全基因组克隆、序列分析及病毒样颗粒装配》文中指出2003年春季在我国广东、北京等地人群中爆发了以高热、寒战、肌肉痛、干咳、呼吸困难、高度接触性传染为主要特点的传染性疾病，随后该疾病被正式命名为“严重急性呼吸综合症(简称SARS)”。病因学研究表明，SARS的病因是一种新型冠状病毒，世界卫生组织将其命名为SARS相关冠状病毒(SARS-associated coronavirus，SARS-CoV)。作为一种新发现的病毒，目前对其遗传学和复制、装配机制等还所知甚少，因此开展此方面研究具有重要意义。 笔者参与了SARS病原的调查工作。为深入阐明北京地区流行的SARA-CoV的病原学特征，首先从SARS病人病料标本中进行病毒分离试验。将SARS病人临床标本，如咽拭子、痰液和肺组织标本接种Vero细胞，连续传代后，可观察到显着的细胞病理改变(CPE)，表明可能标本中可能存在病毒。电镜观察分离物培养上清负染样本，，可见到形态与典型冠状病毒外观相似的病毒样颗粒；用SARS病人康复期血清进行的间接免疫荧光试验，显示分离物接种培养的细胞胞浆内存在特异性荧光，证实培养物中存在与SARS-CoV相关的病毒抗原；提取分离物总RNA进行RT-PCR检测，可用冠状病毒基因组序列特异性引物扩增特异性片段，克隆扩增片段后进行DNA序列分析，结果显示所扩增的片段为冠状病毒保守的复制酶基因区序列。因此综合以上结果，提示分离到的病毒为SASR冠状病毒 为比较来源于SARS病人人体组织和已经分离、培养的SARS-CoV基因组之间的差异，阐明病毒的遗传和变异特点并深入探讨其致病机制，利用RT-PCR从北京地区一例SARS死亡病人(#5)肺组织总RNA中对SARS-CoV组织毒的基因组全长cDNA进行了克隆和序列分析。参考已经发表的SARS-CoV全序列，将待测定的SARS-CoV全长基因组分成26个片段，设计引物进行扩增。扩增并克隆的26个目的片段覆盖SARS-CoV全长基因组。测序结果表明本次实验中SARS-CoV-5#毒株基因组全长29707个核苷酸。同源性比对结果表明，SARS-CoV组织毒5#基因组序列与BJ01-BJ04地方分离株为同一流行株型。本次试验测定的组织毒的基因组序列在基因组水平上与18株全序列已知人源毒株的碱基差异不明显，而与10株动物来源的SARS-CoV分离株全序列在92个核酸位点上存在明显差异，这说明人源SARS-CoV毒株的全序列与动物源SARS-CoV毒株的全序列存在基因组水平的碱基差异，而细胞培养和人体组织来源的SARS毒株不存在基因组水平的碱基差异。对各种来源的SARS病毒的S蛋白质基因分析同样也显示了类似的碱基差异
余庆波[6]2005年在《拟南芥叶绿体蛋白质相互作用数据库构建及光合作用相关蛋白质功能挖掘》文中提出叶绿体是植物非常重要的细胞器,除了进行光合作用外,还参与了其他的生物代谢.在模式植物拟南芥中,叶绿体基因组编码87 个叶绿体蛋白,核基因组编码约4255 个叶绿体蛋白.绝大部分叶绿体蛋白的功能通过序列同源性分析确定,但是仍有约25%的蛋白质功能尚不清楚.本论文利用生物信息学方法并结合分子生物学方法对拟南芥叶绿体蛋白质功能进行研究.首先利用叁种生物信息学的方法构建了叶绿体蛋白质相互作用数据库.其中利用平移法,将5 个物种的蛋白质相互作用数据平移到拟南芥中,共获得拟南芥叶绿体蛋白质相互作用8157对;利用系统进化谱法,共获得可能的叶绿体相互作用的数据19,652 对;利用基因芯片表达谱法,对两个基因表达系数为0.90 以上数据分析,共获相互作用数据65,299 对.然后我们对以上构建的拟南芥叶绿体蛋白相互作用数据进行分析。这些蛋白质相互作用对参与多种代谢途径,如蛋白质的转运,淀粉代谢,脂肪酸代谢,光合作用等.预测结果表明,多个未知蛋白质与光合作用四个复合体中的亚单位相互作用;叶绿体中FtSH 家族金属蛋白酶7 个成员之间有相互作用;与光合作用蛋白质磷酸化作用的激酶STN7 和STN8 相互作用的蛋白质多为蛋白质激酶,多数蛋白质激酶的生物功能未知.最后我们通过酵母双杂交实验验证部分蛋白质的相互作用。从所构建的拟南芥叶绿体蛋白质相互作用数据库中,选取了46 对与光合作用有关的蛋白质相互作用对进行实验验证,初步实验结果表明,一个未知蛋白质C 与光合系统I 的蛋白psaD2 存在相互作用,因此,该未知蛋白质C 可能与光合作用有关.该数据库将有助于我们深入开展拟南芥叶绿体系统生物学研究以及光合作用相关蛋白的功能挖掘.
鲁延军[7]2008年在《家蚕Bm-lethal基因的克隆、表达及功能研究》文中指出农业害虫60%以上属于鳞翅目。研究和利用鳞翅目害虫的致死基因,制造并向环境释放一定数量的隐性或条件显性致死基因雄虫,能够向害虫种群扩散致死基因,达到长期抑制害虫数量、控制虫害的目的,对于农业害虫的生物防治具有重大意义。家蚕是鳞翅目模式昆虫,也是唯一完成全基因组测序的鳞翅目模式生物,这为鳞翅目害虫的功能基因研究提供了一个便利的平台。本研究基于家蚕WGS数据库、EST数据库、protein数据库,以果蝇、线虫公布的lethal基因为原始数据,运用生物信息学方法,结合RT-PCR、分子克隆、原核表达、RNAi等生物实验技术,第一次大量克隆获得了家蚕lethal同源基因,并对其进行结构分析和功能研究。主要获得以下结果:1家蚕lethal同源基因的电子克隆利用生物信息学方法,以果蝇和线虫中公布的146个lethal基因为原始数据,从家蚕的EST数据库中克隆出7条lethal同源基因,分别命名为Bm-lethal(2()GeneBank登录号:EF157831)、Bm-lethal(3) s1921、Bm-lethal(3) neo18、Bm-lethal(3) 07882、Bm-lethal(3) 02640、Bm-female lethal和Bm-let-2(GeneBank登录号:EU183409)。这是迄今为止报道和登陆鳞翅目昆虫lethal同源基因最多的一次。2家蚕lethal同源基因的cDNA克隆及序列分析从家蚕C108品种5龄幼虫脂肪体转录产物中,克隆、测序验证了Bm-lethal(2)、Bm-lethal(3) s1921、Bm-lethal(3) neo18、Bm-lethal(3) 07882、Bm-lethal(3) 02640和Bm-let-2 6条同源基因,结合RACE技术,获得了Bm-lethal(2)和Bm-let-2的全长mRNA序列。生物信息学分析表明,Bm-lethal(2)的氨基酸包含一个DAO(D-amino acid oxidase)蛋白家族功能域,具有1个甘油-3-磷酸脱氢酶保守区和2个Ca2+结合区域,属于FAD-依赖性氧化还原酶;Bm-lethal(3) s1921的氨基酸包含6个EZ-HEAT重复片段,与其它物种的脱氧辅蛋白羟化酶具有50%以上的同源性,可能是脱氧辅蛋白羟化酶;Bm-lethal(3) neo18在家蚕体内存在2个mRNA转录体,编码同一蛋白质,与其它物种的泛醌1β子复合体5蛋白质的C端有40%-60%的同源性,可能为泛醌的一个子复合体亚基,参与氧化还原反应;Bm-lethal(3) 07882的氨基酸包含一个Nop14(nucleolar protein 14)蛋白质家族功能域,与人、鼠等物种的Nop14具有40%-50%的同源性,推测其为Nop14蛋白基因。Bm-lethal(3) 02640的氨基酸包含一个胆色素原脱氨酶的保守区,又是dipyromethane辅助因子的绑定区域,与其它物种的胆色素原脱氨酶的蛋白质N端部分有60%-70%的同源性,推测其为胆色素原脱氨酶基因。Bm-let-2的蛋白质与按蚊、蜜蜂、人等物种的type IV collagenα1(IV)链有较高的同源性,其C端包含2个重迭的type IV collagen保守区和9个collagen蛋白家族功能域,说明其为type IV collagen蛋白质基因。利用家蚕dbWGS,结合RT-PCR等生物实验,拼接完成了Bm-lethal(2)和Bm-let-2的全基因序列。并利用MAGE3分别对其进行同源进化树分析,显示其均与蜜蜂、果蝇等昆虫的进化距离较近,而与人、牛等哺乳动物的进化距离较远,与传统理论的进化关系相一致。3 Bm-lethal(2)基因的原核表达、时空表达分析及RNAi研究原核表达实验,证明Bm-lethal(2)能够在原核细胞中大量诱导表达。时空表达研究证明,Bm-lethal(2)基因在血液中的表达量较少,而在生殖腺、脂肪体、丝腺和中肠中没有发现明显的组织表达特异性;Bm-lethal(2)基因在5龄幼虫阶段的表达量逐渐上升,在蛹期显着下降,而在处女蛾卵期的表达量却最高,之后下降。在产卵后72 h、及盐酸活化处理1 h时几乎没有表达。RNAi研究显示,注射Bm-lethal(2)dsRNA后,Bm-lethal(2)的表达量明显下降,但家蚕的生命力没有发生明显变化,在注射后9 d,Bm-lethal(2) RNAi组家蚕的体重明显高于阴性和阳性对照组。Bm-lethal(2)基因被抑制后,可能有其它基因代替执行其相应的功能。
赵静[8]2003年在《蚯蚓蛋白同功酶III-1、II结构与功能的研究》文中指出通过亲和层析从蚯蚓(Eisenia fetida)中得到一种具有较高活性的蚯蚓蛋白同功酶EFE-Ⅲ-1,其N末端序列为N-Ile-Val-Gly-Gly-Ile-Glu-Ala-Arg-...,质谱分子量为29,557 Da。EFE-Ⅲ-1在底物专一性和抑制剂特异性的实验中表现出具有胰蛋白酶类丝氨酸蛋白酶的性质。通过测定其纤溶活力和水解纤维蛋白原、纤溶酶原及凝血酶原的方式,提示:EFE-Ⅲ-1溶栓的过程可能是通过两种途径:(1)直接水解纤维蛋白(原);(2)激活纤溶酶原生成纤溶酶和小纤溶酶来间接水解纤维蛋白(原)。另外发现EFE-Ⅲ-1在水解过程中,主要的作用位点是在碱性氨基酸(如Lys-X,Arg-X)组成的肽键。在盐酸胍变性及KI淬灭的实验,表明EFE-Ⅲ-1是一种在盐酸胍变性中较为稳定的分子;其活性部位处在酶分子的一个有限区域,该区域对于胍的敏感性强于整个分子;在变性中其分子结构的去折迭是一个渐变的过程;色氨酸在去折迭过程,逐渐暴露到分子外部。 通过EFE-Ⅲ-1和EFE-Ⅱ在序列、同源性、底物特异性、纤溶活力、酶切位点、抗原性、构象等方面上的比较,提示:EFE-Ⅱ具有胰蛋白酶和弹性蛋白酶类的双重特性;EFE-Ⅲ-1比EFE-Ⅱ表现出较高纤溶活力;EFE-Ⅲ-1的底物专一性要高于EFE-Ⅱ;EFE-Ⅲ-1抗原的特异性要强于EFE-Ⅱ;EFE-Ⅲ-1的活性部位空间构象的柔性较低,分子结构较EFE-Ⅱ更为稳定;在变性的过程中,EFE-Ⅱ分子在变性剂中的去折迭是一个从渐变到突变的过程。 以上结果证明:EFE-Ⅲ-1是一种纤溶活性较高的,有更好的应用和开发前景的新型溶栓剂。
司英健[9]2003年在《蛋白质组学研究的内容、方法及意义》文中研究表明生物有机体的生理活动、病理活动以及药物的作用主要是通过蛋白质来实现的 ,然而仅凭目前已知的蛋白质根本无法阐明各种复杂的生命活动过程 ,因此 ,以基因组的研究成果为基础 ,以各种先进技术为支撑 ,进一步研究生物有机体的全部蛋白质结构、功能及其相互作用已经成
郑月茂[10]2005年在《转基因山羊乳腺上皮细胞系建立与转基因克隆胚发育》文中认为本研究通过PCR 法克隆了2 248 bp 的山羊β-乳球蛋白基因5′端调控序列,以之作为启动子指导人乳铁蛋白基因在山羊乳腺上皮细胞中特异性表达,以验证表达载体构建的合理性和外源基因的表达效率。利用脂质体包裹含人乳铁蛋白基因cDNA 的重组质粒pBLIG,并导入到山羊乳腺上皮细胞,经G418 及PCR 筛选获得阳性细胞,以之作为供体细胞利用核移植技术构建转基因克隆胚。应用PCR 法检测转基因克隆胚中的外源基因,并与荧光观察进行对照,从而实现在转基因克隆胚早期发育过程中对外源基因的检测,为进一步对荧光阳性胚胎进行移植,以期得到转基因动物个体奠定基础。研究结果如下:1. 山羊乳腺上皮细胞传至第15 代时其生长仍正常。山羊乳腺上皮细胞增殖可形成圆顶型结构,呈乳头状,称之为乳球体;大多数上皮细胞呈短梭形或多角形,呈蜂窝状;部分细胞呈圆饼状,体积较大;出现部分长形细胞。第15 代细胞表面微绒毛极为发达,细胞质中线粒体和粗面内质网丰富并含有大量脂滴,表明细胞增殖活力旺盛。染色体分析表明,山羊乳腺上皮细胞系稳定,在离体培养条件下细胞未发生转化。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳对山羊乳腺上皮细胞培养上清液中的蛋白质进行分离,发现山羊乳腺上皮细胞上清液有3 个条带与标准酪蛋白的3 个条带一致,表明本研究培养的上皮细胞为山羊乳腺上皮细胞,在体外培养条件下能表达山羊酪蛋白。2. 利用PCR 法克隆了山羊β-乳球蛋白基因5′调控序列(2 248 bp),其中包括第一外显子及第一内含子。PCR 产物回收纯化后,克隆在pMD 18-T Vector 的T 位点。质粒标记为pBLG。序列分析表明,该序列与发表的山羊序列同源性达99.70 %。计算机分析表明,此调控序列含有多个调节因子结合位点或反应元件,包括STAT5(MGF)信号转导子和转录激活子5(乳腺因子)结合位点、CCAAT/增强子结合蛋白结合位点、SP1 因子结合位点、Milk box“乳盒”、TBF 因子结合位点、视黄酸反应元件(RARE)、乳腺特异性因子(MSBF)和核因子1(NF1)结合位点等,这提示此调控序列可调控外源基因在乳腺上皮细胞中高效表达,可用于构建乳腺特异性表达载体。3. 将质粒pBLG 和表达载体pEGFP-c1 用AseI 和NheI 双酶切,回收目的片断,T4DNA
参考文献：
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[2]. C-端序列分析方法学研究与HWAP-Ⅰ生物活性方面的研究[D]. 王宇恩. 湖南师范大学. 2003
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[4]. 基于生物质谱的蛋白质C末端肽段定性与定量新方法[D]. 刘忞博. 复旦大学. 2013
[5]. SARS病人组织中SARS冠状病毒全基因组克隆、序列分析及病毒样颗粒装配[D]. 杨仁全. 南京农业大学. 2005
[6]. 拟南芥叶绿体蛋白质相互作用数据库构建及光合作用相关蛋白质功能挖掘[D]. 余庆波. 上海师范大学. 2005
[7]. 家蚕Bm-lethal基因的克隆、表达及功能研究[D]. 鲁延军. 苏州大学. 2008
[8]. 蚯蚓蛋白同功酶III-1、II结构与功能的研究[D]. 赵静. 吉林大学. 2003
[9]. 蛋白质组学研究的内容、方法及意义[J]. 司英健. 国外医学.临床生物化学与检验学分册. 2003
[10]. 转基因山羊乳腺上皮细胞系建立与转基因克隆胚发育[D]. 郑月茂. 西北农林科技大学. 2005
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