摘要：结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是一种常见的消化道恶性肿瘤，目前对于结直肠癌的确诊主要依赖于结肠镜检以及CT、PET-CT影像学检查。根治性切除术仍是结直肠癌的主要治疗方式，但是几乎半数患者在接受手术治疗后，存在肿瘤复发以及转移的问题。循环肿瘤细胞（circulating tumor cells）是从原发肿瘤灶或者转移肿瘤灶中脱落进入血液循环的肿瘤细胞，脱落的肿瘤细胞在形态、分子、基因等特征上与其他正常细胞存在明显差异。因此运用特定检测技术检测患者外周血中的CTC数目，能够有助于结直肠癌的诊断，有效预测肿瘤进展以及肿瘤转移情况，评估肿瘤治疗方案的有效性，推断肿瘤患者预后。本文主要对近年来新的CTC检测技术以及其在结直肠癌中的临床应用进行综述。
关键词：结直肠癌，循环肿瘤细胞，检测技术，临床应用
ABSTRACT：colorectal cancer is a commen digestive tract malignant tumor，the currently definite diagnosis for colorectal cancer mainly relies on colonoscopy and computed tomography、positron emission tomography-computed tomography examination.Curative resection remains the mainstay therapy for colorectal cancer，but approximately half of the patients who receiving surgery treatment，existed the problem of tumor recurrence and metastasis.circulating tumor cells is the tumor cells fall from primary tumor site or Metastatic tumour focal，and entered into the blood circulation，the fallen tumor cells has significant difference contrast with other normal cells in morphology characteristics、molecule characteristic and gene characteristics.Therefore used specific detection technology testing the CTC numbers in patients ′Peripheral blood，Can contribute to the diagnosis of colorectal cancer，Effectively predict the tumor progression and metastasis，evaluate the effectiveness of cancer treatment，predicted the prognosis of tumor patients.This paper mainly reviews the CTC detection technology in recent years and Its clinical application in colorectal cancer。
KEY WORDS：Colorectal cancer，Circulating tumor cells，Detection technology，Clinical application
结直肠癌是一种常见的消化道肿瘤，在美国，结直肠癌发病率位居男性恶性肿瘤的第二位，在女性恶性肿瘤发病率中位居第三位[1]。近年来，随着经济发展，人民生活水平提高，我国结直肠癌发病率呈上升趋势[2]。结直肠癌早期无明显症状，主要表现为排便习惯改变，大多数患者就诊时往往发展至中晚期，结直肠癌的确诊主要依赖于结肠镜检以及CT、PET-CT影像学检查。目前根治性手术切除治疗仍然是结直肠癌的主要主要治疗方式，然而在接受手术治疗后的五年内，有20％-30％的患者往往会出现肿瘤复发以及肿瘤转移现象[3]，从而导致结肠癌患者预后不佳，总体生存率下降。因此，对结直肠癌早期确诊以及有效监测肿瘤的复发、转移情况，有助于改善患者预后，提高总体生存率，降低死亡率。
循环肿瘤细胞是存在于肿瘤患者外周血中的恶性细胞，起源于肿瘤原发灶或转移灶。在1869年首次报道肿瘤患者体内发现循环肿瘤细胞存在，循环肿瘤细胞在形态、分子、基因等特征上与其他正常细胞存在明显差异。因此运用特定检测技术检测患者外周血中的CTC数目，能够有助于肿瘤的诊断，有效预测肿瘤进展以及肿瘤转移情况，评估肿瘤治疗方案的有效性，推断肿瘤患者预后。与结肠镜、PET-CT等传统检查方式相比，CTC检测技术操作简便，并且具有无创性的特点。CTC最早可在肿瘤组织大小为1mm时即可检出，传统的影像学技术检测出肿瘤时，肿瘤组织大小往往已经发展到10mm以上，即使是分辨率较高的PET-CT也只能检测出5mm以上大小的肿瘤组织[4]。因此CTC检测技术在临床上的应用，对于结直肠癌的早期确诊、复发转移预测、治疗效果评估等方面具有重要意义。
1.目前的CTC分离技术
现有的CTCs分离技术方法较多，根据CTCs的物理性质、免疫磁性，CTC分离方法主要包括密度梯度离心法、膜滤过法、免疫磁性分选法等.
1.1密度梯度离心法
该种方法主要基于循环肿瘤细胞的密度较其他外周血单个核细胞低的特点，利用梯度离心法，从而将CTCs与其他外周血细胞分离。Oncoquick法，采用1.077g/ml的 密 度 梯度将单个核细胞和肿瘤细胞与血液其它成分分离，同时增加设置多孔屏障，进而分离得到更加纯化的目的肿瘤细胞。密度梯度离心法操作简单，价格低廉，但需要的外周血量较大，并且分离后纯度低，易受单核细胞影响[5]。
1.2膜滤过法
根据CTCs细胞体积较外周血细胞大的特点，产生了膜滤过分离技术，当血液通过孔径为8μｍ的滤膜时，CTCs会被截留在滤膜上，从而达到分离CTCs的目的。该种非特异性分离方法对细胞伤害较小完整保留了CTCs的生物学特性，同时具有技术简便、易于操作的特点，但是，可能存在小于滤膜孔径的CTCs被漏检的可能性，灵敏度较低[6 ]。
1.3免疫磁性分选法
免疫磁珠法将磁性微珠包被单抗形成免疫磁珠，再结合靶细胞上的对应抗原形成抗原－抗体－磁珠复合物，在经过外加磁场时抗原-抗体-磁珠复合物被滞留，进而与其它外周血细胞分离。免疫磁珠为纳米级，不会对细胞造成机械压力，完整保留了细胞的结构。免疫学方法与形态学方法相比，具有操作简便快速，保持细胞活性，高选择性等优点。但同时其可能存在表面标志物表达较弱的目标肿瘤细胞的丢失的问题[7]。
1.4密度梯度离心法结合免疫磁性
Ro-settesep-applied imaging rare event（RARE）法，该方法包括密度梯度分离和免疫磁珠抗体介导的分离两个步骤，Naume[8]等先利用免疫磁珠阴性分离法使CD45阳性细胞与多种红 细胞交联结合形成双特异性四聚抗体复合物，再利用密度梯度离心法将这些复合物去除，因此CD45阴性的单核细胞即可得以分离。
1.5微流控芯片分离法
Nagrath[9]等研发出一种新型微流控捕获芯片（CTC-Chip），在一张载玻片大小的硅片上覆盖包被EPCAM抗体78000个显微位点，当外周血流经微流控捕获芯片时，抗体可与CTCs的表面抗原相结合，进而由于抗原-抗体反应，肿瘤细胞被留在三维结构的芯片内上，分离出的CTCs具有较好的细胞活性。但由于此类芯片制造困难，成本较高，不可重复利用，仅被用于实验研究。由于其具有分离率高，捕获的肿瘤细胞活性高，大量改良的CTC-Chip的研究就此开展。目前研究设计微流控芯片主要分为免疫特性以及物理特性两大类。免疫特性微流控芯片主要依据抗原-抗体反应，来捕获CTCs。物理特性主要依据于细胞在微流控流道中运动受到惯性迁移力的作用，而不同尺寸大小的细胞受力大小不同，因而能够分布在管道中的不同部位。因 CTCs直径大于大部分正常外周血细胞，从而得以分离。
2.目前的CTC检测技术
现有的CTC检测技术有免疫化学法，RT-PCR法，流式细胞技术等。
2.1 免疫化学法
免疫细胞化学（immuncytochemistry，ICC）是利用针对上皮抗原的单克隆抗体，通过化学反应使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原的表达。可在细胞水平上进行计数和鉴别，方便与多种方法相结合.优点是可进行细胞大小和形态学的分析，缺点是敏感性低，只能从（1-10）×105个细胞中发现1个CTCs。并且由于缺乏高度特异的上皮标记物，导致其特异性低。Veridex公司研发了CellSearchTM 系统，该系统被认为是目前 CTCs 定量检测的金标准，可从400 多亿的血细中识别及检测数目微量的 CTCs。主要原理是根据上皮细胞来源的肿瘤细胞的表面上皮细胞粘附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）表达阳性，而血液细胞不表达 EpCAM，从而捕获上皮源性CTCs。同时利用细胞内角蛋白荧光抗体（CK-PE）识别上皮细胞、白细胞荧光抗体（CD45-APC）识别白细胞以及DAPI荧光核染料用于生成细胞图像.从而达到分离CTCs并进行图像分析[10].2004年，CellSearchTM 系统已经被美国食品药物管理署（Food and Drug Administration，FDA）批准用于临床，主要应用于预测乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌的无进展生存时间（progression-free survival，PFS）和总生存时间（overall survival）.尽管CellSearchTM 系统目前被认为是精准度较高的一种检测方法，但是在炎症性疾病等非肿瘤疾病患者外周血中可发现假阳性结果的存在，深入的研究发现，在肿瘤发生转移前，原发肿瘤细胞通常会在其微环境的影响下经历上皮间质转化（epithelial － mesenchymal transition，EMT）的改变，不仅细胞形态和移动性改变使其容易释放及转移，细胞基因表达谱特别是上皮抗原向间质性表型转变，此时肿瘤细胞表面 EpCAM 往往是不表达的，从而导致以 EpCAM 为基础的 CellSearch 系统富集效率欠佳，加之该检测费用较高，使其在临床上广泛应用受到限制。并且CellSearchTM的最终结果部分来源于有经验的图像分析专家的主观判断，存在一定误差性。
2.2实时定量PCR检测法
实时定量PCR（real time quantitative，RT-qPCR）是目前检测 CTCs 最常用的方法之一，以上皮源性肿瘤细胞的mRNA为标志检测CTCs。由于DNA比RNA稳定，可持续存在于血液中，因此PCR法检测到DNA标记物仅提示体内有肿瘤并不能说明存在有活性的CTCs。RT-PCR 是将肿瘤特异性mRNA序列反转录为cDNA，通过 PCR 扩增来识别肿瘤特异性mRNA的表达。因原发灶组织分泌的 mRNA 进入血液后均被降解，因此可以推测检测到的 mRNA 是来自 CTCs 的表达。研究表明，RT-qPCR）的敏感性要比免疫细胞化学的方法敏感性高很多，可从107-108个外周血单个核细 胞中检测到单个CTCs。然 而，RT-PCR是以某个肿瘤标志物的mRNA为标志物，当目的基因在正常细胞表达以及取样时上皮细胞污染等因素都易使RT-PCR产生假阳性[11]。
2.3 流式细胞技术
流式细胞技术（flow cytometry，FCM），通过利用流式细胞仪对外周血中的CTCs进行分选和定量分析，不仅能鉴定特定标本中细胞抗原性和形态学特征，还能较好保持分离CTCs的细胞形态和活性，对其进行功能学研究。ImageStream（Amnis）系统首先将荧光特异性抗体与肿瘤细胞特异性抗原结合，然后通过流式细胞仪对荧光信号的分析从而鉴别 CTCs。但FCM检测目的肿瘤细胞的敏感度与CTCs数量有关，这在一定程度上限制了FCM在检测CTCs的应用[12]。
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2.4其他检测技术
其他关于CTCs的检测方法如上皮免疫斑点法（Epithelia immunospot，EPISPOT）、光纤阵列扫描技术（Fiber optic array scanning technology，FAST）、光声流式细胞术（Photoacoustic Flow Cytometry，PAFC）等检测技术有待进一步研究发展，在不久的将来有望丰富目前的CTCs检测方法，提高CTCs检测的特异性以及灵敏度。
3.CTC检测技术在结直肠癌中的应用
结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是常见的消化道恶性肿瘤，早期由于无明显症状，大多数患者就诊时通常已经发展到晚期。结直肠癌根治性手术治疗仍然是结直肠癌的主要治疗方式，但在接受根治性手术治疗后的患者中，有20％-30％的患者往往会出现肿瘤复发以及肿瘤转移现象，从而导致患者5年生存率较低，仅为10％左右。FOLFOX6 及 XELOX 是目前公认的一线化疗方案，贝伐单抗和西妥昔单抗等靶向药物已经用于进展期 CRC 的治疗。尽管这些治疗方案能够延长患者生存期，提高总体生存率，但存在高额花费给患者带来的经济压力，以及缺少个性化治疗选择容易导致过度治疗引起的相关不良反应等诸多问题。因此对结直肠癌的早期诊断，有效监测术后复发与转移，评估放化疗有效性，预测患者预后，急需一种肿瘤生物指标来指导结直肠癌的诊断与治疗选择，改善当前结直肠癌预后差，生存周期短的现状。
3.1 CTC检测技术对结直肠癌的诊断价值
Sastre[13]等利用CellSearchTM 系统分别检测94例结直肠癌患者以及30例健康志愿者7.5mL外周血中CTCs的数量，并将CTCs≥2个/7.5mL的结果定义为阳性标准，结果显示在94例结直肠癌患者中，有34例患者外周血中CTCs的数量≥2个，诊断阳性率为36.2％（34/94），CTCs 阳性率与结肠癌的临床分期相关（Ⅱ期20.7%，Ⅲ期24.1%，Ⅳ期 60．7%，P = 0.005）。目前结直肠癌的临床分期基于解剖学特征，难以精确反映转移灶对患者治疗和预后的影响。血液中检测到 CTC 并不意味着一定发生了转移，但是大量研究显示，CTC的检测在结直肠癌分期中具有指导意义[14]。
3.2 CTC检测技术与结直肠癌的手术治疗
肿瘤手术切除方式对肿瘤细胞的扩散转移具有重要的影响，但具体机制尚不清楚。Uen[15]等应用 RT － PCR方法以多肿瘤抗原（CK19、CK20、CEA）mRNA 标记检测 438例结肠癌根治术后患者的外周血 CTCs，结果分析显示，淋巴结转移、血管浸润和术后 CTCs 的持续阳性相关，可作为患者术后复发的独立预后因子。
3.3CTC检测技术与结直肠癌与结直肠癌化疗
患者化疗后检测 CTC的持续存在提示肿瘤可能对化疗不敏感，患者化疗敏感性及预后的因素之一是CTC在患者化疗过程中的变化情况，CTC可作为结直肠癌患者个体化治疗的一个参考指标。Lankiewicz[16]等研究发现采用标准化方案化疗3个月后，结直肠癌患者 CTC 阳性率可从化疗前的59%下降到 31%。由此可推断，CTC可作为患者化疗敏感性的指标。Koopman[17]等另一项前瞻性临床试验中，将467例MCRC患者随机分成卡倍他滨治疗组、奥沙利铂治疗组、贝伐单抗联合西妥昔单抗和贝伐单抗不联合西妥昔单抗治疗组.在开始时，29%患者CTCs≥3，治疗期间这一比例下降.CTCs≥3患者组较CTCs<3患者组具有明显不同的无进展生存时间（8.2 mo vs 10.5 mo，P = 0.0005）和总生存时间（13.7 mo vs 22.2 mo，P = 0.0001）.
3.4CTC检测技术与结直肠癌患者的预后
Cohen[18-19]等应用CellSearchTM 系统进行了一项包括430例患者的前瞻性研究.根据检测结果，患者被分为不良组（CTCs≥3）和良好组（CTCs<3）.与良好组相比，不良组患者有着较短的无进展生存时间（4.5 mo vs 7.9 mo，P= 0.0002）和总生存时间（9.4 mo vs 18.5 mo，P =0.0001）.治疗期间从不良组转变到良好组的患者比持续位于不良组的患者有着相对较长的生存期.一个前瞻性多中心研究（样本量430例）发现，如果CTC＞3个/7.5mL，则结直肠癌的 5年生存率较低，治疗效果也较差，但如果治疗后 CTC水平可下降（＜3个/7.5mL），则疾病预后较好[20]。
4.小结与展望
结直肠癌死亡的主要原因是肿瘤局部复发和远处转移。而肿瘤复发和转移的关键是 CTC的早期微转移，如何及早地检测到CTC，并对疾病进行综合治疗极为重要。CTC数量的多少可做为肿瘤复发和转移及疗效的评估指标，评估是否术后加强化疗。从而降低肿瘤复发率和转移率，延长患者生存期。随着生物学技术日新月异的发展，CTC检测的敏感性和特异性也在不断提高，其临床应用也越来越广泛，在结直肠癌未来的综合诊治中有望成为结直肠癌患者的临床常规检查，为患者带来福音。
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论文作者:李跃,谢忠
论文发表刊物:《健康世界》2017年第2期
论文发表时间:2017/3/16
标签：肿瘤论文; 细胞论文; 患者论文; 结直肠癌论文; 免疫论文; 抗体论文; 检测技术论文; 《健康世界》2017年第2期论文;