董文吉[1]2000年在《病毒载体介导的人β-珠蛋白基因转移研究》文中提出人类珠蛋白基因家族包括α和β两个基因簇，两个基因簇各功能基因呈红系组织特异、发育阶段特异、终产物始终维持平衡的表达。一旦平衡失调将导致地中海贫血。β-珠蛋白基因簇中的缺失或突变导致β-珠蛋白肽链合成停止或减少，继而出现β-地中海贫血(简称β-地贫)。β-地贫是人类较为常见的造血系统遗传病，目前尚无疗效满意的治疗方法。 采用基因添加的方法，即将正常人β-珠蛋白基因导入β-地贫患者造血干细胞中，稳定整合后在成熟红细胞中适宜表达，用以纠正珠蛋白肽链的不平衡状态，这种基因治疗方法有望长期缓解或治愈β-地贫。造血干细胞是β-地贫基因治疗的靶细胞，数量稀少，因此，将β-珠蛋白基因导入并整合于人造血干细胞必须采用高效基因转移方法。整合型病毒载体如反转录病毒载体和腺相关病毒载体既能实现基因的高效转移，又能将外源基因整合至靶细胞染色体，是β-地贫基因治疗首选的基因转移方法。 β-珠蛋白基因的正确表达依赖三种调控元件：通用的和红系特异的反式因子、β-珠蛋白基因的近端顺式元件(启动子)及β-基因簇的远端调控元件—基因座控制区(LCR)序列。LCR由四个红系特异、发育阶段稳定的DNaseI高敏位点(HS1-HS4)组成。每个HS包含一个长度介于200-400bp的核心序列，它分布着红系特异和通用的反式因子的结合基序，是体现HS功能活性的关键部位。LCR可使人β-珠蛋白基因在转基因小鼠中获得红系特异、整合位点非依赖、拷贝数依赖的高水平表达。完整的LCR长20kb，超过了病毒载体的容量，经人工删节，由LCR核心序列及其旁侧序列重组成的微小LCR(miniLCR)适合病毒载体的容量且保持了完整LCR的部分功能活性：α-珠蛋白基因簇的主要调控元件中HS40也具有典型的红系增强子活性，在β-珠蛋白基因病毒转移载体中引入miniLCR及HS40核心序列有望提高转移的β-珠蛋白基因的表达水平。 我们已证实反转录病毒载体能介导携带单个HS2核心序列的β-珠蛋白基因较稳定整合于红系细胞中(MEL细胞)，表达水平与内源性鼠α-珠蛋白基因表达可比，在长期造血重建小鼠体内人β-珠蛋白基因表达水平达内源α-珠蛋白基因的7％。为进一步提高转移β-珠蛋白基因的整体表达水平及在基因转移中的
高翠华, 徐炎, 韦启泽, 陶吉中, 强立平[2]1996年在《逆转录病毒载体介导的人β－珠蛋白基因导入人骨髓造血细胞》文中指出用重组人β－珠蛋白基因及其增强子的逆转录病毒载体转染－２细胞及ＰＡ３１７细胞，分离出产病毒粒子的－２和ＰＡ３１７克隆。用这两种细胞克隆进行乒乓上清感染，得到能产生高滴度逆转录病毒载体的ＰＡ３１７细胞克隆，其滴度达５．９×１０~６ＣＦＵ／ｍｌ。用此高滴度的病毒载体，在加入造血生长因子的情况下，重复感染人骨髓单核细胞，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交显示人β－珠蛋白基因及其增强子已完整地整合到人骨髓造血细胞基因组上。
董文吉, 祖振响, 刘德培, 郝德龙, 郭志晨[3]2002年在《反转录病毒载体介导的人β-珠蛋白基因低水平表达的机制初探》文中研究指明以人 β 珠蛋白基因簇基因座控制区DNaseI高敏位点 2和高敏位点 3组合的微小基因座控制区作为调控元件 ,以 374bp第二内含子部分缺失的 2 .0kbβ 珠蛋白基因作为结构基因的反转录病毒重组体 ,通过建立 ψ 2产病毒细胞系和瞬时转染双向性包装细胞系 ψ A两种方法获得重组病毒。感染鼠红白血病细胞后 ,Southern杂交鉴定前病毒整合完整性 ,用RNase保护实验检测人 β 珠蛋白基因的表达 ,通过PCR产物测序确定前病毒结构。结果表明 ,在瞬时转染 ψ A来源的重组病毒转导和质粒转染的鼠红白血病细胞中 ,人 β 珠蛋白基因的表达水平分别达到内源性鼠α 基因表达的 (5 2 .4± 11.2 ) % (n =12 )和 (73.8± 14 .3) % (n =12 ,未确定整合拷贝数 ) ;而在 ψ 2产病毒细胞系来源的病毒转导的细胞中 ,表达水平低于 3% ,前病毒序列分析发现其高敏位点 2中出现一个点突变 ,这可能是人β 珠蛋白基因呈低水平表达的一个原因。
王宏伟, 章静波, 徐炎, 韦启泽, 刘世广[4]1996年在《反转录病毒载体介导含增强子的人β－珠蛋白基因在小鼠胎肝细胞中的表达》文中提出将人β－珠蛋白基因（３．１ｋｂ）反向克隆入反转录病毒载体Ｎ２Ａ，并在Ｎ２Ａ的ＬＴＲ插入３６ｂｐ的增强子ＨＳ２（简称Ｎ２Ａ．β．Ｅ３６）。将此反转录病毒重组体转染ψ－２和ＰＡ３１７包装细胞系，经Ｇ４１８筛选后，分离出完整整合的并能产生较高病毒滴度的产病毒细胞系。利用产病毒细胞系，将含增强子人β－珠蛋白基因转入小鼠胎肝细胞，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交表明人β－珠蛋白基因可以完整地整合到靶细胞的基因组上，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交显示人β－珠蛋白基因可在小鼠胎肝细胞中表达。
赖颖晖[5]2010年在《慢病毒介导α-反义寡核苷酸对β-地中海贫血小鼠的作用》文中提出背景针对β-地中海贫血的α珠蛋白链相对过剩这一主要病理基础,有研究报道应用反义寡核苷酸技术调控人α-珠蛋白基因表达,结果显示α-反义寡核苷酸能有效地抑制体外培养的重型β-地中海贫血红系细胞α-珠蛋白基因表达,改善珠蛋白基因α/β+γ的比例失衡。然而,对于人α-反义寡核苷酸治疗β-地中海贫血的体内试验研究尚未见报道。目的建立人源化水平较高的人源非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠模型,在此基础上建立人源β-地中海贫血小鼠模型,并构建介导人α-反义寡核苷酸的慢病毒载体,探讨慢病毒载体介导α-反义寡核苷酸对人源β-地中海贫血小鼠模型的作用。方法1、将人正常骨髓或脐血单个核细胞分别移植给经不同方案和剂量预处理的NOD/SCID小鼠,移植后小鼠腹腔注射重组人细胞因子。观察小鼠存活情况,移植6周后检测小鼠骨髓及外周血人-CD45+细胞比例。2、将β-地中海贫血患者的骨髓单个核细胞,经尾静脉输注给经全身照射预处理的NOD/SCID小鼠,移植后小鼠腹腔注射重组人细胞因子。观察小鼠体重等一般状况,移植5周后取小鼠骨髓及外周血,检测人CD45+细胞比例,并行血红蛋白电泳、珠蛋白肽链聚丙烯酰胺凝胶电泳、人β-地贫基因分析及透射电镜观察小鼠外周血及骨髓红系细胞内α-珠蛋白链的沉积情况,取小鼠的肝脏和脾脏行大体、普通病理及铁染色检查。3、针对人α-反义寡核苷酸序列,通过双限制性内切酶消化和连接的方法构建pGCSIL-vshRNA-GFP载体质粒,接着该质粒转化感受态的大肠杆菌E.coliDH5α,通过PCR及基因测序鉴定阳性克隆,再经Lipofectamine 2000将pGCSIL-vshRNA-GFP,pHelper 1.0和pHelper 2.0三质粒系统共转染293 T细胞包装病毒,通过绿色荧光蛋白的表达测定收集的病毒滴度。此外,同样方法制备随机序列慢病毒载体并包装纯化。4、将介导α-反义寡核苷酸的慢病毒载体,感染β-地中海贫血患者骨髓CD34+细胞后,再输注给经全身照射预处理的NOD/SCID小鼠,并以输注未经感染的β-地贫骨髓细胞、感染随机序列慢病毒的β-地贫骨髓细胞、正常骨髓CD34+细胞及空白小鼠为对照。观察小鼠体重等一般状况,移植6周后,取小鼠骨髓及外周血,检测人CD45+细胞比例,并行血红蛋白电泳及人β-地贫基因分析,取小鼠的肝脏和脾脏行大体、普通病理及铁染色检查。结果1、全身照射(加或不加环磷酰胺)骨髓移植组和全身照射(加或不加环磷酰胺)脐血移植组小鼠输注人单个核细胞数分别为(0.656 0±0.008 9)×106和(4.077 5±0.845 0)×106。全身照射/环磷酰胺组死亡率均为100%,全身照射组死亡率均为33.3%,且全身照射剂量越大,死亡率越高。移植6周后,小鼠骨髓中人CD45+细胞的比例,全身照射脐血移植组13号和6号小鼠分别为59.61%和21.46%,而全身照射骨髓移植组2号和8号小鼠其比例均为0,空白对照组小鼠比例均为0。2、β-地中海贫血患者骨髓细胞移植NOD/SCID小鼠5周后,检测小鼠骨髓和外周血人CD45+细胞比例分别为:β-地贫/HbE骨髓移植组:7.21%、4.08%(+47天),7.37%、6.03%(+61天),β-地贫骨髓移植组:8.17%、3.43%(+36天),16.82%、8.89%(+45天)。移植组小鼠血红蛋白电泳可见HbA2条带,肽链分析显示α链的条带要比β链的条带浓和宽,β-地贫基因检测结果与供者相符,部分红系细胞内出现电子致密物(过剩α-珠蛋白肽链)沉积。移植组小鼠脾脏长度与其体重的比值比空白对照组的大[(0.5762±0.0451)vs(0.3628±0.0340)mm/g,P=0.000],肝脾出现较明显的铁沉积。3、重组质粒的外源基因PCR鉴定正确,基因测序结果与所需要的α-ASON序列完全一致,浓缩后慢病毒滴度为5×109TU/ml。4、慢病毒所感染的β-地贫骨髓细胞移植NOD/SCID小鼠,移植后6周各组小鼠与移植前体重比较:正常骨髓移植组和空白对照组体重增加或显著增加,而其余小鼠体重减轻或不增加。移植后6周各移植组小鼠骨髓和外周血能检测到人CD45+细胞(0.01-8.39%),且输注β-地中海贫血患者细胞(不论是否输注慢病毒感染细胞)的小鼠可检测到与供者相符的人β-地贫突变基因,输注β-地贫患者细胞的小鼠脾脏长度与其体重的比值比正常骨髓移植及空白对照组的大([0.6848±0.0886)v(s0.5573±0.0088)mm/g,P=0.016]。在α-ASON-LV感染β-地贫骨髓细胞移植组,肝脾(尤其脾)铁沉积比β-地贫骨髓移植组和NC-GFP-LV感染β-地贫骨髓细胞移植组的程度轻。结论在输注造血干细胞数量达阈剂量的基础上,尽可能提高预处理的强度,并使用人细胞因子可提高人源NOD/SCID小鼠模型的人源化水平。将β-地中海贫血患者骨髓单个核细胞移植给NOD/SCID小鼠,可建立人源化β-地中海贫血小鼠模型。所构建介导α-反义寡核苷酸的慢病毒载体感染人β-地贫骨髓细胞植入NOD/SCID小鼠,有可能减轻人源β-地中海贫血小鼠模型的铁沉积。慢病毒载体介导α-反义寡核苷酸对人源β-地中海贫血小鼠模型的作用有待进一步研究。
陈延文, 徐炎, 章静波[6]1996年在《逆转录病毒介导的β－珠蛋白基因在小鼠骨髓单核细胞的表达》文中认为从小鼠Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ股骨分离得到骨髓单核细胞（ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒｃｅｌｌｓ，ＢＭＭＣ），并在体外建立了ＢＭＭＣ细胞培养体系。将携带有人β－珠蛋白基因及其增强子的逆转录病毒载体（Ｎ２ＡβＥ３６）经ＤＮＡ磷酸钙共沉淀转染单向性包装细胞系（ψ－２）收集抗Ｇ４１８阳性ψ－２细胞克隆的病毒上清，感染体外培养的ＢＭＭＣ，同时加入白介素－３（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－３，ＩＬ－３）、白介素－６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－６，ＩＬ－６）、红细胞生成素（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ，Ｅｐｏ）等造血调节因子以促进造血细胞的增殖及提高基因转移的效率。经Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ－ｂｌｏｔ分析证实在小鼠ＢＭＭＣ中具有β－珠蛋白基因的整合与表达。
翟锦彬, 刘德培, 王晶, 陈迪, 郑勇[7]1999年在《携带小片段红系特异增强子的人β-珠蛋白基因在小鼠体内表达的研究》文中提出采用回体（ｅｘ ｖｉｖｏ） 基因转移策略， 分析了人β－珠蛋白基因在小鼠体内的整合和表达。研究发现， 在小鼠ＣＦＵ－Ｓ１２中检测到转移的人β－珠蛋白基因的整合， 其表达水平约为内源性鼠α－珠蛋白基因的０．５％ ～５％ 。在两只长期造血重建小鼠的骨髓、脾及胸腺和另一只小鼠的骨髓及脾中整合有人β－珠蛋白基因， 人β－珠蛋白基因在一只重建小鼠的骨髓和脾中表达，表达水平约为鼠内源α－珠蛋白基因的７％ ，表明反转录病毒载体介导的人β－珠蛋白基因可稳定整合在小鼠骨髓造血干细胞中， 并呈现红系组织特异性表达
杨宇, 朱定尔[8]2001年在《β地中海贫血基因治疗的研究进展》文中研究表明基因治疗是根治β地中海贫血研究的重点方向。位点控制区 (L CR)的发现以及新型基因转移系统不断开发研制 ,给导入正常β珠蛋白基因以实现基因治疗的设想带来了希望但同时也产生了新课题 ;与此同时 ,分别从DNA和 RNA水平对受损的β珠蛋白基因进行修正治疗的研究也在开展当中。随着珠蛋白基因表达调控机制研究不断深入 ,同时开发出安全高效的新型病毒载体 ,有可能最终实现β地中海贫血基因治疗
田晶, 王峰, 薛金凤, 赵霏, 宋柳江[9]2010年在《2型腺相关病毒载体介导正常人β珠蛋白基因在重型地贫流产胎儿造血细胞中的表达》文中指出目的:探讨2型重组腺相关病毒(recombin antadeno-associated virus 2,rAAV2)载体介导人β-珠蛋白基因转染地贫患者造血细胞治疗β-地中海贫血的可行性。方法:分离β41-42/β654杂合子型重型β-地贫流产胎儿造血细胞,经rAAV2-β-globin病毒转染(MOI=50)后移植入经X射线照射的BALB/c裸小鼠体内,分别于移植后14d、21d处死受体小鼠,RT-PCR及等位基因特异性PCR法检测人珠蛋白基因在受体小鼠体内的表达。结果:RT-PCR方法于3只受体小鼠骨髓样本中成功检测到人β-actin和人β-珠蛋白基因的表达,而21d处死的转染与对照小鼠外周血样本中未检测到人β-珠蛋白基因表达;等位基因特异性PCR方法在所有受体鼠体内同时检测到β41-42和β654突变基因,以及正常β-珠蛋白基因的表达,但rAAV2-β-globin转染组小鼠体内正常人β-珠蛋白基因表达水平明显高于对照组。结论:rAAV2可有效转染β41-42/β654杂合子型重型地中海贫血患者造血细胞,并通过exvivo途径介导β-珠蛋白转基因的体内表达,提高红系细胞内正常β-珠蛋白基因的表达水平。
唐晖[10]2005年在《人β地中海贫血β～（41/42）突变基因的克隆和真核表达体系的构建》文中研究表明背景:β地中海贫血(简称β地贫)是一种具有高度异质性的遗传疾病。由于β珠蛋白基因突变,造成α珠蛋白肽链和β珠蛋白肽链间的合成失平衡是其主要发病机制。在东南亚,包括我国西南、华南地区,β地贫已成为严重的公共卫生问题,其中β~(41/42)突变是最常见的导致重型β地贫的突变之一。 目的:克隆人地中海贫血基因β~(41/42)及调控系列LCR,构建该致病基因的体外真核表达体系,为该病基因治疗的研究提供理想模型。 方法:抽提β~(41/42)纯合子患者的DNA,PCR扩增出人β珠蛋白基因座控制区(LCR)和β~(41/42)基因,将其串连克隆至真核稳定表达质粒pcDNA3.1(-)中,脂质体转染至小鼠红白血病细胞(MEL),DMSO诱导MEL细胞表达,逆转录PCR检测人β~(41/42)基因在MEL中的表达。 结果:成功构建了包括长为2.1kb的人β~(41/42)突变基因和长5.5kb的人β珠蛋白基因的远端调控序列(LCR)的真核表达质粒pcDNA3.1-LCR-β~(41/42),并使其导入MEL细胞,RT-PCR显示β~(41/42)突变基因在MEL细胞中稳定的表达。 结论:成功构建了人β~(41/42)突变基因的LCR/MEL体外细胞模型,该模型真实地模拟了人体内β珠蛋白基因自身的调控形式,为β~(41/42)地贫的基因治疗研究提供了理想模型。
参考文献：
[1]. 病毒载体介导的人β-珠蛋白基因转移研究[D]. 董文吉. 中国协和医科大学. 2000
[2]. 逆转录病毒载体介导的人β－珠蛋白基因导入人骨髓造血细胞[J]. 高翠华, 徐炎, 韦启泽, 陶吉中, 强立平. 中国医学科学院学报. 1996
[3]. 反转录病毒载体介导的人β-珠蛋白基因低水平表达的机制初探[J]. 董文吉, 祖振响, 刘德培, 郝德龙, 郭志晨. 生物化学与生物物理学报. 2002
[4]. 反转录病毒载体介导含增强子的人β－珠蛋白基因在小鼠胎肝细胞中的表达[J]. 王宏伟, 章静波, 徐炎, 韦启泽, 刘世广. 中国医学科学院学报. 1996
[5]. 慢病毒介导α-反义寡核苷酸对β-地中海贫血小鼠的作用[D]. 赖颖晖. 广西医科大学. 2010
[6]. 逆转录病毒介导的β－珠蛋白基因在小鼠骨髓单核细胞的表达[J]. 陈延文, 徐炎, 章静波. 解剖学报. 1996
[7]. 携带小片段红系特异增强子的人β-珠蛋白基因在小鼠体内表达的研究[J]. 翟锦彬, 刘德培, 王晶, 陈迪, 郑勇. 高技术通讯. 1999
[8]. β地中海贫血基因治疗的研究进展[J]. 杨宇, 朱定尔. 国外医学(分子生物学分册). 2001
[9]. 2型腺相关病毒载体介导正常人β珠蛋白基因在重型地贫流产胎儿造血细胞中的表达[J]. 田晶, 王峰, 薛金凤, 赵霏, 宋柳江. 现代生物医学进展. 2010
[10]. 人β地中海贫血β～（41/42）突变基因的克隆和真核表达体系的构建[D]. 唐晖. 暨南大学. 2005