（1梁山县拳铺镇徐集中心卫生院；2梁山县小路口中心卫生院；山东济宁272100）
【摘要】目的：本文将研究中药材上面的黄曲霉毒素的污染现状分析与相关的对策。方法：结合黄曲霉菌检测方法研究现状，我们提出了要利用好PCR技术、核酸杂交技术等方式，来建立基于ＬＡＭＰ和ｑPCR技术的黄曲霉菌快速检测技术。结果：本硏究根据功能基因VER－1的外显子序列设计环介导等温扩增体系的扩增引物，并优化体系获得稳定高效的扩増结果。结论：每味中药材的基质不同，所采取降毒措施是否有效仍然是值得研究的问题。开发抗黄曲霉菌中药材品种是一大关注点。
【关键词】中药材上；黄曲霉毒素；污染现状分析；对策
[ 中图分类号 ]R2[ 文献标号 ]A[ 文章编号 ]2095-7165（2018）22-0292-02
0 引言
有毒的黄曲霉属曲霉,是一种应用广泛的微生物。它们广泛存在于空气、水和土壤等自然环境中。空气、水和昆虫是中药材的主要污染菌。在适当的条件下,有毒的黄曲霉会大量繁殖并产生。黄曲霉毒素在黄曲霉毒素产生后很难消除。黄曲霉毒素(AFT)是一类具有高毒性的香豆素衍生物。世卫组织将AFT归类为I类致癌物。黄曲霉毒素可引起肝癌、慢性肝炎、黄斑肝炎、肝肿大W和肝硬化。其中黄曲霉毒素B1毒性最强,致癌作用最强。此外,黄曲霉毒素可以损害肺、肌肉、肾脏和大脑。黄曲霉本身也会使人生病。黄曲霉感染可引起肺曲菌病,有时也可引起角膜、耳朵和鼻-眼框架感染。
1 黄曲霉菌污染现状
有毒的黄曲霉属曲霉属,是中药材中的主要污染菌之一。黄曲霉毒素是一类高毒性的黄曲霉代谢产物。它们耐热,不溶于水。一般来说,洗涤、刷洗、晒干和加热可以减少被污染的真菌的数量,但不能减少黄曲霉毒素的含量。黄曲霉毒素仅在280摄氏度降解。一旦黄曲霉毒素污染发生在中药中。染色后很难去除。黄曲霉毒素主要包括AFB1、AFB2、AFG1和AFG2，其主要具有致癌、遗传致崎和肝细胞的毒性作用，具有肾毒性、损害生殖棄乱和免疫抑制，其中Ｂ１毒性和致癌性最强也最为多见，属于剧毒物质，因此是主要检测指标。调查显示，曲霉属产毒真菌存在于全球多个国家和地区的药材中。在中国，甘草、麦冬、黄巧、胖大海、金银花等中药材中也均发现了黄曲霉毒素污染，有些中药材如黄窝中的黄曲霉毒素甚至高达100ng／gw，2015年版《中国药典》在原有基础上新増Ｓ类共计20种黄曲霉毒素测定品种。可见，中药材中产毒黄曲霉菌及黄曲霉毒素的污染形势严峻并已经引起了广泛重视，必须及时控制。
2 黄曲霉菌检测方法研究现状
传统的有毒真菌的分类鉴定通常采用形态学方法,要求专家具有较强的专业知识,且准确度低、费时等缺点。而分子检测方法因其高度准确性，耗时短且客观性强等优点，在产毒真菌的种类检测和鉴定方面得到了深入的研究和广泛的应用。目前己经被报道的黄曲霉菌分子检测方法包括ＤＮＡ直接测序、PCR－限制性片段长度多态性（PCR－ＲＦＬＰ）、多重PCR、巧光定量PCR等。然而，上述检测方法均耗时较长，一般需要２ｈ［＾上，其中ＤＮＡ测序则需更长时间，无法满足当前大样本快速定性定量检测的要求。因此，针对目前产毒黄曲霉菌的检测，亟需一种更快速准确的定性定量方法。
2.1 PCR技术
PCR技术是一种经典的体外扩增技术。其基本原理是根据已知的产毒真菌毒素途径中的保守核酸序列设计引物。设计引物通过凝胶电泳扩增目标序列。细菌。聚合酶链反应(PCR)是一种指数扩增,能在短时间内扩增出大量目的片段。自２０世纪９０年代Ｗ来，PCR技术被国内外学者用来检测各类产毒真菌。由于PCR技术具有灵敏度高、特异性强、反应时间短、操作简便、省时省力等优点，被广泛地应用于科研和检测中，显示出巨大的潜力和广阔的应用前景。
2.1.1 多重PCR
多重PCR，也称为多重引物PCR或复合PCR，它是在与两对引物共同参与的PCR反应体系中，扩増多个核酸片段的PCR反应，反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同。一般PCR仅使用一对引物，通边PCR扩増产生核酸片段，主要用于鉴定单一致病因子。多重PCR可用于检测几种病原微生物，同时检测或鉴定某些致病微生物，某些遗传病和癌基因鉴定。
2.1.2 巢式PCR
巢式PCR是聚合酶链反应的一种变异，使用两对而不是一对PCR引物来扩増完整片段。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆第一对PCR引物扩增片段与常规PCR相似，第二对引物在第一PCR产物内结合被称为巢式引物，使得第二PCR扩増片段比第一扩増片段短巢式PCR的优点是，如果第一次扩増产生错误的片段，则引物将在第二次错误的片段上配对和扩增的可能性非常低。因此，巢式PCR扩增是特异性是非常高的。
2.2 核酸杂交技术
分子杂交是一种技术,其中单链DNA探针与另一单链DNA分子形成双链,以确定特定序列是否存在。因其灵敏度高特异性强，送一技术在分子生物学领域中被广泛地使用，例如克隆基因的稀选、酶切图谱的剌作、基因组中特定基因序列的定性、定量检测和疾病的诊断等方面。探针多为放射性同位素、生物素或巧光染輯进行标记的己知序列的核酸片段。探针可用于分子杂交，杂交后通过放射自显影、巧光检测或显色技术，使杂交条带显现出来。核酸探针技术具有很富的灵敏度和特异性，因而具有较高的应用价值。原位杂交就是将特定标记的已知顺序核酸作为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交，从而对特定核酸顺序进行精确定量定位的过程。
3 建立基于ＬＡＭＰ和ｑPCR技术的黄曲霉菌快速检测技术
本研究根据黄曲霉毒素合成途径中的关键功能基因ＶＥＲ－１的外显子序列设计环介导等温扩增体系的扩增引物，并优化体系获得稳定高效的扩增结果，成功建立了黄曲霉菌的环介导等温扩増方法。本研巧通过对黄曲霉毒素生物合成关键基因设计特异引物，利用实时巧光定量PCR检测技术对黄曲霉茵进行定性定量检测。
3.1 仪器和材料
CFX96 TOUCH?REAL-TIME PCR仪（美国BIO-RAD公司）T100 CYCLER REAL-TIMEPCR仪（美国BIO－RAD公司）；BST聚合酶，DNTP（美国NEB）；SYBR GREEN，２ｘSYBR PREMIｘEｘTAQ（日本TAKARA公司）；硫酸摸，石蜡油等为国产分析纯。
3.2 方法
3.2.1 有关 LAMP反应体系建立和优化
反应流程：95摄氏度；变性5min，加入酶，63r反应60min，80摄氏度灭活酶10min。优化过程：同时加大dntp及mg＋浓度可提离灵敏度，减少反应时间；设置60-65六个梯度温度样品反应，得出最佳温度为63摄氏度;増加loop引物加快反应速度。
本研巧根据功能基因ＶＥＲ－１的外显子保守序列设计环介导等温扩增体系的扩増引物，并优化体系获得稳定髙效的扩增结果，在此基础上结合实时巧光检测技术开发实时巧光PCR技术，成功建立了黄曲霉菌的实时环介导等温扩増方法。
3.2.2 环介导等温扩増产物检测
将扩增产物通过１％的凝胶电泳进行分析，3个样品均呈现环介导等温扩增特征性梯状条带，说明3个扩増样品在该扩增体系下均得到了良好的扩增，证明环介导等温体系建立成功。本研同时建立了取闭盖产物检测方法，通过肉眼观察颜色变化进行产物判断，在简化检测步骤的同时也将产物污染的可能性降到最低。闲盖检测方法如下；在样品加入后依次加入15l石蜡油和L曲的1：10sybr green染料，在扩增反应结束后通过震荡使反应液与sybr green接触并充分混合，未扩增的Ｈ个样品染色后为澄红色，而扩增样品均为亮黄色。
4 结果
本硏究根据功能基因VER－1的外显子序列设计环介导等温扩增体系的扩增引物，并优化体系获得稳定高效的扩増结果。通过凝胶电泳对环介导等温扩增产物进行检测，得到标志性梯状条带，通过与sybr green染料进行巧盖产物检测，发现样品颜色由捲黄色变为亮黄色，证明得到扩増产物。
5 讨论与展望
由黄曲霉感染引起的不可逆的质量损失并不少见。一些物理、化学和生物学方法已被用于抑制黄曲霉的生长及其毒素的污染。然而,每个草药的基质是不同的。降低毒性的措施是否有效仍然是一个值得研究的问题。开发抗黄曲霉的中药材是当前研究的热点。基因工程技术具有整合有益植物性状,特别是提高植物抗病原体侵染能力的潜力。通过敲除调节黄曲霉毒素产生的关键基因或进行基因重组,开发具有抗黄曲霉特性的中药材将从源头上切断黄曲霉的形成、生长。
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论文作者:刘冰灵,徐开妍
论文发表刊物:《医师在线》2018年11月22期
论文发表时间:2019/4/2
标签：黄曲霉论文; 毒素论文; 引物论文; 黄曲霉菌论文; 中药材论文; 核酸论文; 基因论文; 《医师在线》2018年11月22期论文;