程飚[1]2002年在《创面愈合过程涉及的细胞信号转导及bFGF对信号通路的影响》文中研究说明目的 各类损伤引起机体的修复涵盖了一系列的生物学活动,通过细胞信号的传递引起细胞核内靶蛋白的表达,是一切生物学效应的基础。本研究拟通过对创面愈合过程中细胞信号活化状态的观察,认识参与组织修复信号间的调控关系,以及外用bFGF对信号通路的影响作用。为创面愈合的网络调控机制提供理论基础,同时为提高创面愈合的质量以及临床上生长因子的合理应用提供理论依据。 方法 利用大鼠深Ⅱ°烫伤模型,通过对烫伤大鼠愈合过程中各类修复细胞增殖、迁移、转化和凋亡活动中所涉及信号通路的表达情况观察,以及外用bFGF对信号蛋白的表达、抑制作用,初步确定该过程中主要其作用的信号系统MAPKs。在离体条件下,建立成纤维细胞烫伤诱导的凋亡模型,通过对MAPKs通路的激活或抑制作用,观察其下游靶蛋白的变化。收集人胎儿、成年和老年不同时期的皮肤标本以及不同愈合结局(增生性瘢痕、慢性溃疡和平坦瘢痕)组织标本。调查人体发育各阶段、不同修复结局皮肤内主要细胞酪氨酸激酶受体的表达差异。采用的方法有:免疫组化(免疫荧光)、原位杂交、DNA凝胶电泳、透射电镜、常规组织病理HE和V.G特染、逆转录聚合酶链式反应(PT-PCR)、共聚焦显微镜、Western blotting等。检测修复过程中增殖、凋亡及相关基因蛋白(如caspase、p53、Bcl-2、Bax、c-myc)的表达,以及MAPKs磷酸化蛋白的变化情况。对比不同发育阶段、不同愈合结局表皮生长因子受体和成纤维细胞生长因子受体的表达差异。 结果 我们划分叁个部分进行总结: 1 外源性bFGF对深Ⅱ°烫伤大鼠创面修复细胞增殖、凋亡、转化、再上皮化和迁移的影响 外源性bFGF诱导创面内成纤维细胞c-myc的表达,导致p53蛋白激活。随即引起PCNA、caspase3蛋白的改变,MAPKs参与该过程。外用bFGF后引起成纤维细胞TGF-β1的表达增加,对成纤维细胞向肌成纤维细胞转化发挥作用,同时因加速愈合又对其凋亡的发生。外源性bFGF对血管内皮细胞的增殖作用不明显,但改
侯轶[2]2012年在《成纤维细胞生长因子受体阻滞剂对膀胱肿瘤细胞增殖和迁移的影响及机制研究》文中进行了进一步梳理第一部分FGFR抑制剂通过MAPK信号通路对T24细胞增殖和迁移的影响目的：我国最常见的泌尿系统肿瘤是膀胱癌,在全部恶性肿瘤中约占3.2%,膀胱癌以尿路上皮细胞肿瘤为主,约占95%。膀胱癌会直接威胁患者生存。目前对于膀胱癌的药物治疗有很多,但是仍有一些不足。FGFR在膀胱上皮细胞中广泛存在,有研究表明其可能参与肿瘤细胞的生长。因此本研究旨在观察抑制FGFR是否可以有效抑制T24细胞的增殖和迁移,及其可能的信号通路。方法：分别用不同浓度0、60、70、80μmol/LFGF受体抑制剂(sprouty)处理体外培养的膀胱癌T24细胞后,首先观察细胞数量、形态变化；迁移观察sprouty对膀胱癌细胞迁移能力的影响情况；膀胱癌T24细胞增殖的变化通过MTT比色法检测；通过Western blot检测sprouty作用后膀胱癌T24细胞ERK, P38, JNK磷酸化水平以及总蛋白表达情况；统计学方法：本研究采用SPSS17.0统计软件包进行统计学处理。用采用t检验对计量资料,χ2检验对计数资料进行统计学分析,以p<0.05为差异有显着意义。结果：FGFR抑制剂(Sprouty)能明显抑制T24细胞增殖,细胞发生明显的皱缩,凋亡。MTT结果显示FGFR抑制剂处理膀胱癌细胞,细胞增殖具有剂量和时间依赖性,即随药物浓度升高(0-80μmol/L)和作用时间的延长(24-72h)而抑制作用增强。迁移观察sprouty对膀胱癌细胞迁移能力的影响,结果显示sproutyO、60、70、80μmol可以明显抑制细胞的迁移,并且随着作用浓度的增加而增加。进一步检查sprouty作用可能的信号通路,westemblot的结果显示,sprouty可以明显抑制ERK磷酸化水平,增加JNK磷酸化水平,而对于P38并无明显影响。结论：FGFR抑制剂可能通过MAPK信号通路抑制T24细胞增殖和迁移。第二部分FGFR抑制剂对于膀胱肿瘤生长以及侵袭的影响目的：肿瘤的形成是异型细胞过度增殖,转移。肿瘤细胞首先发生局部浸润,进而转移到其他组织,增加其侵袭性以及恶性程度,最终导致患者死亡。肿瘤细胞的局部浸润首先是肿瘤细胞之间的连接减弱,粘附力降低,肿瘤细胞与基底膜粘附降低,细胞外基质发生降解,由此肿瘤细胞通过降解空隙发生迁移。在第一部分我们已经证实了FGFR可以通过MAPK信号通路抑制T24细胞的增殖和迁移,在本节内容中我们进一步探讨FGFR抑制剂是否可以对于膀胱癌肿瘤生长以及侵袭产生相应的作用。方法：选取BALB/C nu/nu裸鼠,共40只,4～6周龄,体重20g左右,恒温恒湿饲养,自由进食水。裸鼠在动物房适应3天后,即进行肿瘤细胞的局部注射。准备肿瘤细胞：取对数生长期的T-24细胞,调整活细胞浓度为5×106/ml,于每只裸鼠腹股沟皮下接种上述单细胞悬液0.2m1后,将裸鼠随机分为四组,每组10只,分别为对照组、bFGF组,sprouty组以及sprouty+bFGF共同作用组。并在第二天开始给药,腹腔注射1次/d,对照组注射等量生理盐水。培养T24细胞分别给予,与上述分组相同,给药12h后,观察MMPs的变化,并提取在体肿瘤细胞RNA,进一步观察MMPs mRNA水平的改变。结果：bFGF具有明显的成瘤性,而FGFR抑制剂sprouty可以抑制肿瘤的生成,并且可以逆转bFGF对肿瘤生成的促进作用。bFGF可能通过调节MMPs的表达从而影响肿瘤细胞的侵袭,FGFR抑制剂sprotuy能抑制MMPs的表达,并且可以阻断bFGF对MMPs表达的调控作用结论：FGFR抑制剂可以有效抑制膀胱肿瘤生长以及侵袭,其抑制细胞迁移可能是通过调控MMPs mRNA水平。
陈艳清[3]2007年在《血管紧张素Ⅱ对增生性瘢痕成纤维细胞的活化作用及机制研究》文中研究说明背景增生性瘢痕(hypertrophic scar,HS)是人类皮肤损伤后特有的一种病理现象,影响患者的外观和功能,其发病机制至今尚不十分清楚。皮肤组织中成纤维细胞占细胞总量的40%-60%,在促纤维化生长因子的影响下,成纤维细胞大量分泌细胞外基质,被认为是病理性瘢痕形成的主要原因。有研究显示,皮肤存在局部肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system,RAS),血管紧张素II(angiotensin II,Ang II)作为RAS的主要效应因子,能够促进人类皮肤成纤维细胞的增殖和胶原合成,提示Ang II与人类瘢痕的形成有关。Ang II的I型受体拮抗剂已经在临床上使用,主要用于治疗高血压,有研究人员尝试用于治疗心肌肥厚、肝纤维化等取得了一定的效果。深入研究Ang II对HS的作用及可能的机制,将为探索HS的发生机制和防治提供新的思路和实验基础。目的比较Ang II的I型受体(angiotensin II receptor type I,AT1)和II型受体(angiotensin II receptor type II,AT2)在正常皮肤(normal skin,NS)与HS组织中的表达差异,体外分离培养NS和HS的成纤维细胞,检测两种受体在成纤维细胞上的表达情况;观察Ang II、AT1拮抗剂Losartan和AT2拮抗剂PD123319对体外培养的HS成纤维细胞增殖、活化、细胞外基质合成和TGF-β1表达的影响;检测Ang II对JAK2/STAT1、STAT3通路的活化效应以及JAK2拮抗剂对TGF-β1和FN mRNA表达的影响。为探讨Ang II对HS成纤维细胞的活化作用及机制提供理论依据。方法1.应用免疫组化方法观察Ang II的受体AT1和AT2在NS与HS组织中的表达差异;体外分离培养NS和HS成纤维细胞,通过RT-PCR和Western blot检测AT1、AT2 mRNA和蛋白在成纤维细胞上的表达情况。2.通过细胞计数、MTT法、[3H]-TdR掺入法测定细胞增殖和活力,[3H]-脯氨酸掺入法检测Ang II对HS成纤维细胞胶原合成的影响。3.应用RT-PCR法和Western blot法分别从mRNA水平和蛋白水平检测Ang II对成纤维细胞合成细胞外基质的主要成分I型前胶原、III型前胶原和纤维连接蛋白(fibronectin,FN)以及TGF-β1表达的影响。4.检测Ang II对JAK/STAT通路中的JAK2、STAT1、STAT3磷酸化的影响,并进一步检测磷酸化的STAT1、STAT3转位入核情况。观察JAK2抑制剂AG490对Ang II诱导的成纤维细胞TGF-β1合成的影响。结果1. Ang II的受体AT1和AT2在NS组织中的表达呈阴性或弱阳性,在HS中,二者表达量均增加,且以AT1增加的更加明显。AT1和AT2的mRNA和蛋白在NS和HS的成纤维细胞中均有表达,在HS成纤维细胞上的表达量多于NS,AT1的表达量增加的更加明显,成纤维细胞中AT1 mRNA和蛋白表达量HS分别是NS的3.1倍和2.3倍。2. Ang II通过与HS成纤维细胞上的受体AT1结合,诱导其增殖、活化。3. Ang II能促进HS成纤维细胞合成细胞外基质及TGF-β1,该作用可被其AT1受体拮抗剂Losartan完全阻断。4. JAK2的阻滞剂AG490能部分降低Ang II刺激后的成纤维细胞TGF-β1和FN mRNA的表达。5. Ang II能促进JAK2、STAT1和STAT3的磷酸化,以p-STAT3明显,并促进磷酸化的STAT1和STAT3转位入核,提取的细胞核蛋白中p-STAT3与p-STAT1表达均增加,尤其以p-STAT3明显,用Losartan和JAK2的抑制剂AG490分别作预处理后,均能降低Ang II对JAK2通路的活化作用。结论1.皮肤是Ang II的作用靶器官之一,成纤维细胞是Ang II作用的靶细胞。2. Ang II诱导成纤维细胞增殖、活化、分泌细胞外基质、促进TGF-β1的合成,均是通过其AT1受体完成的,AT1受体拮抗剂能完全阻断该作用。3. Ang II对JAK2/STAT1、STAT3通路的活化是通过促进它们的磷酸化实现的,阻断AT1受体,能降低Ang II对该通路的活化。在HS成纤维细胞中,Ang II活化的是JAK家族中的JAK2,JAK2的作用底物是STAT1和STAT3。4. JAK2通路部分参与了Ang II对成纤维细胞的活化作用。
曹川[4]2007年在《叁羟基异黄酮对增生性瘢痕成纤维细胞的影响及相关信号作用机制的研究》文中提出增生性瘢痕(hyperplastic scar,HS)的本质是成纤维细胞的异常增殖和细胞外基质的过度沉积,其在外观和功能上严重影响患者的身体健康与生活质量。尽管对瘢痕的发病机理和防治方法进行了大量的研究,但迄今尚无理想的结果,寻求特殊有效的治疗手段一直是整形外科研究的重要课题。5,7,4’-叁羟基异黄酮(Genistein)是来源于豆类的植物雌激素类化合物,它是一种特异性酪氨酸蛋白激酶(tyrosine protein kinase,TPK)抑制剂,大量实验研究及流行病学调查表明Genistein对多种异常增殖的肿瘤和组织器官纤维化疾病有显着的抑制作用,并已开始用于临床治疗,获得了安全可靠的效果。根据Genistein的生物学特点及药理性质,其有可能在病理性瘢痕的防治上也发挥良好的作用。目的研究Genistein对HS成纤维细胞增殖与功能的生物学影响并初步探讨其作用的信号转导机制。应用体外培养人HS成纤维细胞模型,观察Genistein对细胞的增殖、凋亡及部分生物学功能的影响,以及Genistein作用后细胞内受体酪氨酸蛋白激酶信号通路中多个相关信号蛋白分子活化的变化情况,明确Genistein对HS成纤维细胞的生物学作用并从信号转导途径初步探讨其可能的作用机制,为临床应用异黄酮类药物防治增生性瘢痕提供理想的实验依据。方法1.分离培养人HS成纤维细胞,加入不同浓度的Genistein作用,观察药物对细胞生长的影响;MTT法检测细胞增殖;免疫细胞化学法测定细胞PCNA表达;流式细胞术检测细胞周期;TUNEL法检测细胞凋亡;Western Blot蛋白免疫印迹法检测细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3的表达。2.不同浓度Genistein作用后,H~3-脯氨酸掺入法检测HS成纤维细胞胶原合成率以及用RT-PCR技术检测细胞内Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA的表达变化;Western Blot法检测TGF-β1蛋白表达;激光共聚焦显微镜观察Genistein对细胞内Ca~(2+)浓度的影响变化。3. [γ-~(32)p]ATP底物掺入法检测Genistein作用后HS成纤维细胞TPK活性变化;Western Blot法检测Genistein作用后受体依赖型酪氨酸蛋白激酶两条主要信号通路Ras-MAPK以及PI3K-Akt中的重要信号蛋白分子c-Raf、MEK1/2、ERK1/2、p38、JNK、Akt磷酸化蛋白的表达变化,初步探讨其信号转导作用机制。结果1.加入Genistein共培养后,HS成纤维细胞生长速度减慢,生长曲线显示细胞数量增长的趋势随药物剂量增加及作用时间延长而下降;细胞逐渐失去双极性的纤维化细胞形态特征,排列紊乱,与邻近细胞的接触减少。2. MTT比色结果显示Genistein作用后各实验组HS成纤维细胞的OD值减少,具有剂量-效应和时间-效应关系,其中l00μmol/L组的抑制作用最为显着。3.各实验组HS成纤维细胞内PCNA的含量下降。4. Genistein作用后G0-G1期细胞数量减少,G2-M期细胞比例上升;l00μmol/L组中的S期细胞数量也有增加。5. Genistein作用后细胞凋亡率增加;Bcl-2蛋白表达下降,Bax、Caspase-3蛋白的表达上调。6.在Genistein作用下,HS成纤维细胞的胶原合成率降低;Ⅰ型及Ⅲ型前胶原蛋白mRNA表达下调。7.各实验组细胞TGF-β1蛋白的表达减少。8.加入Genistein后细胞内Ca~(2+)浓度下降;加入bFGF后细胞Ca~(2+)浓度升高,预先用Genistein处理可使bFGF促Ca~(2+)增高的作用显着减弱。9.加入Genistein后细胞内TPK活性显着下降,并可减弱bFGF促进细胞TPK活性增加的作用。10.不同浓度Genistein作用HS成纤维细胞后,胞内磷酸化c-Raf、MEK1/2、ERK1/2、p38、Akt蛋白的含量均有不同程度的降低,其中c-Raf、ERK1/2、Akt的下降变化较明显;磷酸化JNK蛋白含量与对照组相比无显着性差异。在Genistein作用下,加入bFGF刺激后细胞内各信号蛋白的表达显示同样的变化趋势。结论1. Genistein能有效抑制HS成纤维细胞的增殖,诱导细胞凋亡,其抑制增殖和诱导凋亡的作用与影响细胞周期和调节凋亡相关蛋白的表达有关。2. Genistein能影响HS成纤维细胞的生物学功能,包括抑制细胞胶原的合成、减少TGF-β1蛋白的分泌、降低细胞内Ca~(2+)离子浓度。3. Genistein可通过抑制细胞受体型酪氨酸蛋白激酶信号转导途径而影响HS成纤维细胞的增殖与活化,其作用的主要信号通路可能为Ras→Raf→MEK→ERK/p38途径以及PI3K→Akt途径。
王虎军[5]2013年在《维药异常黑胆质成熟剂对增生性瘢痕影响的实验研究》文中认为瘢痕(Scar)是机体创伤愈合的必然产物。病理性瘢痕由于瘢痕增生过度,从而引起外形和(或)功能异常。增生性瘢痕(Hypertrophic Scar, HS)是临床最常见的病理性瘢痕之一,造成患者外观畸形和功能异常,给患者身体及心理带来了较大的影响。由于其具体机制尚不十分清楚,且治疗后易复发等特点,当前尚无较好的防治手段。增生性瘢痕的形成是多环节、多阶段的一个复杂过程,包括凝血、早期炎症、晚期炎症、成纤维细胞的迁移与胶原的合成、血管化、上皮化、重塑阶段等。传统治疗方法包括局部加压、激素注射、硅凝胶类以及放化疗等虽然取得了一定效果,但在治疗HS的同时,会出现副作用或不良反应,临床应用受到一定限制。在传统中医理论中,HS认为是由于气血壅滞、经络痹阻、痰湿搏结或叁者联合所致,且基于活血化瘀、攻毒散结、通络止痛、酸涩收敛和消结散瘢等方法在增生性瘢痕的防治上取得了一定进展。虽然目前报道的中医治疗瘢痕的方法很多,但多数存在用药途径比较单一、剂型有限、多集中在单味药物或是提取物研究等缺陷,且疗效不确切,容易复发等缺点。维医理论认为体液是人类生命及生理活动过程的基本物质体内各种营养物质在肝中产生的各种液体总称为体液,分为胆液质、血液质、粘液质和黑胆质四种。它们贯穿于整个人生,在体内自然形成,对健康和疾病起很大的作用。它们在体内不断地消耗,又不断地产生,保持着一定的平衡状态。四体液脱离自然的正常状态,在数量和质量上发生改变,成为对人体无益或有损的体液,称为异常体液。在体内外各种因素的作用下,人体内胆质体液的量增加,功能改变,在机体基础“热”的作用下“燃烧”最终形成异常黑胆质,是许多疾病维吾尔医学病理生理上所共有的特性。治疗上主要采用异常黑胆质成熟剂(Abnormal Savda Munziq, ASMq)进行调整。ASMq在防治部分肿瘤、糖尿病、高血压等方面均取得了一定效果。体外研究显示ASMq具有抑制肿瘤细胞增殖,促进细胞凋亡等作用。研究表明皮肤增生性瘢痕是由于成纤维细胞过度增殖以及细胞外基质胶原过度沉积所引起,又被称为“皮肤成纤维细胞良性肿瘤”。本研究在传统维医理论指导下提出科学假设：皮肤增生性瘢痕是异常黑胆质体液在皮肤的局部沉积所致,是全身异常黑胆质体液的局部表现。本研究拟通过兔耳增生性瘢痕动物模型以及体外人增生性瘢痕成纤维细胞培养实验,通过采用不同浓度ASMq干预研究,来检验假设,并进一步探讨其细胞与分子机制。研究表明,增生性瘢痕是由于成纤维细胞过度增殖以及细胞外基质胶原过度沉积所引起,其中TGF-p是导致增生性瘢痕形成的重要细胞因子,它主要通过TGF-β/Smad信号通路参与调节成纤维细胞的增殖,凋亡,迁移和胶原代谢。TGF-β能同时触发两个可以对抗Smad蛋白介导的正反馈调节机制,其中就是快速激活Smad7启动子,诱导Smad7基因表达,通过Smad7竞争性的占据TGF-βI型受体,抑制受体的蛋白激酶R-TGF-p的磷酸化而阻断信号传导,最后诱发它能促进细胞外基质在伤口沉积,并能促进纤维化,促使形成增生性瘢痕。由于增生性瘢痕是成纤维细胞过度增殖和细胞外胶原机制过度沉积而引起,因此抑制成纤维细胞增殖、抑制其胶原表达是防治增生性瘢痕的基础。在细胞水平上,通过抑制细胞活性从而抑制成纤维细胞增殖、促进细胞凋亡可以减少瘢痕内成纤维细胞数量,可以在一定程度上防治增生性瘢痕；在细胞超微结构中,改变细胞内内质网、核糖体、线粒体等与胶原表达关系密切的亚细胞器活性可以在一定程度上具有减少瘢痕胶原的沉积的作用;在蛋白分子水平上,由于TGF-β/Smad信号通路是胶原产生的主要通路之一,且TGF-β1是促进细胞增殖的重要因子之一,因此通过减少TGF-β1的表达、增加Smad7的表达可以防治增生性瘢痕的发生和发展。目的：通过体内体外实验初步探讨维药ASMq对增生性瘢痕的影响及其作用机制,为临床采用维医维药理论防治增生性瘢痕提供实验和理论依据。方法：本研究采用兔耳瘢痕动物模型、体外增生性瘢痕成纤维细胞培养等途径,分别从组织学、细胞学以及分子生物学水平,探讨维药ASMq对增生性瘢痕的影响及其作用机制。第一部分,体内实验部分,灌胃给予维药ASMq对兔耳增生性瘢痕影响的实验研究。20只新西兰大耳白兔采用随机数字表法随机分为4组,即空白对照组(生理盐水)叁个实验组分别为：(ASMq400mg/kg),(ASMq800mg/kg)、(ASMq1200mg/kg),每组5只。在创面形成后第45天(预实验表明此时瘢痕增生达到峰值),分别取材后进行各项指标测定,备好切片后进行四项实验实施。(1)通过计算瘢痕增生指数(Hypertrophic Indes, HI),与空白对照组相比,从而明确各实验组ASMq对兔耳增生性瘢痕有无影响。(2)通过对各组创面范围内组织切片行HE染色,观察各组兔耳瘢痕胶原排列以及成纤维细胞密度等情况,进一步明确ASMq对兔耳增生性瘢痕胶原增生以及成纤维细胞增殖的影响。(3)通过对各组创面范围内组织行Masson染色,观察各组胶原排列以及胶原密度,通过采用单因素方差分析分析多组间胶原面密度,通过两两比较q检验,明确各组间胶原面密度有无差异。(4)通过对兔耳创面范围内组织标本通过透射电镜观察组织超微结构(包括原胶原纤维、线粒体、内质网等细胞亚结构),通过与空白对照组相比较分析,初步在超微结构层面进一步观察不同浓度维药ASMq对兔耳增生性瘢痕的影响机制。第二部分,体外实验,通过体外分离培养人增生性瘢痕来源成纤维细胞,分四组(1个空白对照组,3个实验组)：空白对照组,低浓度ASMq组(0.1mg/m1),中浓度ASMq组(0.4mg/m1),高浓度ASMq组(0.7mg/m1)。对各组在相应时间点收集标本进行检测：(1)通过CCK-8方法,采用酶标仪检测ASMq对成纤维细胞体外增殖有无影响。(2)采用细胞凋亡分析试剂盒通过流式细胞分析仪行细胞凋亡检测,拟明确不同浓度ASMq对成纤维细胞凋亡的影响。(3)采用细胞周期检测试剂盒,通过流式细胞术分析ASMq对成纤维细胞细胞周期的影响,拟明确ASMq阻断细胞增殖周期的具体时间点。(4)通过细胞划痕迁移实验观察成纤维细胞迁移能力,拟明确不同浓度ASMq对成纤维细胞迁移能力有无影响。(5)通过透射电镜观察成纤维细胞合成原胶原能力以及内质网、核糖体、细胞核、线粒体等细胞亚结构情况,拟明进一步分析明确不同浓度ASMq对成纤维细胞表达胶原以及细胞凋亡、增殖的机制。第叁部分,采用RT-PCR方法和免疫印迹等方法基于TGF-β/Smad通路分析ASMq对增生性瘢痕来源成纤维细胞细胞增殖、胶原表达影响的分子机制。拟明确不同浓度ASMq对增生性瘢痕来源成纤维细胞细胞增殖、胶原表达的分子机制。结果：第一部分,体内兔耳增生性瘢痕动物模型实验结果表明,灌胃给药ASMq可以在一定程度上抑制增生性瘢痕的发生发展,且在一定浓度范围内具有浓度梯度依赖性。(1)大体观察结果,增生性瘢痕的厚度随着ASMq的浓度逐渐增大,其厚度逐渐减小,硬度逐渐软化,体积逐渐减小趋于平复,颜色逐渐变淡。(2)计算瘢痕增生指数结果,与空白组(3.87±0.22)对比,实验各组分别为(3.38±0.34)、(2.63±0.15)、(1.72±0.12)增生性指数(HI)随着ASMq的浓度逐渐增加而降低(p<0.05)。(3)通过HE染色在1200mg/kg浓度维药ASMq灌胃后对瘢痕增生的成纤维细胞密度观察结果,与空白组(4022.5±±189.3)相比,实验组(3541.44±206.6)的显示瘢痕增生不明显,成纤维细胞数量及密度减少(p<0.05)。(4)通过Masson染色在1200mg/kg浓度维药ASMq灌胃后对瘢痕增生的胶原纤维情况观察结果,与空白组(42.25±2.58)相比,实验组(23.55±1.28)的增生性瘢痕胶原纤维面密度明显减少(p<0.05)。(5)通过透射电镜观察不同浓度的ASMq对增生性瘢痕成纤维细胞的超微结构观察结果;与空白组对比,随着实验组浓度的递增成纤维细胞密度和胶原纤维面密度逐渐减少。第二部分,体外增生性瘢痕来源成纤维细胞干预实验结果表明,在一定浓度范围内ASMq具有抑制成纤维细胞增殖、促进细胞凋亡的作用；细胞超微结构分析结果显示ASMq具有抑制成纤维细胞原胶原合成,抑制细胞亚结构(如内质网、核糖体、线粒体等)活性,促进细胞凋亡等作用。生物学特性的影响。(1)体外细胞培养原代和传代及细胞冻存和复苏情况结果,成纤维细胞界限清楚,胞体较大,呈棱形或不规则叁角形,细胞质向外伸出两叁个长短不同的突起,胞浆丰富、胞膜边界清晰、核仁多以成双出现大小均等。(2)用CCK-8法检测各组HSFs增殖活性结果,与空白对照组相比,不同浓度ASMq组以及阳性对照组5-Fu组的HSFs增值活性明显降低,其差异具有统计学意义(p<0.05)。(3)用流式细胞技术检测各组HSFs细胞凋亡结果,与空白对照组凋亡率为2.2%±0.59%,不同浓度ASMq实验组凋亡率分别为14.1%±3.87%,23.5%±3.22%,38.8%±3.14%,43.7%±2.58%；ASMq组凋亡率明显高于对照组,且凋亡率随ASMq浓度增加呈递增趋势。(4)ASMq对HSFs细胞周期的影响结果,与空白对照组比较,不同浓度ASMq组HSFs在G2/M期细胞比例呈不同程度升高,具有浓度依赖性,即在0.1-1.0mg/ml浓度间,随着ASMq浓度增加,GR/M期细胞比例从13.1%增加到29.5%,差异具有统计学意义(p<0.05)。(5)ASMq干预增生性瘢痕来源的成纤维细胞迁移实验结果。与空白组相比,实验组分别在0h、24h、48h后,增生性瘢痕的成纤维细胞迁移能力随着时间的延长而逐渐减弱(p<0.05)。(6)ASMq对HSFs超微结构的影响结果,从低倍和高倍镜观察到：0.4mg/ml组的成纤维细胞的细胞核消失；0.7mg/ml组成纤维细胞膜出现收缩;1mg/ml组成纤维细胞出现凋亡小体相对空白组。第叁部分,通过体外对不同浓度ASMq干预后的增生性瘢痕来源成纤维细胞基于TGF-β/Smad通路分析,结果显示ASMq可以抑制TGF-β1的表达,促进抑制型Smad7的表达。在分子生物水平方面,通过RT-PCR的检测方法和western-blot检测方法。(1)ASMq对成纤维细胞TGF-β1mRNA表达的影响结果,与空白组对比,AMSq随着药物浓度的增加,TGF-β1mRNA表达量减少(P<0.05)。(2)ASMq对成纤维细胞Smad7mRNA表达的影响结果,与空白组对比,ASMq随着药物浓度的增加Smad7mRNA表达量增加(P<0.05)。(3)ASMq对成纤维细胞TGF-β1蛋白表达的影响结果,与空白组对比,ASMq随着药物浓度的增加,TGF-β1蛋白表达量减少(P<0.05)。(4)ASMq对成纤维细胞Smad7蛋白表达的影响结果,与空白组对比,ASMq随着药物浓度的增加Smad7蛋白表达量增加(P<0.05)。结论：灌胃给药ASMq可以在一定程度上抑制兔耳增生性瘢痕的发生发展,且在一定浓度范围内具有浓度梯度依赖性,其通过抑制胶原合成和成纤维细胞增殖途径发挥作用。在一定浓度范围内,ASMq具有抑制人增生性瘢痕来源成纤维细胞增殖、促进细胞凋亡的作用；细胞超微结构分析结果显示ASMq具有抑制成纤维细胞原胶原合成,抑制细胞亚结构(如内质网、核糖体、线粒体等)活性,促进细胞凋亡等作用。ASMq可以抑制人增生性瘢痕来源成纤维细胞TGF-p1的表达,促进抑制型Smad7的表达。综上表明ASMq可以基于TGF-β/Smad通路抑制成纤维细胞增殖、促进细胞凋亡以及抑制胶原表达,从而抑制增生性瘢痕的发生发展,为增生性瘢痕的防治提供了新的思路。
谷庆阳[6]2003年在《bFGF对辐射诱导的血管内皮细胞凋亡的调控作用及其信号转导机制研究》文中研究说明血管内皮细胞是对射线较为敏感的细胞。电离辐射可诱导血管内皮细胞凋亡，导致血管功能障碍、出血以及新血管生成困难，从而与多种放射损伤性疾病及并发症(如放射性皮肤溃疡等)的发生发展密切相关。文献报道促血管生成因子bFGF对辐射诱导的血管内皮细胞凋亡具有明显的抑制作用，可部分或完全逆转辐射诱导的血管内皮凋亡，但其机理尚不清楚。深入研究bFGF对辐射诱导的血管内皮细胞凋亡的调控作用及其信号转导机制，对于多种放射性疾病的机理和治疗研究，以及提高肿瘤放疗的效果并寻找新治疗靶点均具有重要的意义。 目前认为bFGF主要通过激活Ras／MAPK和PI3K／Akt等信号转导途径调节血管内皮细胞的迁移、增殖、存活和分化，促进新血管生成。但bFGF是否通过这2条途径抑制辐射诱导的血管内皮凋亡尚不清楚。本研究采用原代分离培养的人脐带静脉内皮细胞及人脐带静脉内皮细胞株ECV304等作为细胞模型，通过多种方法证实bFGF通过FGFR／Ras／MEK／MAPK／Rsk2／Bad(serine112)途径和FGFR／PI3K／Akt／Bad(serine136)途径抑制辐射诱导的血管内皮细胞凋亡。主要结果如下： 1．bFGF可通过FGFR／Ras／MEK／MAPK／Rsk2／Bad(serine112)途径抑制辐射诱导的血管内皮细胞凋亡，且bFGF诱导受照射的血管内皮细胞中转录因子CREB的激活(at serine 133位点磷酸化) 我们采用γ射线照射法建立了电离辐射诱导血管内皮凋亡的细胞模型，发现照射剂量为10Gy、照后24h检测细胞凋亡率较高。应用bFGF可明显抑制辐射诱导的血管内皮细胞凋亡，并且此抑制作用部分通过Ras／MAPK途径介导：(1)bFGF可诱导受照射的血管内皮细胞中FGFR、MEK和p44／42 MAPK的磷酸化(激活)。(2)MEK的抑制剂U0126和PD98059可阻断Ras／MEK／MAPK途径的活化，并部分，阻断bFGF的抗凋亡作用。U0126和PD98059未能完全阻断bFGF的抗凋亡作用，提示bFGF可能还通过其它的信号通路如PI3K／Akt等途径抑制辐射诱导的血管内皮细胞凋亡。(3)转染突变的Rsk2(DN Rsk2)可干扰bFGF的抗凋亡作用，表明bFGF的抗凋亡作用通过Rsk2介导。(4)进一步研究证实，bFGF诱导受照射的血管内皮细胞中促凋亡蛋白Bad在serine 112位点的磷酸化及转录因子CREB在serine 133位点的磷酸化。MEK的抑制剂可阻断bFGF诱导的Bad serine 112磷酸化，表明bFGF诱导的BAD serine 112磷酸化是通过MAPK-Rsk2信号介导的。 (5)MAPK途径依赖的Bad serine 1 12磷酸化可诱导BAD一Bel·XL二聚体解离，抑制MAPK途径可增加BAD一Bcl一XL二聚体的形成。表明依赖MAPK途径的Badserine 112磷酸化参与了bFGF的抗凋亡作用。上述结果表明bFGF通过Ras脱EK刀讨AP凡叹skZ旧ad(serinell2)途径抑制辐射诱导的血管内皮细胞凋亡。提示在放射性皮肤溃疡的治疗中Ras乃姓APK途径的激活具有重要的作用，可抑制溃疡组织中的血管内皮凋亡、促进新血管生成。在肿瘤血管内皮细胞中，Ras舰APK途径也可作为提高肿瘤放疗效果的潜在靶点，抑制Ras舰APK途径可促进辐射诱导的肿瘤血管内皮凋亡。 2.bFGF主要通过FGFR了PI3E口Akt忍ad(serinel36)途径抑制辐射诱导的血管内皮细胞凋亡 PI3KjAkt信号途径是一条重要的血管内皮凋亡抑制途径。我们发现在介导bFGF抗辐射诱导的血管内皮凋亡作用方面，PI3K/A欠t途径较Ras/MAPK途径更为重要。(1) bFGF可引起受照射的血管内皮细胞中PI3K/Akt途径的激活，包括诱导FGFR磷酸化、激活PI3K的活性及诱导Akt在serine 473位点的磷酸化。(2)PI3K的抑制剂W brtmannin和LY294002完全阻断了bFGF对辐射诱导的血管内皮细胞凋亡的抑制作用，转染突变的Akt同样阻断了bFGF的抗凋亡作用。(3)发现bFGF明显促进受照射后的血管内皮细胞中Bad蛋白的磷酸化(at serine 136)。抑制PI3K信号可阻断bFGF诱导的Bad serine 136磷酸化，表明在受照射的血管内皮细胞中，bFGF诱导的Bad serine 136磷酸化是由PI3K/Akt信号途径介导的。上述结果显示bFGF通过PI3E了AkL旧ad(serine136)途径抑制辐射诱导的血管内皮细胞凋亡。提示在放射性皮肤溃疡的治疗中PI3幻从t途径的激活具有重要的作用，可促进溃疡组织中的新血管生成。在肿瘤组织的血管内皮细胞中，PI3玲Akt途径可作为提高肿瘤放疗效果的重要靶途径，抑制PI3K/Akt途径可促进辐射诱导的肿瘤血管内皮凋亡。 结论:(l)电离辐射可诱导血管内皮细胞凋亡。(2) bFGF可抑制辐射诱导的血管内皮细胞凋亡。(3) bFGF主要通过PI3E丫A火t途径抑制辐射诱导的血管内皮细胞凋亡。(4)bFGF可通过FGF凡叹as舰EK/MAPK/RskZ侣ad(serinellZ)途径抑制辐射诱导的血管内皮细胞凋亡，且bFGF诱导受照射的血管内皮细胞中转录因子cREB的激活。在放射性肺纤维化的发生发展或放射性皮肤溃疡的治疗中这两条途径的激活均具有重要的作用。在肿瘤组织的血管内皮细胞中，Ras彻APK途径和PI3刃Akt途径均可能作为提高肿瘤放疗效果的潜在靶点。
张选奋[7]2001年在《PKC、PKA和PTK在TGF-β_1或IFN-γ影响增生性瘢痕成纤维细胞增殖和胶原合成中的介导作用》文中进行了进一步梳理增生性瘢痕（HS）是多种生长因子等刺激成纤维细胞、血管内皮细胞、血管平滑肌细胞和角质形成细胞增殖和合成过多细胞外基质的结果，生长因子如何调控这些细胞的行为尚不完全清楚。本文研究了PKC、PKA和PTK在HS和瘢痕疙瘩（K）组织活性变化和及其TGF-β_1或IFN-γ影响增生性瘢痕成纤维细胞增殖和合成胶原中的介导作用。 首先利用~(32)P掺入底物法测定了HS、K、成熟瘢痕（MS）和正常人皮肤组织（NS）（各6例）以及3例增生程度降低的增生性瘢痕（LHS）组织中PKC、PKA和PTK的活性。结果发现PKC和PTK活性依次为：K＞HS＞LHS＞MS和NS（p＜0.001），MS和NS间无差异（p＞0.05）；PKA活性在各种组织间无差异（p＞0.05）；提示PKC和PTK介导细胞增殖和合成胶原的信号；而PKA活性无变化提示瘢痕增生与PKA介导的抑制作用没有发挥有关。 然后，我们利用~(32)P掺入底物法测定TGF-β_1或IFN-γ刺激前后HS（4例）和NS（4例）成纤维细胞（HS-FB和NS-FB）中PKC、PKA和PTK的活性；使用计数法和MTT法测定细胞增殖能力，~3H-脯氨酸研究掺入法和放射免疫法测定胶原合成能力。 研究PKC在TGF-β_1或IFN-γ对HS-FB和NS-FB增殖和合成胶原中的介导作用时，发现PKC活化剂（磷脂酰丝氨酸、二酰基甘油和Ca~(2+)）和TGF-β_1对细胞增殖和胶原合成有刺激作用（30min-60min时P＜0.05），而GF109203 X（GF109）则起抑制效应（60min后p＜0.05）；GF109有部分阻断TGF-β_1的作用（与TGF-β_1比较p＜0.05）；TGF-β_1可使NS-FB和HS-FB的PKC活性逐渐升高，刺激120min时尚未恢复（30min后p＜0.05），GF109可以阻 第四军医大学博士学位论文 断 TGF 61活化 PKC；提示 TGF－sl的刺激作用部分经 PKC通道 转导。而IFN．Y首先短暂升高两种细胞的增殖和合成胶原能力 ＊乃0min时卜而后降低，但是，单个细胞的合成能力升高后没有 恢复（与刺激前比较p＜0．05入IFN－p对HSIB的抑制作用强于 ＊｝FB：IFN－Y刺激后P＊C活性也有先升高后降低的变化（＊s．FB： 30min时p＜0＊5，60min时p＜0．of；而NS＊B仅30min时p＜0．05； 120min时即恢复刺激前水平p＞0刀5人GF109能逆反IFN－Y的短 期刺激作用中功刀5L 但不影响抑制效应。提示fNfN－Y的短期刺 激作用部分经由抑制PKC通道转导而长期的抑制效应似乎与PKC 活性无关；结果还提示激活或抑制PKC分别能增加或抑制FB增 殖和合成胶原。 存探讨PKA存TGF．日；或IFN．Y刺激或抑制HSFB和NSFB 增殖和合成胶原中所起的信号转导作用时，结果发现CAMP能抑 制细胞增殖（60＊ifl后 p＜0＊5），H7的作用与 TGF pl相似 （30ffiif 后p＜0刀5），且H7可增强TGF pl的作用（30－60ITlill时p＜0刀5）。 TGF－pl刺激后，NSFB的PKA活性短暂升高后很快恢复（但 p＞0．05），HS＊B则在30－60mifl降低（p＜0刀5），60＊in后恢复；结 果提示TGF pl刺激两种细胞后PKA的活性变化存在一定差异： 活化PKA则可以逆转TGF小l的作用。而H7可加强IFN－Y的短 期刺激作用（但p列刀5）并部分逆反IFN－Y的抑制作用中＜0刀5人 但IFN－Y可以激活两种细胞的PKA“0min后p功刀5人提示IFN－ Y的抑制作用部分经PKA通道转导：活化PKA能抑制＊丁＊B和 HSfB增殖和合成胶原。 在研究PTK与TGF pl或IFN－Y刺激或抑制HSfB和NSFB 增殖和合成胶原关系时，结果发现TGF pl刺激后细胞增殖和合成 胶原呈时间依赖性升高，单个HS＊B 合成胶原的能力更强 （p＜0＊ 1），Genistein既无此刺激作用（p＞0＊5），也不能阻断 TGF el的刺激效应；同时 TGF el也不能活化两种细胞的 PTK：结果 提示：在FB中，PTK不介导TGF el的信号。而IFN－Y在轻度 地升高两种细胞的 PTK活性中＞0．05）的同时（但 HS－FB高于 NSfB p刃刀5＊对细胞生物学行为的影响可被 Genistein逆转：提 示IFN－Y信号不仅经活化PTK转导，而且还经其它通道转导。 上述研究中还发现：在 TGF pl或 IFN－Y刺激 HS－FB和 NSfB 前后，除了HS－FB的酶活性、增殖和合成胶原能力稍强外，两种 细胞没有显示差异。 最后，在兔耳增生性癫痕模型（5只）上使用PKC、PKA和 PTK的活化剂和抑制剂，以生理盐水为对照，发现注射6次后（注 药20天后）PKC和PTK活化剂组增生明显，而PKA活化剂组增
龙骁[8]2010年在《bFGF、HSP70和HSP90在人深度烧伤变性真皮组织内的表达变化及意义》文中研究说明目的探讨bFGF、HSP70和HSP90在深Ⅱ°或混合度烧伤患者变性真皮组织中的表达变化特征,进一步阐明保留变性真皮修复深Ⅱ°或混合度烧伤创面的理论提供依据。方法实验组选自2008年3月至2009年3月中南大学湘雅医院烧伤整形科15例深Ⅱ°或混合度烧伤患者伤后不同时间手术削痂创面变性真皮组织,对照组选自同期6例整形手术患者腹部供皮区正常皮肤组织,采用免疫组织化学的方法,检测bFGF、HSP70和HSP90的表达,阳性结果判定参照半定量分级评分法,用SPSS 13.0统计软件进行统计分析,组间比较采用方差分析,组间两两比较采用SNK检验,P<0.05表示差异有统计学意义。结果(1)正常人皮肤组织bFGF呈弱阳性或阳性表达,烧伤患者在伤后4d和7d经手术切取的变性真皮bFGF表达增高(与正常组比较,P<0.05),伤后11d及≧14d手术患者变性真皮bFGF表达下降趋向正常。(2)正常人皮肤组织HSP70和HSP90呈弱阳性或阳性表达,烧伤患者在伤后4d、7d及11d经手术切取的变性真皮HSP70和HSP90表达增强(与正常组比较,P<0.05),伤后≧14d手术患者变性真皮HSP70和HSP90表达下降趋向正常。结论bFGF、HSP70及HSP90在人深Ⅱ°或混合度烧伤变性真皮组织中表达水平均增高,bFGF、HSP70及HSP90可能在人深Ⅱ°或混合度烧伤变性真皮的复性和细胞保护方面具有重要作用。
佚名[9]2014年在《第十六届全国神经精神药理学学术会议论文摘要》文中研究表明2014年9月26-29日,浙江温州专题1:痛疼与离子通道药理学T1-01Persistent nociception induces anxiety and depression-like behaviors in rats:role of the HCN channel YANG Lu-jia,ZHANG Shu-zhuo,SUN Yan,LIU Xiao-yan,LI Jin,ZHENG Jian-quan(Institute of Pharmacology and Toxicology,Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100850,China)Abstract:OBJECTIVE To explore the relationship between hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated
王琼[10]2011年在《EGF联合NS398对猫角膜内皮冷冻损伤的修复作用》文中研究指明角膜内皮损伤愈合不良造成角膜混浊和水肿,影响了人的视力,损害了人的身心健康。而人的角膜内皮难以修复,与其它动物(如兔和牛)的内皮细胞能通过有丝分裂促进愈合不同,人、猫和灵长类的细胞有丝分裂能力受房水中TGF-β2抑制,细胞只能通过有限的移行和扩大来填补内皮层受损区,严重的损伤常导致愈合不良。对此,我们将促内皮生长的因子EGF和抗TGF-β2的药物NS398按一定比例分别在猫的体外和体内联合使用,了解它们促内皮层愈合的效率。并在这个过程中,检测TGF-β2的信号蛋白Smad2、内皮肌纤维母细胞的标志蛋白a-SMA和新生内皮细胞的标志蛋白PCNA含量变化。以了解它们促进内皮细胞的再生和减轻内皮层混浊的机理。体外培养猫的角膜内皮细胞,先用MTT法检测不同浓度的TGF-β2对角膜内皮增殖的抑制效果。再将最佳浓度的TGF-β2添加到培养基中,模拟猫体内角膜内皮细胞的生长抑制环境,检测不同浓度的EGF和NS398对受抑制细胞的促增殖效果。最后检测EGF和NS398合用促细胞增殖的最佳浓度以及作用时间。体内建立猫的角膜内皮冷冻损伤模型。以左眼为对照组,右眼为EGF和NS398联合给药组,用免疫组化的方法比较两眼中Sa-SMA和PCNA的含量变化,用台盼蓝-茜素红染色检测并比较二者内皮层的愈合状况。试验结果表明：TGF-β2剂量依赖性的抑制猫角膜内皮细胞增殖,最佳抑制浓度为10ng/mL。无论内皮细胞是否受TGF-β2抑制,EGF的促增殖最佳浓度均为10ng/mL,在10ng/mL TGF-β2、10ng/mLEGF的细胞生长环境中,NS398促增殖最佳浓度为5umol/mL,而且其促增殖效率在第叁天达到顶点。将10ng/mL EGF和5umol/mL NS398在猫的角膜内皮冷冻损伤模型的药物组中联合使用,能有效提高内皮层的愈合效率。修复过程中,相同时间内药物组中未被修复的内皮层面积远低于对照组,到第7天,药物组中的内皮细胞基本覆盖了整个内皮层。各项愈合指标均优于对照组,显示了良好的促愈合趋势。对照组中的Smad2和a-SMA含量远高于药物组,而PCNA的含量比药物组低。通过试验可以得出：10ng/mLTGF-β2体外抑制猫内皮细胞增殖后,10ng/mL EGF和5umol/mL NS398联合给药能显着提高内皮细胞的增殖效率。最佳的作用周期为3天。在体内,药物组NS398能通过降低Smad2的含量,阻断TGF-β2的Smad信号途径,消除了TGF-β2对内皮细胞增殖周期的抑制和促肌纤维母细胞转化的作用。使得药物组新生细胞标志蛋白PCNA的含量高于对照组,而肌纤维母细胞的标志蛋白a-SMA的含量降低。另外,EGF促进内皮细胞移行,与NS398联合使用加快了内皮细胞愈合的速率。
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[10]. EGF联合NS398对猫角膜内皮冷冻损伤的修复作用[D]. 王琼. 华中农业大学. 2011
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