罗杰 梁佳易 李翠娟
石药集团欧意药业有限公司 河北 050000
摘要：目的 通过高效液相色谱法检测方法，来测定软饮料中香兰素和乙基香兰素。方法 在酸性条件下，通过乙腈来提取样品中的香兰素和乙基香兰素，利用盐析作用进行分层净化，配置出标准的混合溶液以备用，用以液相色谱检测。检测波长308nm，外标法定量。结果 香兰素和乙基香兰素在0.5-50.0g/mL浓度范围内线性关系良好，相关系数均大于0.9999。添加水平为5、30、63mg/kg时，香兰素和乙基香兰素的平均回收率分别为98.4%和100.4%，96.7%和100.2%，97.8%和100.3%，相对标准偏差在3.53%~4.70%，检出限均为0.5mg/kg。结论 高效液相色谱法检测方法经济实用，适用性比较强，结果准确可靠，能够用于样品批量快速检测。
关键词：高效液相色谱法；香兰素；乙基香兰素
一、一般资料与方法
1、仪器与试剂
1.1仪器
Agilent1260系列高效液相色谱仪（美国Agilent公司），配有脱气机、四元泵、高效自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器（diodearraydetector，DAD）；电子天平（德国Sartorius公司）；氮吹仪（美国Organomation公司）；涡旋混匀器（德国IKA公司）；离心机（美国Sigma公司）；超纯水仪（美国Millipore公司）。
1.2试剂
乙腈（色谱纯，德国Merck公司）；甲酸（色谱纯，天津科密欧）；氯化钠、乙酸锌（分析纯，天津科密欧）；海砂（粒度0.65~0.85mm，国药试剂）；水为去离子水。香兰素（纯度＞98.0%）购自上海梯希爱化成工发展有限公司，乙基香兰素（纯度＞99%）购自百灵威科技有限公司。
2、方法
2.1标准溶液的配制
标准储备液：分别称取香兰素和乙基香兰素标准物质约50mg，精密称定，置25mL容量瓶中，加乙腈溶解，加甲酸2滴，摇匀，继续用乙腈稀释，定容至刻度，摇匀，得浓度为2mg/mL的标准储备溶液。避光，?4℃冷藏保存，有效期6个月。混合标准中间液：分别准确移取香兰素和乙基香兰素标准溶液适量，置50mL容量瓶中，加乙腈0.1%甲酸水溶液（1：1，v：v）稀释，定容至刻度，摇匀，得浓度为50?g/mL的混合标准中间液。避光，?4℃冷藏保存，有效期3个月。
混合标准工作液：分别移取适量混合标准中间液，乙腈-0.1%甲酸水溶液（1：1，v：v）稀释，制成浓度为0.5、1.0、5.0、10、20、40、50?g/mL的系列标准工作液。临用前现配。
2.2色谱条件
色谱柱：InertsilODS-3（250mm×4.6mm，5?m）；流动相：乙腈-1‰甲酸梯度洗脱，流速1.2mL/min；检测波长：308nm；柱温：25℃；进样量：20?L。
2.3样品提取与净化
2.3.1液态软饮料
准确称取1g样品，置50mL离心管中，加0.1%甲酸水溶液1mL，海砂约1.5g，轻轻涡旋使样品混合均匀。准确加入乙腈5mL，含乳或蛋白质类样品加饱和乙酸锌溶液0.1mL，涡旋提取。加入氯化钠约2g，充分涡旋约2min，8000r/min离心5min。取上清液1mL置玻璃离心管中，40℃水浴中氮气吹干，加1mL流动相定容，涡旋溶解残渣。提取液经微孔滤膜过滤后，供高效液相色谱测定。乳和乳饮料按此步骤处理。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆
2.3.2固体饮料
准确称取0.5g样品，置50mL离心管中，加0.1%甲酸水溶液1mL，海砂约1.5g，轻轻振摇，充分浸润样品。加入准确5mL乙腈，氯化钠约2g，充分涡旋约2min，8000r/min离心5min。取上清液1mL置玻璃离心管中，40℃水浴中氮气吹干，加1mL流动相定容，涡旋溶解残渣。提取液经微孔滤膜过滤后，供高效液相色谱测定。
二、结果与讨论
1、检测波长的选择
利用二极管阵列检测器紫外全扫描显示，香兰素和乙基香兰素的?max均为278nm，其次为308nm；实际样品检测显示，检测波长为278nm时，在目标峰附近部分样品存在干扰，而308nm的谱图干扰少，且吸收强度与λmax相差不多，因此检测波长定为308nm，278nm谱图为辅助判别。
2、流动相的选择
香兰素和乙基香兰素在C18色谱柱上有较好的保留，流动相选洗脱能力较强的乙腈。分别考察了乙腈-水和乙腈-0.1%甲酸流动相体系，实验显示在相同洗脱条件下，当水相含有酸时，色谱峰峰形好、响应值高，分离度好，达到完全分；当水相中不加酸时，色谱峰峰宽较大、响应值相对低，分离度虽满足检测但香兰素色谱峰拖尾。香兰素和乙基香兰素结构中的酚羟基具有酸性，水溶液为弱酸性。流动相中加入酸改变了溶液pH值，抑制了目标化合物的解离，增强其在色谱柱上的保留，改善了色谱峰峰形的同时提到分离度，并提高了信号强度。
3、标准溶液的配制
香兰素和乙基香兰素的标准储备液均由乙腈稀释定容，因为二者都有水溶性，中间液和标准工作液最初以乙腈-水（1：1，v：v）稀释。研究过程中发现，低浓度样品1?g/mL溶液在棕色进样瓶中常温避光放置2~3d后，即检测不到两种化合物。后改用甲酸溶液稀释定容，持续观测，发现工作液至少可以稳定1周。化合物结构分析显示，芳香醛基团和酚羟基具有还原性，能够与强、弱氧化剂和氧气发生氧化-还原反应，其中醛基C更易发生亲核反应，C—H键最不牢固，故香兰素氧化反应易发生在醛基上。这一特性使香兰素具有较强的抗氧化活性。在中性或碱性溶液中，醛基被氧化，化合物结构发生变化，导致吸收波长发生变化，从而在原保留时间处检测不到原色谱峰。溶液中加入酸能抑制亲核反应，阻断氧化反应的发生。因此配制标准储备液时需加入甲酸，标准中间液和工作液用含甲酸的流动相定容。为维持待测物的稳定，提取液或定溶液应为酸性，应尽量避免或减少待测物在碱性溶液中存留的时间，防止氧化反应的发生。如果定溶液为pH值为中性，应及时测定含量。
4、提取方法的优化
如果液体或固体饮料直接用乙腈-甲酸溶液，提取会引起溶液体积变化，从而导致检测结果偏低或偏高，并且提取液未经过净化，杂质和糖的含量较高，可能会干扰检测，计划用液液分配的方法进行净化。0.1%甲酸溶液起到浸润和稀释样品的作用，同时酸性条件下有利于待测组分稳定和提高乙腈的提取效率。对含乳制品或蛋白含量高的样品入饱和乙酸锌沉淀蛋白；为使样品混合均匀，提取中还加入海砂，进一步研磨、混匀样品。溶液pH<3时，香兰素和乙基香兰素多以游离酸状态存在，在盐析作用下进入乙腈层。与QuEChERS法不同的是，本实验方法中乙腈提取后不需要加除水剂脱水，取乙腈层适量，吹干、定容即可，可以认为本方法是改良的QuEChERS法。提取液经过改良QuEChERS法提取后，脱色效果明显，色素部分基本留在水层，色谱图显示极性组分明显减少，而待测物回收率基本未发生变化。认为改良QuEChERS法即能排除体积变化对检测结果的干扰，又能很好的提取和净化样品。
5、软饮料样品的测定
应用本方法对收集的乳饮料和软饮料类样品进行香兰素和乙基香兰素的定量分析，检出情况及含量水平。本研究中共收集到50个乳饮料和饮料，除矿泉水外，基本覆盖软饮料种类。检出香兰素11个，其中超使用限量3个，另有一个含量临近限量值；检出乙基香兰素4个，超使用限量3个。奶香味浓郁饮料中往往含量香兰素或乙基香兰素。应当注意，在若干儿童乳饮料中基本不含待测物，但9号样品同时含有香兰素和乙基香兰素，且二者含量紧邻限量值，不利于儿童身体健康。儿童食品应更加注意添加剂的使用，这种做法虽未违反国家规定但并不可取。
参考文献：
[1]林灵超，吴方圆.高效液相色谱法同时测定牛奶中的香兰素与乙基香兰素[J].化学分析计量，2013，02：60-62.
[2]刘祥萍，黄薇.高效液相色谱法同时测定食品中的甲基香兰素和乙基香兰素[J].中华预防医学杂志，2006，04：296-297.
[3]于加平，刘强.高效液相色谱法测定发酵液中的香兰素[J].吉林农业科技学院学报，2005，02：4-6.
论文作者:罗杰,梁佳易,李翠娟
论文发表刊物:《健康世界》2015年5期供稿
论文发表时间:2015/10/23
标签：乙基论文; 香兰素论文; 色谱论文; 溶液论文; 样品论文; 甲酸论文; 高效论文; 《健康世界》2015年5期供稿论文;