韩清泉[1]2013年在《rAAV2介导GDNF联合早期康复训练治疗大鼠脊髓损伤的实验研究》文中认为研究目的：本实验以雄性SD大鼠为研究对象，造模后应用rAAV2介导GDNF联合早期康复训练对脊髓损伤的大鼠进行实验研究，采用运动学评分、组织形态学和免疫组化等技术，通过分析脊髓损伤大鼠在不同时间点后肢运动功能的变化、损伤脊髓处GDNF的蛋白表达、运动神经元形态和数量的变化等，比较早期康复训练、基因治疗以及这两种因素的联合作用对脊髓损伤大鼠恢复的影响。研究方法：本实验采用了rAAV2介导GDNF基因治疗、早期康复训练及两者联合叁种方法对脊髓重物打击造模后的大鼠进行干预：雄性SD大鼠90只，随机分为假手术组（n=18）、自然愈合组（n=18）、基因治疗组（n=18）、康复训练组（n=18）、联合治疗组（n=18），其中每组按照取材时间点不同随机分为造模后7d组（n=6）、14d组（n=6）、21d组（n=6）。对基因治疗组、联合治疗组大鼠造模成功后24h注射携带有人GDNF基因的重组腺相关病毒。对康复训练组、联合治疗组大鼠在造模成功后第3d开始早期康复训练。测试方法与指标：①通过BBB评分、斜板实验来评价脊髓损伤大鼠运动功能的改善。②HE染色观察损伤后大鼠脊髓运动神经元、神经胶质细胞的形态数量变化。③荧光显微镜下观察rAAV2-GDNF-GFP在损伤脊髓处的表达。④免疫组化实验采用SABC（StreptAvidin-Biotin Complex）试剂盒来检测损伤脊髓组织中GDNF的抗原分布，观察GDNF的蛋白表达。研究结果：①运动学评分得出对脊髓损伤大鼠运动功能的恢复，康复训练组的效果好于基因治疗组，且7d时有显着性差异（P<0.05），14d、21d时有非常显着性差异（P<0.01）。②HE染色切片观察得出对运动神经元的保护作用，基因治疗组要好于康复训练组，且在第7d时有显着性差异（P<0.05）。③免疫组化的结果表明康复训练组的GDNF平均光密度值高于自然愈合组，且第7d时有显着性差异（P<0.05），14d、21d时有非常显着性差异（P<0.01）。④运动学评分、损伤后运动神经元存活的数量、rAAV2-GDNF-GFP感染效率及GDNF的蛋白表达，联合治疗组的效果是最好的，且与其它各组相比，在7d、14d均有显着性差异（P<0.05）。研究结论：①rAAV2-GDNF-GFP在细胞水平上具有感染293T细胞能力并且可以表达GDNF蛋白，在组织水平上，损伤区脊髓组织中GDNF在转录和蛋白水平均有表达，其中14d时平均光密度值是最高的。②早期康复训练可以使大鼠后肢的运动功能得到明显的改善，在7d-14d恢复较快，并且对损伤大鼠脊髓中的GDNF表达有促进作用，在14d时效果最明显。③rAAV2介导的GDNF基因治疗能保护受损的脊髓前角运动神经元，显着提高损伤脊髓处GDNFmRNA和蛋白的表达水平，对脊髓损伤大鼠后肢功能的恢复有促进作用。④联合治疗在促进大鼠后肢运动功能的恢复、对损伤脊髓前角运动神经元的保护作用及GDNF在损伤脊髓区的表达效果都是最好的，多种方法联合治疗是脊髓损伤治疗的发展趋势。
鲁凯伍[2]2001年在《GDNF基因治疗大鼠脊髓损伤实验研究》文中提出本研究通过克隆大鼠 GDNF cDNA，并将其与真核表达载体 pEGFP-C3相连接，在国内外首次构建了大鼠在体转基因重组质粒pEGFP-GDNF，利用EGFP的发光性，为GDNF基因转染后在活体细胞中表达的动态观察建立了新的报告基因。借助多价阳离子脂质体DC-Chol 介导，在国内外首次成功的将pEGFP-GDNF基因导入正常大鼠中胸段脊髓组织中并得到良好表达。由于GDNF的 N端缺失11个氨基酸残基后并不影响 GDNF的神经营养活性。本实验设计将EGFP基因融合在GDNF基因的5’端，并且两者之间以编码柔软肽段的核昔酸连接以保持EGFP与GDNF各自的活性。这样既保留了GDNF蛋白的神经营养活性，又能通过EGFP观察GDNF蛋白在体内的表达。本研究首次发现在大鼠急性脊髓重度压迫损伤后经蛛网膜下腔局部给予 GDNF蛋白 10μg／日能减少胶质细胞增生，促进脊髓损伤区大鼠皮质脊髓束轴突再生和神经骨架蛋白的修复，并能有效促进损伤大鼠后肢运动功能的早期恢复。应用脂质体介导体内基因转染法将GDNF基因导入脊髓损伤大鼠伤区，1周后发现GDNF基因在损伤区脊髓组织中在转录和蛋白水平均有表达。首次观察到GDNF体内转染能减少脊髓损伤区前角运动神经元死亡的数目，降低脊髓前角运动神经元中胆碱酯酶及酸性磷酸酶变化的幅度，显着减少损伤区轴突丧失并促进近端皮质脊髓束再生并通过损伤区，且能有效地促进SCI大鼠后肢运动功能恢复。本研究为将来观察其它神经营养因子对脊髓损伤治疗作用建立了良好的基因治疗方法。
刘钦毅[3]2007年在《壳聚糖纳米粒子胶质细胞源性神经营养因子基因复合体在脊髓损伤中应用的实验研究》文中研究指明目的:构建GDNF真核表达载体,制备壳聚糖纳米粒子,研究壳聚糖纳米粒子载GDNF基因在脊髓继发性损伤中的作用,为治疗脊髓损伤寻找新的途径。方法:首先应用RT-PCR、基因测序、分子克隆获得pcDNA3.1/GDNF质粒。同时制备壳聚糖纳米粒子,并对壳聚糖纳米粒子作为基因载体的相关性能进行检测。在体外实验中,壳聚糖纳米粒子载质粒GDNF基因从细胞外转入胶质细胞内,并在细胞内表达GDNF蛋白,进行细胞免疫化学,细胞增殖试验,流式细胞仪以及Westernblot检测;在体内实验中,首先制作脊髓损伤模型,将壳聚糖纳米粒子GDNF基因复合体(CS-nano/pcDNA3.1/GDNF)转入损伤的脊髓,应用免疫组化、实时RT-PCR半定量技术检测GDNF的表达,并进行细胞凋亡检测(TUNEL法)。结果:(1)成功构建大鼠GDNF真核表达载体;(2)制备壳聚糖纳米粒子,壳聚糖性能稳定,对GDNF有很好的保护作用;(3)体外实验中,壳聚糖纳米粒子载质粒GDNF基因能高效表达GDNF,促进细胞增殖,减少细胞凋亡;体内实验中,壳聚糖纳米粒子载质粒GDNF基因能够促进脊髓损伤局部高效表达GDNF,减少细胞凋亡。结论:1、壳聚糖作为基因细胞穿梭载体,对质粒GDNF基因有很好的保护作用,并能将GDNF基因转入细胞内,高效表达GDNF,是一种有效的基因载体细胞穿梭系统。2、GDNF在神经细胞高效表达后能对受损的脊髓组织起到很好的保护作用,促进细胞增殖,减少细胞凋亡,是一种功能很强的神经营养因子。
彭玉颖[4]2007年在《大鼠胶质细胞源性神经营养因子克隆及表达的研究》文中认为胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor GDNF)是1993年被发现的对多巴胺能神经元有特异性营养作用的一种神经营养因子，结构显示它是TGF-β超家族中的一个新的成员。自GDNF被发现以后，众多学者对其结构、分布、功能与作用进行了大量的研究，并取得了相当有意义的成果，同时GDNF在治疗神经系统疾病方面被广泛研究，包括对帕金森氏病(PD)、脊髓侧索硬化症(ALS)及其他神经变性疾病等领域的研究，其中PD的病理基础已经明确，是由于选择性多巴胺能神经元丧失导致多巴胺缺乏所致，目前认为，基因治疗可能是实现治疗PD这一目标的最佳途径，而对PD等疾病的治疗手段包括药物治疗和各种外科手术、脑组织移植等均只限于暂时的症状改善，不能从根本上延缓或阻止其病程进展，理想的治疗方法除了要纠正其脑内DA含量的不足，还要保护残存的DA能神经元。迄今为止，国内外的基因治疗研究探索主要集中于两个方向，一是通过给予各种神经营养因子或抗凋亡分子基因，研究其对DA能神经元的保护作用；二是通过给予酪氨酸羟化酶(TH)基因，提高DA的合成。国内外研究表明了GDNF是最强有力的保护因子，GDNF基因的有效表达可以减缓、阻止甚至逆转DA能神经元的退行性病变过程，为此我们克隆了大鼠GDNF全长基因，主要采用分子克隆、细胞培养和动物肌肉表达等研究方法，将GDNF基因分别构建入原核表达载体pET32a和真核表达载体pEGFP-C1，通过IPTG诱导法和离体细胞转染法研究证实其具有明确的转基因生物活性后，再将真核重组表达质粒pEGFP-GDNF注射到小鼠后肢股四头肌内，初步了解其体内表达情况，以此寻找基因治疗的最佳途径。主要研究方法和结果如下：1．从2日内大乳鼠脑组织中提取总RNA，参照分子克隆指南稍作修改，合成cDNA第1、2链，加入引物通过PCR扩增目的基因，得到636bp的目的片段后，克隆到pMD18-T载体中，得到重组pMD18-T-GDNF。2．将GDNF克隆到pGEM-T载体中，得到重组pGEM-T-GDNF；将重组质粒pGEM-T-GDNF、pET32a原核表达载体及pEGFP-C1真核表达载体进行BamHI、XhoI双酶切，构建重组表达质粒，然后对重组表达质粒进行酶切鉴定、PCR鉴定并测序验证。3．将鉴定正确的原核重组表达质粒转入BL21(DE3)中进行表达，并采用SDS-PAGE、Western-blot等方法对表达产物进行鉴定。4．以阳离子聚合物法将真核重组表达质粒转染入中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达，通过RT-PCR、免疫细胞化学技术及荧光显微镜观察来确定转染效率。5．将pEGFP-GDNF注射入BABL／c小鼠后肢肌肉内，通过荧光显微镜和免疫组织化学方法观察体内表达情况。结果：①GDNF基因的克隆从新生大鼠脑组织中成功提取总RNA反转录cDNA后，PCR扩增的GDNF目的基因为636bp，与克隆载体连接构建克隆重组质粒，经酶切鉴定得到一条与目的基因大小一致的条带和一条载体带，测序后发现，目的基因序列与Genebank上发表的GDNF基因序列完全一致。②GDNF基因的原核表达为了获得GDNF基因的表达产物，成功将克隆质粒亚克隆至原核表达载体pET32a中，重组原核表达质粒经IPTG诱导后在蛋白电泳图谱可以看到明显的目的蛋白条带，Western-blot的特异条带也验证了这一点。③GDNF基因的真核表达成功将克隆质粒亚克隆至pEGFP-C1真核表达载体中，将真核重组表达质粒转染CHO细胞后，经RT-PCR鉴定和荧光显微镜观察发现，细胞液经扩增得到目的条带，在荧光显微镜下经蓝光激发，可以观察到CHO细胞胞浆内呈现绿色荧光，将小鼠后肢肌肉的石蜡切片进行胰蛋白酶抗原修复后，在荧光显微镜下观察到散在的绿色荧光，免疫组化染色可以看到肌纤维细胞周围有黄色的斑点，以上结果提示EGFP基因及GDNF基因的进一步表达，说明目的基因片段已成功表达。结论：①本研究利用分子生物学技术，成功的克隆了大鼠GDNF基因，测序结果证明与Genebank发表的序列完全一致。②将克隆至pGEM-T载体中的GDNF基因亚克隆至原核表达载体pET32a中，并在E．coliBL21(DE3)中进行表达。经SDS-PAGE和Western-blot分析，表明目的基因获得了表达。③将重组质粒pGEM-T-GDNF中的GDNF基因亚克隆至pEGFP-C1真核表达载体中，成功的构建出真核重组表达质粒pEGFP-GDNF，以阳离子聚合物介导法将真核重组表达质粒pEGFP-GDNF转染至CHO细胞中，通过RT-PCR检测法、荧光检测法和免疫细胞化学检测法证实GDNF基因在哺乳动物细胞中获得了表达。再将真核重组表达质粒pEGFP-GDNF注入BALB／c小鼠后肢肌肉中，同时设pEGFP-C1对照组，通过荧光检测法和免疫组织化学检测法证实了GDNF基因在小鼠肌肉中获得了表达。原核和真核重组表达质粒的成功构建，为进一步获得重组活性的GDNF蛋白和神经系统疾病的基础和临床的基因治疗研究奠定了基础。
陈茂华[5]2014年在《HIF-1α基因及GDNF基因修饰神经干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤的研究》文中进行了进一步梳理研究目的：探讨经HIF-1α、 GDNF基因修饰的神经干细胞(NSCs)在大鼠脊髓内移植后,神经干细胞的存活和分化情况及其对动物运动功能恢复的影响。为脊髓损伤的基因治疗提供新思路及实验依据。研究方法：采用电控大鼠脊髓损伤打击装置制作SD大鼠脊髓损伤模型95只,25g·c(2.5cm×10g)力致伤T13脊髓,随机分为4组：正常对照(Normal)5只,脊髓损伤组(SCI)30只,神经干细胞移植组(NSC)30只, HIF-1α、GDNF双基因修饰的神经干细胞移植组(HIF-1α、GDNF+NSC)30只,分别于移植后5个时相点(1周、2周、3周、5周、8周)对大鼠进行BBB后肢功能评分和皮层体感诱发电位(cortical somatosensory evoked potential, CSEP)检查后,进行灌注固定,取损伤段脊髓做石蜡切片,运用HE染色、免疫组化、免疫双标检测等方法,通过观察移植处神经干细胞的标记物5-溴-2-脱氧尿苷(bromodeoxy uridine/5-bromo-2-deoxy uridine,BrdU)的表达,观察神经丝-200(NF-200)的表达和观察GFAP+BrdU、NF-200+BrdU双重染色的表达结果,分析HIF-1α、GDNF基因修饰神经干细胞的存活、分化情况,进而分析HIF-1α、GDNF双基因修饰的NSC对脊髓损伤的修复作用。实验结果：1.H-E染色显示,损伤组脊髓损伤后损伤区及中央管内、灰质中不同程度出血,神经元变性,脊髓前索、侧索的轴索粗肿胀,坏死缺损区域形成；HIF-1α、GDNF双基因修饰神经干细胞组移植治疗后,出血、坏死等损伤性改变持续时间缩短,细胞残留数目相对增多,尼氏体增加,形态大致正常的细胞数目较多,相同时间点与其它组相比较差异明显。2.BrdU免疫组化染色结果发现,细胞移植组在细胞移植处,均有BrdU染色阳性细胞存在,表明移植细胞在宿主体内可以存活,比较单纯神经干细胞移植组与HIF-1α、GDNF基因修饰神经干细胞移植组BrdU染色阳性细胞数,基因修饰组明显多于单纯神经干细胞组(P<0.05),双基因修饰神经干细胞在宿主内存活的数量增加；免疫双标检测结果,在单纯神经干细胞移植组与HIF-1α、GDNF基因修饰神经干细胞移植组均有GFAP+BrdU和NF-200+BrdU双染阳性细胞；分析双染阳性细胞数占所有BrdU染色阳性细胞数的比例,移植后同一时间点,HIF-1α、GDNF双基因修饰神经干细胞组神经干细胞分化率高于单纯神经干细胞组(P<0.01)；NF-200染色,正常组脊髓白质可见轴突阳性着色,排列整齐密集,损伤组NF-200阳性轴突灰度值降低；HIF-1α、GDNF基因修饰神经干细胞组与神经干细胞组相比,移植后相同时间,NF-200灰度值均明显增高,且前者高于后者差异明显(P<0.01)。3.CSEP检查结果：所有被检测大鼠受伤前均获得正常CSEP信号,包括1个负向波,潜伏期(17.1±0.5)ms,波幅(66.4±20.2)μV。受伤后各组动物CSEP信号均不同程度消失,潜伏期延长,GDNF、HIF-1α基因修饰神经干细胞组从移植后第1周开始,大鼠CSEP信号开始出现恢复，但其波幅较伤前及正常组明显下降,潜伏期也明显延迟(P<0.05),与单纯神经干细胞组和损伤对照组CSEP潜伏期恢复有明显差异(P<0.01)。4.所有手术组动物BBB评分,移植后BBB评分逐渐升高,移植后同一时间点,NSC+GDNF、 HIF-1α组评分高于SCI和NSC组,结果差异明显(P<0.01)。结论：1.GDNF、HIF-1α基因修饰神经干细胞能在损伤脊髓内可以存活。2. GDNF、HIF-1α基因修饰神经干细胞能在损伤脊髓内可以分化为神经元和神经胶质细胞。3. GDNF、HIF-1α基因修饰神经干细胞移植较单纯神经干细胞移植可以增加干细胞的存活和分化。4. GDNF、HIF-1α基因修饰神经干细胞移植能促进脊髓损伤动物运动功能的恢复。5. GDNF、HIF-1αt基因修饰神经干细胞可以作为脊髓损伤修复的移植材料。
韩清泉, 沈勇伟, 张春[6]2014年在《rAAV2介导GDNF联合早期康复训练治疗大鼠脊髓损伤的实验研究》文中进行了进一步梳理目的:对雄性SD大鼠在脊髓损伤(SCI)造模后应用rAAV2介导GDNF联合早期康复训练进行实验研究,通过分析SCI大鼠在不同时间点后肢运动功能的变化、损伤脊髓处GDNF的蛋白表达、运动神经元形态和数量的变化等,比较早期康复训练、基因治疗以及这两种因素的联合作用对SCI大鼠恢复的影响。.方法:采用rAAV2介导GDNF基因治疗、早期康复训练及两者联合叁种方法对脊髓重物打击造模后的大鼠进行干预:雄性SD大鼠90只,体重183.5±12.4g,随机分为假手术组(n=18)、自然愈合组(n=18)、基因治疗组(n=18)、康复训练组(n=18)、联合治疗组(n=18),其中每组按照取材时间点不同随机分为造模后7d组(n=6)、14d组(n=6)、21d组(n=6)。对基因治疗组、联合治疗组大鼠造模成功后24h注射携带有人GDNF基因的rAAV2。对康复训练组、联合治疗组大鼠在造模成功后第3d开始早期康复训练。测试方法与指标:①通过BBB评分、斜板实验来评价SCI大鼠运动功能的改善。②HE染色观察损伤后大鼠脊髓运动神经元、神经胶质细胞的形态数量变化。③荧光显微镜下观察rAAV2-GDNF-GFP在损伤脊髓处的表达。④免疫组化实验采用SABC(StreptAvidin-BiotinComplex)试剂盒来检测损伤脊髓组织中GDNF的抗原分布,观察GDNF的蛋白表达。实验数据采用SPSS17.0统计学软件进行one-wayANOVA检验,显着性水平为P<0.05,非常显着性水平为P<0.01。结果:①运动学评分得出对SCI大鼠运动功能的恢复,康复训练组的效果好于基因治疗组,且7d时有显着性差异(P<0.05),14d、21d时有非常显着性差异(P<0.01)。②HE染色切片观察得出对运动神经元的保护作用,基因治疗组要好于康复训练组,且在第7d时有显着性差异(P<0.05)。③免疫组化的结果表明康复训练组的GDNF平均光密度值高于自然愈合组,且第7d时有显着性差异(P<0.05),14d、21d时有非常显着性差异(P<0.01)。④运动学评分、损伤后运动神经元存活的数量、rAAV2-GDNF-GFP感染效率及GDNF的蛋白表达,联合治疗组的效果是最好的,且与其它各组相比,在7d、14d均有显着性差异(P<0.05)。结论:①rAAV2-GDNF-GFP可感染损伤区脊髓组织,能保护受损的脊髓前角运动神经元,显着提高损伤脊髓处GDNFmRNA和蛋白的表达水平,对SCI大鼠后肢运动功能的恢复有促进作用。②早期康复训练可以使大鼠后肢的运动功能得到明显改善,并且对损伤大鼠脊髓中的GDNF表达有促进作用。联合治疗在促进大鼠后肢运动功能的恢复、对损伤脊髓前角运动神经元的保护作用及GDNF在损伤脊髓区的表达效果都是最好的。
王旭凯[7]2009年在《GDNF基因修饰的雪旺细胞对大鼠脊髓损伤保护作用的实验研究》文中研究指明脊髓损伤(Spinal cord injury, SCI)是外科常见的创伤性疾病,由于创伤后运动神经元的变性和轴突的断裂、降解而导致神经退行性改变或者运动功能的障碍。脊髓损伤后的神经修复一直是困扰医学界的难题。随着分子生物学的发展,基因治疗成为SCI治疗的重要手段之一,其疗效主要决定于目的基因和载体系统的选择。由于雪旺细胞(Schwann cells,SCs)易于获得和培养,植入宿主后能在宿主体内长期存活并能继续分裂,这些特性使其具有更广阔的应用前景。本研究旨在体外分离培养SCs,利用分子生物学技术,将胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotropic factor,GDNF)一种对神经元的发育、分化和存活具有重要作用的神经营养因子,通过脂质体导入SCs,观察其对脊髓神经元细胞凋亡基因的调控作用进而初步阐述其促进脊髓损伤的修复作用的机制,结果显示:在体外成功分离和鉴定得到的高纯度的SCs;成功将GDNF基因通过脂质体转染导入SCs,并且基因修饰后的SCs能持续稳定高水平的表达分泌GDNF;应用自制脊髓损伤模型打击装置成功制备大鼠脊髓损伤模型;通过体内和体外实验证实GNDF基因修饰的SCs通过调控凋亡基因的表达,主要是Bax表达下调,Bcl-2表达上调,抑制脊髓神经元细胞凋亡,促进脊髓损伤的修复。
卢遥[8]2017年在《GDNF基因转染大鼠间充质干细胞修复脊髓神经损伤的实验研究》文中进行了进一步梳理目的:探讨大鼠源性胎盘来源间充质干细胞(PMSCs)和骨髓来源的间充质干细胞(BMSCs)的培养方法并进行鉴定,将胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)转染PMSCs和BMSCs,并研究两种细胞转染后的生物学特性。比较转染GDNF基因的胎盘间充质干细胞和骨髓间充质干细胞修复脊髓神经损伤的疗效。为将PMSCs应用于脊髓神经损伤的修复提供实验基础。方法:采用密度梯度离心的方法将PMSCs从SD大鼠的胎盘中分离出来,并在体外传代、纯化、扩增,BMSCs从SD大鼠的股骨骨髓中分离出来进行培养。对比观察两种细胞的细胞形态。检测细胞表面标志物CD29、CD90、CD34、CD45。以GDNF过表达慢病毒感染BMSCs和PMSCs,观察观察绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)的表达情况。以MTT法检测转染GDNF基因的PMSCs与BMSCs的细胞活力,Western blot检测转染后GDNF在PMSCs和BMSCs中的表达。将64只SD大鼠制备脊髓打击伤模型,造模成功后随机分为四组:A组为单纯PMSCs组,B组为单纯BMSCs组,C组为PMSCs转染组,D组为BMSCs转染组,使用微量注射器依次注射单纯细胞A-B组细胞和转染细胞组C-D。于手术后7、14、28天对大鼠进行BBB运动功能评分。于手术后7、14、28天行HE染色并镜下观察,采用免疫组织化学染色观察NSE、GFAP、NF-200在脊髓内的表达。结果:大概30%的细胞在接种48-72小时后开始贴壁。经过4天的培养,PMSCs和BMSCs都呈长纺锤状,随后均以形态均匀的类似成纤维细胞样集落生长。流式细胞术测定表明,PMSCs和BMSCs阳性高度表达CD29、CD90,不表达CD34、CD45,表明本研究分离培养所得PMSCs和BMSCs为间充质干细胞。MOI=100时,转染12小时后,PMSCs和BMSCs显着表达绿色荧光蛋白(GFP)。细胞形态完整,没有明显的细胞病变效应。MTT法显示转染后PMSCs和BMSCs在3-5天时呈现对数生长,6-7天生长速度减缓。转染3天后,转染后PMSCs和BMSCs组细胞活力明显高于未转染PMSCs和BMSCs组。动物实验术后1天,所有组实验大鼠下肢瘫痪。7 d后,A、B、C、D组大鼠的运动机能略有改善,部分实验大鼠下肢有1-2个大关节能活动。14天后,C、D组大鼠下肢运动功能改善,部分实验大鼠下肢大小关节活动较好,A组、B组下肢功能恢复缓慢。28天后,C、D大鼠下肢运动功能恢复明显改善,部分实验大鼠能用双下肢支撑身体重量,A、B组大鼠下肢有所恢复。术后1、2、4周。C和D组的BBB评分没有显着差异(P>0.05)。C和D组的评分,与A组、B组相比有显着性差异(P<0.05)。HE染色观察,C组和D组间没有显着性差异,C组D组和A组,B组有显着性差异,C,D组明显优于A,B组。GFAP和NSE免疫组化染色结果显示脊髓损伤区C、D组GFAP大量表达,表达强度明显比A、B组高,具有统计学意义(P<0.05),C和D组间没有显着性差异(P>0.05);NF-200免疫组化染色结果显示脊髓损伤区C、D组NF-200阳性神经纤维长度长于A、B组,具有统计学意义(P<0.05)。C和D组间没有显着性差异(P>0.05)。结论:应用密度梯度离心法能够从大鼠胎盘组织中培养出大量增值能力较强的成纤维样细胞。流式细胞仪检测显示胎盘来源的间充质细胞和骨髓来源的间充质干细胞具有相似的干细胞表面标志。GDNF能够成功转染PMSCs和BMSCs,转染后具有较高的细胞活性。PMSCs和BMSCs具有相似的生物学特性和促进神经再生的能力。转染GDNF基因后能够提升PMSCs和BMSCs促进神经再生的能力。PMSCs可以作为新的细胞来源应用于神经损伤修复。
胡文昕[9]2012年在《GDNF基因修饰的雪旺细胞对大鼠脊髓损伤神经修复机制的实验研究》文中研究指明目的：探索GDNF基因转染到雪旺细胞中对脊髓损伤的保护作用。方法：将200只大鼠随机分成5组，每组40只。利用MASCIS（MulticenterAnimalSpinal Cord Injury Study）Impactor Model-II型打击器制成脊髓损伤模型，分为正常组；椎板切除＋损伤组；椎板切除＋损伤＋未转染雪旺细胞组；椎板切除＋损伤＋空载体转染雪旺细胞组；椎板切除＋损伤＋pEGFP-N1/GDNF转染雪旺细胞组。术后第1d开始至术后5w每组随机抽取20只大鼠每周对其后肢运动恢复情况用BBB运动功能评分标准进行测评；同时在术后第1d，第7d和第15d对每组剩余的20只大鼠进行HE染色观察和RT-PCR法检测Bax和Bcl-2表达情况，以测定GDNF基因修饰的雪旺细胞对大鼠脊髓损伤的神经修复作用。结果：GDNF基因修饰的雪旺细胞通过降低Bax mRNA和提高Bcl-2mRNA的表达，从而抑制脊髓神经元细胞的凋亡；进而证明GDNF基因修饰的雪旺细胞对大鼠脊髓损伤有治疗作用。结论：GDNF基因修饰的雪旺细胞对大鼠脊髓损伤神经具有修复作用，在细胞和分子水平上为GNDF基因修饰的SCs治疗脊髓损伤提供了实验依据。
张程[10]2017年在《鹿茸多肽联合GDNF基因修饰的雪旺细胞对辐射诱导脊髓神经元细胞凋亡的影响》文中进行了进一步梳理目的:观测鹿茸多肽联合GDNF基因修饰的雪旺细胞对于辐射诱导脊髓神经元细胞凋亡后脊髓神经元细胞Bax蛋白与Bcl-2蛋白的表达以及凋亡率的影响。方法:制取胎鼠脊髓神经元细胞悬液,取处于对数生长期的脊髓神经元细胞,用辐射诱导凋亡,将培养细胞总共分为六组。A组:正常的脊髓神经元细胞组;B组:经辐射诱导凋亡后的脊髓神经元细胞培养组;C组:经辐射诱导凋亡后的脊髓神经元细胞+SCs组;D组:经辐射诱导凋亡后的脊髓神经元细胞加pEGFP-N1转染SCs组;E组:经辐射诱导凋亡后的脊髓神经元细胞联合pEGFP-N1/GDNF转染SCs组;F组:鹿茸多肽联合pEGFP-N1/GDNF转染SCs加经辐射诱导凋亡后的脊髓神经元细胞加组。将各分组细胞通过流式细胞仪采取细胞凋亡率检测,使用免疫组化方法对脊髓神经元细胞的Bcl-2蛋白和Bax蛋白的表达情况进行观测。结果:各分组细胞的凋亡率检测结果如下:相比于正常的脊髓神经元细胞组,经辐射诱导凋亡后的脊髓神经元细胞培养组细胞凋亡百分数明显增高(p<0.05);与经辐射诱导凋亡后的脊髓神经元细胞培养组组比较,经辐射诱导凋亡后的脊髓神经元细胞+SCs组、经辐射诱导凋亡后的脊髓神经元细胞加pEGFP-N1转染SCs组、经辐射诱导凋亡后的脊髓神经元细胞联合pEGFP-N1/GDNF转染SCs组、鹿茸多肽联合经辐射诱导凋亡后的脊髓神经元细胞加pEGFP-N1/GDNF转染SCs组四组细胞凋亡百分数降低(p<0.05);与经辐射诱导凋亡后的脊髓神经元细胞+SCs组比较,辐射后的脊髓神经元细胞加pEGFP-N1转染SCs组、鹿茸多肽联合经辐射诱导凋亡后的脊髓神经元细胞加pEGFP-N1/GDNF转染SCs组两组细胞凋亡百分数明显下降(p<0.05)。免疫组化检测显示,Bcl-2阳性细胞胞质着棕色。结果显示,A、B、C、D、E、F、组均有Bcl-2的表达,并且A组的Bcl-2阳性细胞数目最低,细胞着色较淡,F组Bcl-2阳性细胞数目最高,细胞着色较深,并F组颜色与C、D、E叁组有明显的差异,C、D、E叁组的阳性细胞数差别不太大,细胞着色差异不大。可见鹿茸多肽联合经辐射诱导凋亡后的脊髓神经元细胞加pEGFP-N1/GDNF转染SCs加经辐射诱导凋亡后的脊髓神经元细胞组使Bcl-2表达上调,从而抑制脊髓神经元的凋亡。A、B、C、D、E、F组均有Bax的表达,并且A组Bax阳性细胞数目最低,细胞着色较淡,B组Bax阳性细胞数目最高,细胞着色较深。F组Bax与C组、D组、E组相比,F组的阳性细胞数少很多,细胞着色差异明显,C组、D组、E组叁组的Bax阳性细胞数相差不大,细胞着色差异不大,但与B组比较明显减少。可见鹿茸多肽联合经辐射诱导凋亡后的脊髓神经元细胞加pEGFP-N1/GDNF转染SCs组使Bax表达下调,从而抑制脊髓神经元的凋亡。结论:流式细胞仪结果显示,经辐射诱导凋亡后的脊髓神经元细胞联合鹿茸多肽组与经辐射诱导凋亡后的脊髓神经元细胞加pEGFP-N1转染SCs组细胞凋亡率都低于经辐射诱导凋亡的脊髓神经元细胞培养组,鹿茸多肽联合经辐射诱导凋亡的脊髓神经元细胞加pEGFP-N1/GDNF转染SCs组细胞凋亡率明显低于经经辐射诱导凋亡的脊髓神经元细胞加pEGFP-N1转染SCs组但高于正常脊髓神经元组,据此推断,鹿茸多肽联合GDNF修饰的雪旺细胞相比单独使用鹿茸多肽或单独使用GDNF修饰的雪旺细胞治疗脊髓损伤可能具有更好的优势。
参考文献：
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[6]. rAAV2介导GDNF联合早期康复训练治疗大鼠脊髓损伤的实验研究[C]. 韩清泉, 沈勇伟, 张春. 2014年中国运动生理生化学术会议论文集. 2014
[7]. GDNF基因修饰的雪旺细胞对大鼠脊髓损伤保护作用的实验研究[D]. 王旭凯. 吉林大学. 2009
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[9]. GDNF基因修饰的雪旺细胞对大鼠脊髓损伤神经修复机制的实验研究[D]. 胡文昕. 长春中医药大学. 2012
[10]. 鹿茸多肽联合GDNF基因修饰的雪旺细胞对辐射诱导脊髓神经元细胞凋亡的影响[D]. 张程. 长春中医药大学. 2017
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