穆杨[1]2001年在《猪血管内皮细胞体外培养方法的建立及生长特性研究》文中进行了进一步梳理为了研究猪瘟病毒对猪血管内皮细胞的特异亲嗜性造成血管破裂、出血的发病机理，我们分别用Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶消化猪血管内皮细胞，成功地分离培养了猪血管内皮细胞。通过原代培养、传代培养、纯化及生长曲线等的研究，了解了猪血管内皮细胞在体外培养过程中的生长特性；并通过剂量-反应关系研究了胰岛素对血管内皮细胞生长增殖的促进作用。结果表明：1．用Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶消化分离均可获得接种量的原代培养物，但用Ⅰ型胶原酶消化能较好的分离猪血管内皮细胞，对细胞的损伤小，获得的细胞培养时贴壁率高。接种后培养24小时，细胞呈萌芽形式生长，形成许多小岛状的细胞集落，48小时细胞集落增大，可区分出细胞密集的中央区及细胞密度较小的周边区。原代细胞6～7天可汇合形成单层。2．对于30～40日龄仔猪的血管段用0.1％Ⅰ型胶原酶消化10分钟，获得的内皮细胞最多，超过10分钟，混入的成纤维细胞明显增加。3．与0.25％的胰蛋白酶相比，用ATV使用液结合吸管吹打更适合于猪血管内皮细胞消化传代。4．根据成纤维细胞较内皮细胞对柠檬酸胰蛋白酶更敏感，可用0.25％柠檬酸胰蛋白酶清除内皮细胞中有时混杂的成纤维细胞，混合物用柠檬酸胰蛋白酶消化，并在倒置显微镜下观察，当有20％～40％细胞脱落时立即终止消化，收集的细胞主要为成纤维细胞，未脱壁的细胞主要为内皮细胞，继续培养后重复此过程1～2次可获得纯度很高的内皮细胞。5．培养细胞在相差显微镜下观察，呈典型的“铺路石”状排列，细胞间存在接触抑制；在扫描电镜下观察，细胞多角形或形状不规则，胞浆中伸出许多细长突起，细胞表面有许多圆形小凹窝；第Ⅷ因子相关抗原抗体间接免疫荧光染色，可检测到细胞核周围的胞质呈明显的黄绿色荧光。以上几点可证明培养的细胞为内皮细胞。 6．与MEM相比，M-199更适合于用作培养猪血管内皮细胞的基础培养基。7．生长液中加入胰岛素和氢化可的松，可明显促进细胞的生长和增殖，剂量-反应曲 猪血管内皮细胞体外培养方法的建立及生长特性研究 线表明胰岛素的最适用量为8卜g／InL。8．从生长曲线可以看出，传代猪血管内皮细胞接种后有1天左右的滞留期，然后细 胞进入对数生长期，可持续2～3天，第5天进入平台期，第8天细胞开始脱落死 亡。
洪海霞[2]2007年在《永生化猪脐静脉血管内皮细胞系的建立及其生物学特征分析》文中认为永生化细胞系具有许多原代细胞所没有的优点,如培养的均一性、稳定性和操作简便性等。原代培养细胞的分离培养费时费力,花费高,且传代次数有限,细胞生理功能容易变异,造成不同试验结果间因细胞培养代数而难以比较,使许多研究工作受到限制。许多研究证明端粒酶逆转录酶(TERT)是端粒酶活性的限速成分,外源性人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的导入能够使多种正常细胞的端粒酶活性激活,使细胞的寿命延长,甚至永生化。hTERT转染的细胞具有正常细胞的生物学特性,而不具有逃避细胞生长周期、核型不稳定、丧失血清依赖性等肿瘤转化特征。猪血管内皮细胞是一种理想的细胞模型,普遍用于心血管系统及一些出血性疾病的研究。但作为终末分化的体细胞,缺乏端粒酶活性。在体外培养时随着传代次数的增加,细胞逐渐失去增殖能力,大约在体外培养10代左右,细胞就进入衰老期,失去其正常的生物学功能,最后出现群体细胞生长停滞,不能继续传代培养。为了给研究猪瘟病毒(CSFV)对猪血管内皮细胞致病变作用机理和其他研究提供充足的细胞材料,我们开展了猪血管内皮细胞永生化的研究。分离培养了猪脐静脉血管内皮细胞,将hTERT基因导入处于生长停滞期的猪血管内皮细胞中,进行永生化研究,获得了以下结果:1.无菌采取猪带,分离脐静脉,用1 g/L胶原酶消化分离内皮细胞,于37℃,5%的CO2条件下培养。培养的细胞为单层贴壁生长,呈铺路石状。第Ⅷ因子相关抗原(F-ⅧRAg)和CD34因子免疫荧光鉴定为阳性。结合细胞形态学观察,结果表明,分离培养的细胞为血管内皮细胞。培养的细胞纯度高,6 d左右长成单层。在体外培养传至9~10代后,细胞生长停滞,发生衰老和死亡。2.采用脂质体转染法,将编码hTERT和neo基因的真核表达质粒pCI-neo-hTERT导入原代培养的猪脐静脉血管内皮细胞。加G418筛选约1个月后,得到抗G418阳性克隆,获得2个细胞克隆。滤纸片法消化,转移,继续扩大培养。RT-PCR技术检测到hTERT mRNA在转染细胞中的表达,说明外源性hTERT稳定转染入血管内皮细胞。利用TRAP-ELISA法对转染后第10代、第20代、第30代细胞进行端粒酶活性检测,均表现为阳性,原代培养的细胞为端粒酶活性阴性。表明外源性hTERT基因可以激活猪血管内皮细胞的端粒酶活性。克隆c2来源的细胞在体外长期连续培养下,生长良好,至今传代达56代,历时约12个月。将其命名为hTERT介导的永生化猪脐静脉血管内皮细胞系(hTERT-SUVECs)。3.体外连续培养过程中,hTERT-SUVECs呈现长梭形形态,单层细胞呈鹅卵石铺路石状排列,细胞间存在接触抑制,细胞无异形性和核浆比例倒置等肿瘤细胞特征。通过对内皮细胞重要的标志物F-ⅧRAg和CD34分子检测,表明转染后的血管内皮细胞表面标志没有丢失。绘制细胞生长曲线图和培养观察,转染细胞仍具有正常的细胞增殖周期和接触抑制性;细胞周期检测表明hTERT-SUVECs生长增殖较原代细胞活跃,其细胞凋亡率远低于传至第6代的原代细胞,具有克隆形成能力。以上结果初步表明,转染细胞基本上保持了正常血管内皮细胞的生物学特性。4.对第35代hTERT-SUVECs和第3代SUVECs细胞核型检测表明,染色体形态结构与正常SUVECs比较没有变化,均共有38条染色体。hTERT-SUVECs细胞具有正常核型。hTERT-SUVECs接种6周龄裸鼠后经2个月,无肿瘤形成。hTERT-SUVECs和SUVECs软琼脂内培养2周后,均不能生长。通过MTT比色法检测了hTERT-SUVECs在不同血清浓度下的增殖能力,结果表明,同原代细胞一样,转染细胞在高血清浓度的培养条件下增殖较快,血清依赖性无显着降低。总之,hTERT-SUVECs基本上为正常细胞,无转化特征,保持了原代猪血管内皮细胞的生物学特征。5.分别采用放射免疫法和硝酸还原酶法测定了hTERT-SUVECs和SUVECs细胞在不同培养时间里的ET、PGI2、NO分泌量。结果表明,3种血管活性物质在两者中代谢水平变化一致;在相同的培养时间内,两者在ET和PGI2的分泌量上接近,无显着差异。而在NO的分泌量上差异显着,在hTERT-SUVECs细胞培养上清中NO含量低于SUVECs。总体上说,hTERT-SUVECs没有丧失其分泌功能,hTERT的导入不影响其正常的生理功能。综上所述,本研究成功的将人端粒酶逆转录酶基因导入猪脐静脉血管内皮细胞中,激活了其端粒酶活性,延长了细胞在体外培养的寿命,永生化的猪脐静脉血管内皮细胞仍能保持其正常的生物学特性和分泌功能,这在国内外均属首次报道。
洪海霞[3]2004年在《猪脐静脉血管内皮细胞的分离培养及猪瘟病毒对其的致病变作用》文中认为猪瘟病毒（CSFV）只能专一性对猪致病，但可以使牛、羊、兔等多种动物发生无症状性感染。CSFV 可在多种动物的组织细胞中复制，但一般不产生致细胞病变效应(CPE)。由于猪瘟病毒对中胚层组织，特别是造血和血管组织具有特殊的亲和力，CSFV感染猪后使小血管和毛细血管内皮细胞发生变性和坏死，而不能使其他细胞发生病变。为了给研究CSFV对猪专一性致病机理和对猪血管内皮细胞致病变作用机理提供细胞材料，于是我们开展了猪脐静脉血管内皮细胞体外培养方法的研究，并观察了猪瘟病毒石门强毒株对猪血管内皮细胞的致病变作用，获得了以下结果： 1. 无菌采取猪脐带，用 0.1%胶原酶消化分离内皮细胞，于 37℃，5％CO2 下培养。对培养细胞生长特性进行检测，并对细胞进行第Ⅷ 因子相关抗原(F-ⅧRAg)和扫描电镜形态学鉴定。结果表明，70%细胞在 24h 内贴壁，4～5d 长成单层。培养的细胞呈单层贴壁生长，典型铺路石状，第Ⅷ因子相关抗原(F-ⅧRAg)检测阳性。证明分离到了猪血管内皮细胞。 2. 取 2～3 代生长良好的猪血管内皮细胞，待长至 80%单层时接种 CSFV 石门株脾毒，加维持液（含 2%无牛病毒性腹泻病毒抗体的胎牛血清）培养。同时设猪血管内皮细胞接种 CSFV C 株（弱毒疫苗株）对照、PK-15 细胞上接种 CSFV 石门株对照和阴性（不接毒）对照。分别于 12h，24h，36h，48h，72h 和 96h 观察细胞形态。结果表明，血管内皮细胞于接种 CSFV 石门株后 12h，24h 无明显变化，至 36h 时，细胞开始拉长，个别细胞开始脱落；至 48h 时，部分细胞变圆，脱落，细胞间隙增大；至 72h，细胞拉长呈长梭状，细胞间隙很大，细胞脱落严重。3 个对照组的细胞均未出现明显变化。 3. 取接种 CSFV 石门株脾毒、C 株后 24h 和 56h 的血管内皮细胞和对照血管内皮细胞，经甲醛固定后进行透射电镜观察。结果表明，接种石门株的细胞在 24h 时，细胞溶酶体增多，内质网轻度扩张，线粒体变小，皱缩。在 56h 时，溶酶体显着增多，内质网扩张明显，线粒体变性，皱缩；而接种 C 株的内皮细胞除溶酶体增多外，其余无明显变化。阴性对照血管内皮细胞无明显变化。 4.为了确证血管内皮细胞 CPE 是否由 CSFV 石门株引起，将 CSFV 石门株接种于培养的猪血管内皮细胞，从接种后 24h，48h 和 72h 的血管内皮细胞和阴性对照血管内皮细胞提取细胞 RNA，经 RT-PCR 和 nPCR 扩增 CSFV 的 E2 基因。结果表明，接种后 24h，48h 和 72h，血管内皮细胞内均能扩增出约为 1170bp 的特异性片段，经核苷酸序列分析，证明与 GenBank 中 CSFV 石门株的 E2 基因序列相符。而阴性对照细胞则无条带出现。<WP=6>II 中文摘要 以上结果表明，本文成功的建立了猪脐静脉血管内皮细胞体外分离培养的方法；CSFV 石门株能够使猪血管内皮细胞产生细胞病变效应（CPE），这在国内外均属首次报道。
佚名[4]2004年在《作者索引》文中指出Vamla B抗BACP1抗体的制备及鉴定(1):30-33 Wernig A人源性成肌细胞和肌管细胞中β-Tubulin Ⅲ的表达(13):1157-1161 A 阿明长春瑞宾+顺铂治疗非小细胞肺癌48例(8):743 结肠镜诊断大肠癌632例(11):1024 沙培林+顺铂治疗恶性胸腔积液43例(12):1133 艾国平植入贫铀片大鼠血液和肝肾功能的变化(2):182-185 吸入贫铀粉尘和/或嵌入贫铀片大鼠体内铀的分布(6):503- 506
谭晓妮[5]2010年在《猪瘟兔化弱毒株在永生化猪血管内皮细胞和牛睾丸细胞上增殖的比较研究》文中进行了进一步梳理我国20世纪60年代研制的猪瘟兔化弱毒苗在控制猪瘟大规模流行中发挥了重要作用。欧洲、亚洲很多国家及部分拉丁美洲国家都广泛应用C株弱毒,并一致认为兔化弱毒株免疫性坚强,特别是可以安全的免疫预防仔猪、乳猪以及种猪群。疫苗接种是控制猪瘟的重要手段,在中国最常用的是猪瘟兔化弱毒细胞苗。但从20世纪90年代以来,接种了猪瘟兔化弱毒细胞苗的猪群屡有免疫失败的现象发生,给猪瘟的有效防控带来了困难。本文的目的在于利用本试验室所建立的永生化血管内皮细胞系与原代牛睾丸细胞比较猪瘟兔化弱毒株的增殖情况,为开发猪瘟兔化弱毒疫苗寻找新的细胞,获得了以下研究结果:(1)原代牛睾丸细胞的培养。采取犊牛睾丸,用组织块和酶消化法两种方法进行牛睾丸细胞的培养,并进行检测。结果获得了犊牛睾丸细胞,形态观察呈成纤维样和内皮样细胞。(2)牛睾丸细胞和永生化血管内皮细胞感染模型的建立。准备好1代牛睾丸细胞和70代永生化猪血管内皮细胞,将猪瘟兔化弱毒先按照说明书比例稀释,然后用其1mL分别感作这两种细胞90min,然后收集毒液,加入2～5mL的含有2%的FBS的DMEM培养基维持培养。72h后收集培养基上清液,进行RT-PCR检测和间接免疫荧光试验,结果表明病毒在细胞中均有增殖。然后将接毒的这两种细胞分别传代,发现牛睾丸细胞在传至第6代的时候细胞明显萎缩,而永生化血管内皮细胞在传至110代时才发生萎缩现象。建立了猪瘟兔化弱毒在永生化血管内皮细胞上的感染模型。(3)选用6～8周龄的雌性Balb/c小鼠进行动物免疫试验。随机分为16组。分别是接毒的牛睾丸细胞组;接毒牛睾丸细胞的上清组;接毒的永生化血管内皮细胞细胞组;接毒的永生化血管内皮细胞的上清组;相应设定阴性对照、空白对照、阳性组。上清液接种剂量为1mL,细胞接种剂量为1×10~6个/mL。采用腹腔注射免疫接种,1周后断尾采血;2周后尾部接种加强免疫一次,加强免疫前后均采集血样,分离血清,间接ELISA测定血清猪瘟病毒抗体水平。结果表明,接毒的永生化猪血管内皮细胞的上清液含毒量要比接毒的牛睾丸细胞上清液略高。荧光实时定量PCR法检测病毒滴度,表明病毒在永生化猪血管内皮细胞中的增殖要比在牛睾丸细胞中多。综上所述,猪瘟兔化弱毒在永生化血管内皮细胞中比在牛睾丸细胞中更易增殖,为进一步研制新的猪瘟兔化弱毒细胞苗奠定了基础。
谢杨[6]2015年在《猪脐静脉血管内皮细胞体外培养研究》文中认为目的：对猪脐静脉血管内皮细胞进行体外培养并使其永生化,进而为研究过氧化物酶体增殖物激活受体PPARγ对猪胎盘及胎盘血管发生的影响提供良好的细胞模型。方法：采用胶原酶对新鲜仔猪脐静脉血管内皮细胞进行消化分离,获得原代细胞并在CO2培养箱条件下进行体外培养；显微镜观察细胞生长的形态学变化,免疫组化法进行细胞鉴定；利用ICELLigence细胞功能分析仪监测体外培养细胞的生长曲线变化,并采用流式细胞术检测细胞周期和凋亡；采用端粒酶转入的方法进行体外培养猪脐静脉血管内皮细胞的永生化处理,并用G418药物筛选阳性单克隆细胞；利用细胞功能分析仪监测激动剂和抑制剂对该细胞增殖能力的影响。结果：(1)原代细胞生长状态良好,呈小叁角形、椭圆形、梭形、多边形单层生长,界限清晰,融合后呈铺路石状排列,细胞增殖能力强。多次传代后细胞增殖能力减弱,细胞活力差,凋亡细胞增多。兔抗人第八因子相关抗原(FⅧAg)抗体和兔抗人CD31多克隆抗体鉴定均呈阳性。(2)原代细胞转入端粒酶后,转染效检证明端粒酶成功转入细胞内；转染细胞药筛14d后获得单克隆细胞,并能够增殖传代,细胞状态良好。(3)当激动剂浓度为5μMol/ml时,可以促进PPARγ蛋白的表达,加速原代细胞和单克隆细胞的生长增殖,增强细胞活力；当抑制剂浓度为20μMol/ml时,明显抑制PPARγ蛋白的表达,从而抑制细胞的生长增殖,降低细胞活力。结论：本研究由猪脐静脉血管分离获得的原代培养细胞,经体外培养观察和细胞特征性标志物检测,符合血管内皮细胞的基本特征；原代培养细胞经端粒酶转染和药筛处理获得转染阳性单克隆细胞,并表现出良好的生长增殖能力；使用PPARγ激动剂或抑制剂药物干预,原代培养细胞和转染的单克隆细胞均表现出类似的促进或抑制细胞生长的反应。
穆杨, 张彦明[7]2004年在《猪血管内皮细胞体外培养方法的建立》文中研究表明实验研究了猪血管内皮细胞体外培养方法并对培养的细胞进行了鉴定。获得了传代培养的猪血管内皮细胞。结果表明:用Ⅰ型胶原酶和胰酶消化分离,均可获得接种量的原代培养物,但Ⅰ型胶原酶消化效果更好;原代或早期传代培养物中有时混入的成纤维细胞可用柠檬酸胰酶有效清除。在不用贴附基质和内皮细胞生长因子(ECGF)的条件下,向生长液中加入胰岛素可成功的培养内皮细胞。该细胞在体外培养时贴壁生长,单层细胞呈"铺路石"状排列,细胞间存在接触抑制;第Ⅷ因子相关抗原免疫荧光染色阳性,证明培养的细胞为血管内皮细胞。
陈秀荔[8]2004年在《孕早期家兔子宫内膜细胞分离与培养方法的建立》文中认为子宫内膜是卵巢激素作用的靶组织，在生殖生理的研究中占有重要的地位。孕酮和雌激素的联合作用使子宫内膜细胞在妊娠期发生形态及生物化学的变化，这种变化不仅表现在上皮细胞、间质细胞，同时还表现在其增殖及分泌的改变，此时子宫内膜变为分泌性内膜。对子宫内膜细胞进行体外培养，探讨子宫内膜细胞分离与体外培养条件、生长特点及其增殖过程，从而为子宫内膜基质细胞和上皮细胞分离与培养体系的完善打下基础，这将为进一步研究子宫内膜细胞在子宫局部免疫中的作用提供理论依据。本试验采用不同的消化方法获取孕早期家兔子宫内膜细胞，通过原代培养、传代培养、细胞鉴定等试验，观察孕早期家兔子宫内膜细胞在体外培养过程中的生长特性，并通过激素刺激法探讨激素对子宫内膜细胞生长增殖的促进作用，结果表明：1. 采用Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶消化分离均获得接种量的原代培养物，采用胰蛋白酶消化获得的细胞少，活力低；而用1 g/LⅠ型胶原酶消化获得的细胞数量多达5×106个，活力大于90%，接种培养24 h后，细胞基本贴壁，4-5 d可汇合形成单层。2. 经74 μm（200目）滤网过滤可将基质细胞和腺体细胞分离，依据是基质细胞可以通过滤网，而腺体细胞由于是腺管不能通过滤网。3. 在倒置显微镜下观察培养的细胞，腺上皮细胞形似蝌蚪，多呈漩涡状，成团逐渐向外生长，细胞核圆形；间质细胞在培养过程中逐渐伸直延长，呈现中间宽，两端尖的纺锤形，细胞核呈卵圆形。细胞间存在接触抑制，4-5 d细胞汇合后处于相对静止状态。4. 与M-199、RPMI-1640培养基相比，DMEM/F12（1:1）培养基更适合作培养子宫内膜细胞的基础培养液。5. 生长液中加入10 μg/mL胰岛素，可以明显促进子宫内膜细胞的生长和增殖。6. 利用免疫组织化学染色法分别对腺上皮细胞和间质细胞作初步鉴定，用鼠抗兔角蛋白单克隆抗体作SP免疫细胞化学染色，凡细胞胞质染成棕黄色的证明为角蛋白阳性细<WP=6>胞；用鼠抗兔波形蛋单克隆抗体作SP免疫细胞化学染色，凡细胞胞质染成棕黄色的证明为波形蛋白阳性细胞。以子宫内膜细胞作阳性对照，PBS代替第一抗体作阴性对照。7. 传代的子宫内膜细胞接种后有18-24 h的滞留期，然后进入对数生长期，可持续2-4 d，第7天进入平台期，第8天开始脱落。8. 妊娠早期的子宫内膜较其它时期的子宫内膜易培养，生长增殖迅速，而且获得的腺体细胞较多。
王津津[9]2010年在《猪气管上皮细胞的永生化及副猪嗜血杆菌对其黏附能力的研究》文中指出哺乳动物的气管黏膜上皮细胞(Trachea epithelium cells,TECs),既是许多病原体作用的靶细胞,也是阻挡病原入侵的一个重要屏障。黏膜纤毛上皮细胞能够清除来自外界的有害物质,比如有毒气体,灰尘,细菌,病毒等等,来使机体免受这些有害物质的侵害。然而,目前STECs(Swine trachea epithelium cells,STECs)分离培养的文献尚不多见。建立STECs体外培养技术可为以STECs为细胞模型的研究提供物质基础。副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis, HPS)是一种NAD依赖型、不运动的革兰氏阴性细小杆菌,属于巴斯德菌科(Pastteurellaceae)嗜血杆菌属(Haemophilus),常引起猪革拉瑟氏病(Glsser’s disease),给养猪业造成了重大经济损失。近年来,国外学者利用多种猪的细胞株模型,对HPS的作用机制进行了有意义的探索,但国内尚无相关报道。本文将人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)转入猪气管上皮细胞使其永生化,并研究了HPS对猪气管上皮细胞的黏附能力,为进一步研究HPS的作用机制奠定了基础,获得了以下结果。(1)无菌采取初生仔猪气管,采用链酶蛋白酶灌注冷消化法,分离得到纯度非常高的原代STECs。刚分离下来的STECs为亮球形,多呈单个存在,倒置相差显微镜下可见不停摆动的纤毛。(2)分离得到的原代STECs于37℃、5%CO2条件下培养,细胞呈单层贴壁,多边形铺路石状生长。用8型角蛋白间接免疫荧光鉴定,细胞核无特异性荧光,细胞膜有特异性荧光,再结合细胞形态观察,证实分离的细胞确为猪气管上皮细胞。培养的细胞经过差速贴壁法纯化,3 d左右长成单层,在体外连续培养传代至6～8代后,细胞开始衰老和死亡。(3)采用脂质体转染法将pCI-neo-hTERT导入原代培养的STECs。转染48 h后加G418进行抗性筛选1个月后,得到抗G418的阳性克隆,继续扩大培养,再用无限稀释法进行纯化。RT-PCR技术检测到hTERT mRNA在转染细胞中表达,用抗hTERT单克隆抗体进行Western Blot检测到转染细胞中有特异性条带产生,而原代培养的细胞无特异性条带产生。表明外源性hTERT基因在转染细胞中得以表达,并激活了端粒酶活性。目前已传至55代。(4)永生化的STECs在体外长期培养下,单层细胞呈铺路石样,细胞界限明显,存在接触抑制性,绘制细胞活力曲线图,永生化的STECs具有正常的细胞增殖周期,比原代细胞生长活跃。(5)用对数生长期的HPS以不同浓度感染永生化的STECs和猪脐静脉血管内皮细胞,分别作用1 h、2 h、3 h、4 h后,通过革兰氏染色观察HPS对细胞的黏附情况。结果表明,HPS可黏附在上皮细胞和血管内皮细胞表面;HPS对气管上皮细胞有毒性作用,致细胞变性坏死和凋亡;HPS对细胞的黏附力和菌液浓度和作用时间有关系,浓度为1.0×108CFU/mL HPS感染4 h后,黏附效果最好。高倍显微镜下可见大量HPS黏附于猪气管上皮细胞,只有个别HPS黏附于猪血管内皮细胞表面。说明HPS对猪气管黏膜上皮细胞的黏附能力远强于对猪血管内皮细胞的黏附能力,可以利用猪气管黏膜上皮细胞建立副猪嗜血杆菌黏附细胞的模型。综上所述,本研究成功的将人端粒酶逆转录酶基因导入猪气管上皮细胞中,并激活了其端粒酶活性,延长了STECs的体外培养的寿命,已传至55代。进一步观察到HPS对猪气管上皮细胞的黏附能力远强于猪血管内皮细胞,说明可以利用猪气管上皮细胞来建立副猪嗜血杆菌黏附细胞的模型。
庄道华[10]2013年在《欧洲鳗鲡与大黄鱼四种细胞系的建立及其特性研究》文中研究说明当前鱼类养殖所面临的种质退化、病害频发等问题日益突出,为了更好的解决这些生产上的难题,相关毒理药理、疫苗开发、遗传育种等研究必须进一步深入。采用体外培养鱼类细胞系进行相关研究具有成本小、可重复性高、研发实验周期短、能有效避免个体差异以及避免因个体极易死亡而导致的实验可操作性差等优点,而建立鱼类细胞系是实现上述诸多便利的基础环节。本研究采用鱼类组织体外培养法,结合不同鱼类物种、年龄差异采用不同方案,最终建立了来自欧洲鳗鲡(Anguilla anguilla)尾鳍组织,大黄鱼(Larimichthys crocea)脑组织、肝脏组织和肌肉组织的四个细胞系,分别命名为EEF、LYCB、LYCL和LYCMS。以DMEM/F12培养液为基础,添加β-巯基乙醇(2-ME)、肝细胞生长因子(HGF)、碱性成纤维生长因子(FGF-basic,人/鼠)、表皮生长因子(EGF)、羧甲基纤维素钠(CMC)、N-乙酰葡萄糖胺(N-AG)配制条件培养液,通过胰酶消化处理欧洲鳗鲡尾鳍组织块,倒置干贴24 h,加入条件培养液,成功进行了EEF原代培养。并通过经典胰酶消化法成功进行了EEF传代培养。说明此条件培养液适宜于淡水鱼类细胞原代、传代培养。使用上述条件培养液对海水鱼类原代培养进行尝试。将大黄鱼幼鱼组织块(肌肉、脑组织、肝脏)切碎不经胰酶消化直接倒置干贴,进行体外原代培养。最终成功实现这叁个组织的原代培养,并将获得的原代细胞进行传代培养,建立了来自大黄鱼脑组织、肝脏及肌肉的叁个可连续传代细胞系:LYCB、LYCL和LYCMS。这也说明本研究所配制条件培养液能满足来自淡水与海水鱼类的体外细胞系原代及传代培养的养分、pH、渗透压等需求。本研究通过检测不同传代比例对所建立细胞系的增殖曲线影响以及MTT法检测各生长因子对其增殖影响。结果显示不同的传代比例及生长因子对四种细胞系增殖均有影响,但对各个细胞系影响大小、显着程度各有不同。以上述四种细胞系为实验材料,进行了染色体数目分析。结果显示上述EEF细胞系54%的分裂相细胞染色体数目为38条;LYCB、LYCL、LYCMS细胞系分别有51%、56%、62%的分裂相细胞染色体数目为48条。相对较低的二倍体染色体数目比例说明上述四种鱼类细胞系在体外培养的过程中部分细胞染色体整倍性发生变化,这与现阶段关于体外培养的细胞系染色体数目与原物种呈现一定差异相一致。本研究对所建立的四个细胞系进行了冻存复苏、转染外源基因的尝试,结果显示这四种细胞系可以冻存复苏,可以用于外源基因的表达研究。
参考文献：
[1]. 猪血管内皮细胞体外培养方法的建立及生长特性研究[D]. 穆杨. 西北农林科技大学. 2001
[2]. 永生化猪脐静脉血管内皮细胞系的建立及其生物学特征分析[D]. 洪海霞. 西北农林科技大学. 2007
[3]. 猪脐静脉血管内皮细胞的分离培养及猪瘟病毒对其的致病变作用[D]. 洪海霞. 西北农林科技大学. 2004
[4]. 作者索引[J]. 佚名. 第四军医大学学报. 2004
[5]. 猪瘟兔化弱毒株在永生化猪血管内皮细胞和牛睾丸细胞上增殖的比较研究[D]. 谭晓妮. 西北农林科技大学. 2010
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[7]. 猪血管内皮细胞体外培养方法的建立[J]. 穆杨, 张彦明. 畜牧兽医学报. 2004
[8]. 孕早期家兔子宫内膜细胞分离与培养方法的建立[D]. 陈秀荔. 西北农林科技大学. 2004
[9]. 猪气管上皮细胞的永生化及副猪嗜血杆菌对其黏附能力的研究[D]. 王津津. 西北农林科技大学. 2010
[10]. 欧洲鳗鲡与大黄鱼四种细胞系的建立及其特性研究[D]. 庄道华. 集美大学. 2013
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