王宾香[1]2004年在《苦瓜籽核糖体失活蛋白的分离纯化及对细胞抑制活性的研究》文中指出研究人员已从苦瓜籽中分离出包括 α-Momorcharin (α－MMC)、β－MMC、γ－MMC、δ－MMC、ε－MMC和MAP30等6种苦瓜素。苦瓜素具有抑制兔网织红细胞裂解液中蛋白质合成的活性，其半数抑制浓度IC50为0.01～10.0nM。其中，α－MMC和β－MMC的抑制活性强，其IC50分别为0.23nM和0.19nM，且在苦瓜籽中的含量丰富。本研究利用α－MMC和β－MMC的高等电点特性，首先在色谱工作站上让苦瓜籽粗提液流过弱阴离子DEAE-650C与弱阳离子CM-650M串联交换柱，然后对CM-650M柱进行低梯度缓慢洗脱，得到纯化的α－MMC和β－MMC；发现α－MMC对香蕉枯萎菌和果腐霉菌、β－MMC对果腐霉菌均具有较强的抑制活性；研究了α－MMC和β－MMC对细胞的抑制活性，结果表明α－MMC和β－MMC对人肝癌细胞Bel-7402的半数抑制浓度IC50分别为0.073mg/mL和0.033mg/mL，对人脐静脉内皮细胞Hunec的半数抑制浓度IC50分别为 0.074mg/mL和0.036mg/mL，可知β－MMC对细胞的抑制活性要比α－MMC强；给β－MMC偶联上抗肝癌单克隆抗体HAb18F（ab’）2后，生成免疫毒素(～HAb18F（ab’）2，其对Bel-7402的半数抑制浓度IC50为1.21×10-06mol/L，比β-MMC对Bel-7402的半数抑制浓度1.10×10-06mol/L略高；免疫毒素对Hunec的半数抑制浓度IC50为7.42×10-05mol/L，是β－MMC对Hunec的半数抑制浓度1.20×10-06mol/L的61.8倍，表明β-MMC偶联上抗肝癌单克隆抗体片段HAb18F(ab’)2后具有靶向作用的功能。本研究探讨了利用苦瓜籽核糖体失活蛋白β－MMC来研制靶向抗肿瘤药物的可能性，同时也为用阴阳离子交换串联色谱分离纯化碱性或酸性蛋白探索了一条新的技术路线。
李涛[2]2008年在《南蛇勒RIP的分离纯化及其抗肿瘤作用初步研究》文中提出核糖体失活蛋白(ribosome-inactivating protein,RIP)是一类广泛存在于植物界的毒蛋白,能破坏核糖体的结构,从而可以抑制蛋白质的生物合成。研究表明,RIP在抗病毒、抗肿瘤、免疫调节及抗生育、抗虫害等方面显示出良好的生物学活性,在医学、农业方面已展现出诱人的应用前景。本研究以云南德宏州生长的豆目苏木科植物南蛇勒(Caesalpinia minax Hance)的种子为原料,运用硫酸铵分级沉淀、C-25阳离子交换、Sephadax-G75凝胶层析等方法分离提取、纯化得到了一种较高纯度的南蛇勒蛋白,所获得的蛋白经SDS-PAGE电泳检测呈单一条带,其分子量约为29.64KD,实验表明该蛋白具有RNAN—糖苷酶活性,具有抗肿瘤活性。综合各方面信息,我们认定分离纯化出了一种新来源的核糖体失活蛋白——南蛇勒RIP。由于一般RIP表现出抗肿瘤的生物活性,本实验中以小鼠黑色素瘤细胞(B16细胞)和宫颈癌细胞(Hela细胞)为研究对象进行体外生物活性实验。结果表明,南蛇勒RIP对B16细胞和Hela细胞的增殖有显着的抑制作用,且呈现出明显的量—效关系和时—效关系。(1)在研究南蛇勒RIP对细胞增殖抑制活性的量—效实验表明,随RIP浓度的增加,对细胞的增殖抑制作用明显加强。作用48小时,南蛇勒RIP对Hela细胞的半抑制浓度IC_(50)约为145μg/ml,对B16细胞的半抑制浓度IC_(50)约为136μg/ml。(2)在研究南蛇勒RIP对细胞增殖抑制活性的时—效实验表明,RIP的抑制细胞增殖的能力随时间的延长而增强,在150μg/ml浓度作用情况下,细胞的增殖几乎处于停顿,72小时时对Hela细胞的抑制率为85.61%,对B16细胞的抑制率为88.91%,其对B16细胞系的体外增殖抑制作用较对Hela细胞系的抑制作用略强。(3)初步研究了南蛇勒RIP对B16细胞粘附作用的影响。结果表明:RIP对B16细胞系对ECM各成分的粘附作用不是很明显,在150μg/ml浓度下除能够减少B16细胞对胶原蛋白Ⅰ的粘附外(抑制率约20%),其余在误差范围内,作用不明显。
白洁[3]2017年在《苦瓜籽提取物诱导HepG2细胞凋亡的机制研究》文中提出苦瓜籽富含油脂、蛋白质、多酚、皂苷等多种活性成分,具有抗菌、抗氧化、改善糖尿病以及抗癌等多种药用价值。miRNA存在于所有生物体中,具有转录后水平的负调控作用,是各种机体活动中的关键调控因子。大量流行病学及临床研究证明,饮食是影响健康与疾病的一个重要可调控因素,本研究以miRNA为入手点,探讨苦瓜籽水提物的抗肿瘤机制,为癌症的治疗提供新的食源性天然抗癌食品,并开辟新的治疗靶点。本文对苦瓜籽的主要成分进行了深入分析,对抗癌活性蛋白进行了分离、纯化和鉴定;以HepG2细胞为主要作用对象,评价干预前后HepG2细胞在生长增殖、细胞周期、ROS、线粒体膜电位、细胞核形态等生物学特性方面的差异性,初步分析苦瓜籽水提物诱导癌细胞凋亡的作用;以miR-421为主要的研究对象,探讨了苦瓜籽水提物诱导HepG2细胞凋亡的机制。论文主要研究结果如下:1.苦瓜籽主要成分分析及抗癌活性蛋白分析苦瓜籽主要成分是油脂和蛋白质,含量分别为44.44±0.17%和34.83±0.47%,总糖含量为11.88±0.04%;另外,还含有2.27±0.17%的皂苷和1.03±0.08%的多酚。当硫酸铵饱和度在30%-60%的时候,苦瓜籽粗蛋白的提取率最高,蛋白种类最多,并且抗肿瘤活性最强;经过CM-Sepharose FF弱阳离子柱纯化苦瓜籽蛋白,共洗脱出6个蛋白峰和1个穿透峰,其中穿透峰1的蛋白主要富集在30KD以下,并具有显着的抗肿瘤活性;进一步采用Q exactive质谱对穿透峰1进行蛋白定性分析,发现穿透峰1的主要蛋白成分是核糖体失活蛋白和胰蛋白酶抑制剂。2.苦瓜籽水提物诱导细胞凋亡的机制研究苦瓜籽水提物可以显着抑制HepG2、SGC-7901和HT-29细胞的增殖,并呈剂量依赖性,IC50值分别为586.27±0.07μg/mL、771.09±0.08μg/mL与1206.17±0.08μg/mL,其中苦瓜籽水提物对HepG2细胞的抑制作用最为显着;苦瓜籽水提物能够将HepG2细胞周期阻滞在S期,并促进ROS含量的产生,降低线粒体膜电位,影响蛋白表达,最终破坏细胞正常形态与结构,导致细胞核涣散甚至破碎,产生大量凋亡小体。3.苦瓜籽水提物通过下调miR-421诱导HepG2凋亡的机制苦瓜籽水提物可以显着改善4个癌症相关miRNA的表达,其中miR-421和miR-23b-3p表达量显着下调,miR-138-1-3P和miR-190b表达量显着上调。以miR-421及miR-138-1-3P为对象,结合生物信息学分析和靶基因芯片技术,并通过RT-PCR验证,发现有9个miR-421靶基因在苦瓜籽水提物诱导凋亡的HepG2细胞中表达上调;成功转染miR-421mimics和miR-421 inhibitor,并观察miR-421可疑靶基因Caspase-3和DUSP6的变化,结果发现miR-421过表达时,Caspase-3基因表达量和蛋白表达量均显着下调,但是DUSP6蛋白表达量无显着变化,说明苦瓜籽水提物可能是通过下调miR-421,上调下游基因Caspase-3的表达,从而诱导HepG2细胞凋亡。
陈贝[4]2006年在《苦瓜籽中生物活性物质的分离纯化及表征》文中研究指明苦瓜籽粗提液分别经弱阴离子色谱柱(DEAE-650C)、弱阳离子色谱柱(CM-650M)交换后,得到一个具有抗真菌活性的蛋白MAP13。该蛋白经鉴定达到电泳纯,相对分子量约为12.7kDa左右。经还原剂处理后,电泳结果表明该蛋白由分子量分别为7kDa和6kDa的两个亚基组成,亚基之间通过二硫键连接。体外抑菌实验表明MAP13对苹果轮纹病菌(Physalospora piricola)、棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、瓜果腐霉病菌(Pythium aphanidermatum)、白菜黑斑病菌(Alternaria alternata(Fr.) Keissl)等真菌具有明显的抑制作用,对瓜果腐霉病菌的IC50为93.6μmol/L。MAP13的抑菌作用可能是通过破坏供试真菌的细胞壁来完成。通过二苯代苦味肼基(DPPH)自由基分光测定法的检测结果表明MAP13具有体外抗氧化活性,其IC50为20.9μmol/L。苦瓜籽粗提液通过Sephadex G75凝胶过滤、LUNA C18反相高效液相色谱分离得到活性组分P2,在C18反相柱上表现为单一的峰,经cLC毛细管液相色谱分析已达到很高的纯度。但通过MALDI-TOF MS测定表明P2主要由分子量为1533.54Da和1555.57Da的组分组成。P2具有体外抗真菌活性,对苹果轮纹病菌(Physalospora piricola)、棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、瓜果腐霉病菌(Pythium aphanidermatum)、菜豆根腐病菌(Fusarium solani)、葡萄灰霉(Botrytis cinerea)、甜瓜枯萎病菌( Fusarium oxysporum f.sp.nelonis )、白菜黑斑病菌( Alternaria alternata(Fr.) Keissl)、花生褐斑病菌(Mycosphaerella arachidicola)等真菌都有明显的抑制作用,对菜豆根腐病菌的IC50为18μg/mL。P2对真菌的抑制机理与MAP13不同,还有待进一步研究。体外细胞抑制实验表明P2对人肝癌细胞HepG2和狗肾上皮细胞MDCK具有明显的抑制活性。对HepG2细胞的的半数抑制浓度IC50为3.87μg/mL,对MDCK细胞的半数抑制浓度IC50为5.99μg/mL。在相同样品浓度下,对肝癌细胞HepG2的抑制能力要强于对狗肾上皮细胞MDCK,特别是在较低用药浓度下,其差异则更为明显。
舒少华[5]2009年在《栝楼抗肿瘤蛋白的纯化及活性研究》文中认为栝楼(Trichosanthes kirilowii Maxim)为葫芦科栝楼属植物,在我国主要分布于山东、河南、山西、陕西、江苏、浙江、安徽、四川、云南等省市。主要以果实和根部入药,均是历史悠久的常用中药材。瓜蒌,中国药典载为栝楼的果实,主要用来治疗心、肺方面的疾病。天花粉则来源于栝楼的块根,主要用于中期引产,主要成分为天花粉蛋白。天花粉蛋白曾在20世纪70年代在我国被广泛使用,但由于其在临床上容易引起发热、休克甚至死亡等过敏性反应,目前临床上很少使用。国外一些学者研究发现天花粉蛋白是一种单链核糖体失活蛋白,具有抗病毒、抗肿瘤等活性,尤其对HIV具有很好的抑制效果,因此天花粉蛋白又逐渐引起了人们的关注,但其毒副作用同样限制了其临床使用。目前很多医药工作者开始转向于寻找新的具有较低毒副作用的核糖体失活蛋白。本研究从所收集到的不同种质资源的栝楼中成功的分离、纯化到一种核糖体失活蛋白—Trichosanthrip,并对其性质和抗肿瘤活性进行了研究,取得了如下结果:1.从14份不同居群栝楼的种子中,采用硫酸铵分级沉淀、阳离子交换色谱和葡聚糖凝胶过滤色谱成功的纯化到了Trichosanthrip,经测定其纯度高达96.6%,产率为1 mg/100g种仁。2.Trichosanthrip经胰酶降解后使用LC-MS/MS分析,发现Trichosanthrip为AAI_LTSS超级蛋白质家族的一种新蛋白质。此类蛋白质广泛存在于植物的种子中,是植物种子中的一种自我防卫物质,具有抗真菌、病毒、细菌等病原物及抗昆虫的活性。3.使用MALDI-TOF MS精确测定Trichosanthrip分子量为10964.717 D;Trichosanthrip具有很好的RNA N-糖苷酶活性和蛋白质生物合成抑制活性,对蛋白质生物合成的IC_(50)为1.6 ng/ml。4.Trichosanthrip能体外抑制S_(180)肿瘤细胞增殖,使S_(180) G0/G1期细胞增加,S期细胞减少,导致其出现G0/G1期细胞阻滞现象,其对S_(180)的IC_(50)为19.91μg/mL。5.Trichosanthrip能明显的抑制接种S_(180)昆明种小鼠体内肿瘤生长,在1.5mg/kg·d剂量下,抑瘤率可达91.36%;在最高剂量1.5 mg/kg·d下,Trichosanthrip对小鼠的体重、脾脏指数和胸腺指数几乎无影响,其体重和脏器指数与空白对照无明显变化;且Trichosanthrip对小鼠的急性毒性很小,LD_(50)为103 mg/kg,且当剂量达到75 mg/kg时才表现出急性毒性,远远高于实体瘤抑制实验中的最大剂量。
赵琦[6]2006年在《麻疯树（Jatropha curcas）核糖体失活蛋白（curcin）的分离纯化、活性检测及抗肿瘤活性初探》文中研究指明麻疯树为大戟科麻疯树属植物，在我国的西南地区有着丰富的资源。以四川攀西地区采集的麻疯树为材料，采用改进的硫酸铵分级沉淀和阳离子交换层析法从麻疯树种仁中分离纯化出麻疯树核糖体失活蛋白(Ribosome Inactiviting Protein)Curcin。Curcin的纯度更高，得率也达到1‰左右建立了一种非放射性的利用兔网织红细胞裂解液(Rabbit Reticulocyte Lysate)无细胞翻译系统和荧光素酶检测系统的核糖体失活蛋白检测方法，快速检测了两种方法提取的麻疯树核糖体失活蛋白(RIPs)Curcin的无细胞蛋白质翻译抑制活性，测得离子交换层析法纯化Curcin samplel IC_(50)=0.045±0.009nM，分子筛层析纯化Curcin sample2 IC_(50)=0.217±0.026nM；该方法避免了放射性同位素的使用，使检测过程简便、快速、安全、准确。同时我们还对试验条件，包括反应时间、温度，缓冲液PH值、盐浓度等进行了摸索和优化。 体外生物学活性试验表明，curcin对HepG2肝癌细胞、SP2／0小鼠骨髓瘤细胞、小细胞肺癌细胞NCL—H446、小鼠肉瘤腹水型细胞S-180、胃癌细胞SGC7901都没有表现出明显的抑制作用，但是却能够诱导S-180细胞凋亡，荧光显微镜观察下，可以见到明显的凋亡细胞，流式细胞仪测定细胞周期，有明显的亚二倍体凋亡峰。 利用与巯基反应特异性很高的PEG-maleimide将PEG定点偶联到的Cys残基巯基侧链上进行了定点PEG修饰，得到均一的修饰产物。
杨洲平[7]2007年在《苦瓜抗HIV毒蛋白MAP30基因的克隆及原核表达》文中提出Ⅰ型核糖体失活蛋白MAP30，是从苦瓜种子和果实中分离纯化的一种HIV病毒抑制剂，具有抗病毒、抗肿瘤和抗菌作用。本文根据已发表的MAP30基因的序列比对结果，采用PCR法从精选白皮苦瓜(JX)、穗农早优苦瓜(ZY)、碧翠苦瓜(BC)、银田长白苦瓜(YT)和银田蓝山大白苦瓜(LAN)5个品种中克隆得到5个长度均为861bp的MAP30基因，即JX-MAP30、ZY-MAP30、LAN-MAP30、BC-MAP30(Genebank accession No：DQ643967)和YT-MAP30(DQ643968)，其中除BC-MAP30和YT-MAP30基因与已报道的MAP30基因(AJ294541)不同，存在变异位点外，其余均相同。因此，本研究重点对BC-MAP30和YT-MAP30的核苷酸以及推测的氨基酸序列进行了分析，并利用生物信息学方法对其蛋白质二级结构作了预测。此外，还对YT-MAP30基因的完整编码区(YT_f)和成熟蛋白编码区(YT_m)片段同时进行了原核表达工程菌的构建、表达条件的优化以及表达产物的SDS-PAGE检测、可溶性分析和蛋白质杂交分析等研究工作。其主要结果如下：1．序列分析表明，BC-MAP30和YT-MAP30的核苷酸序列与已报道的MAP30基因分别存在2个和3个碱基的不同，但均编码263个氨基酸残基组成的成熟蛋白。2．BC-MAP30和YT-MAP30基因的推导氨基酸序列与其他葫芦科植物的Ⅰ型核糖体失活蛋白以及天花粉毒蛋白、多花白树毒蛋白、肥皂草毒素蛋白的氨基酸序列同源性分别为68.90％、82.75％、71.25％和66.45％，且其第90～220位氨基酸序列较为保守。利用生物信息学进行的二级结构预测表明，在BC-MAP30和YT-MAP30蛋白的整个二级结构中，无规则卷曲含量最高，其次是α-螺旋和β-折迭。信号肽区富含α-螺旋和无规则卷曲；N-端区富含β-折迭和无规则卷曲：高度螺旋区富含α-螺旋；C-端则富含无规则卷曲。3．DNA测序结果表明，在重组表达质粒中，YT_f-MAP30和YT_m-MAP30的序列和插入位点正确。SDS-PAGE分析结果显示，pET-YT_m／MAP30-BL21工程菌在30℃、1mmol／LIPTG诱导4h后，在35kD处出现一条增加的表达蛋白条带，且以可溶形式表达。4．蛋白质分子杂交表明，重组蛋白对鼠抗His-tag多克隆抗体具有特异抗性。5．pET-YT_f／MAP30-BL21工程菌经不同诱导时间、诱导温度和不同浓度诱导物IPTG诱导，SDS-PAGE分析均无特异的表达蛋白条带出现，表明YT_f-MAP30信号肽的存在影响其在E．coli BL21(DE3)PlysS系统中的原核表达。
杨忠亮[8]2007年在《黑木耳核糖体失活蛋白的分离纯化与性质研究》文中研究说明核糖体失活蛋白(ribosome-inactivating protein，RIP)是一类广泛存在于植物界中的毒蛋白，具有独特的酶学机制和生物学功能。目前报道的RIP大多来自高等植物，在食用菌中也有一些发现。本实验运用多种蛋白质纯化技术，成功地从黑木耳菌丝体中分离得到RIP，并对其性质和活性进行鉴定。分别通过纤维素DE-52阴离子交换层析、Affi-gel blue亲合层析、Sephadex G-75凝胶过滤层析叁种层析方法逐步纯化RIP，在每步纯化之后，用紫外测定法、SDS-PAGE电泳法和家兔网织红细胞裂解液体外翻译等方法对所得蛋白的含量、分子量及对蛋白质体外合成抑制活性进行测定，将有抑制作用活性的目的蛋白混合物继续纯化，最终分离得到高纯度的黑木耳核糖体失活蛋白G2。高效液相色谱检测其纯度达99.3％。然后对此RIP进行RNAN-糖苷酶活性检测和抑制蛋白质体外翻译合成活性检测，二者均呈阳性反应，从而证明G2为黑木耳核糖体失活蛋白，是一种新发现的蛋白，为真菌蛋白质库增加一种新资源，为RIP的开发与利用提供一种新材料，为进一步克隆该核糖体失活蛋白基因作了良好前期研究工作。
蔡秀清[9]2005年在《α-苦瓜素在毕赤酵母中表达及生物活性分析》文中进行了进一步梳理α-苦瓜素(alpha-momorcharin,a-MMC)是苦瓜种仁的一种单链糖蛋白,具有堕胎、抗肿瘤、抗菌及抗病毒等多种生物功能。α-MMC含有23个氨基酸的信号肽和263个氨基酸的成熟肽,糖基化位点位于Asn-227,侧链位于Trp-70负责活性中心Glu-160的开关。α-MMC属于Ⅰ型核糖体失活蛋白,具有N-糖苷酶、RNase及DNase活性,α-MMC的多种生物功能可能都与其核糖体失活的性质有关。本研究利用基因工程技术生产重组α-MMC,这将为其作用机理的进一步研究奠定基础。 本研究采用RT-PCR技术从新鲜苦瓜叶片中获取成熟肽基因编码区cDNA(命名为α-MMCC);将扩增得到的基因片段插入克隆载体pGEM-T Easy Vector中,酶切鉴定正确后进行序列测定,结果证明得到的α-MMCC与预计的核苷酸序列完全一致;构建了携带有α-MMCC的毕赤氏酵母分泌型表达质粒pPICZαB/α-MMCC,重组质粒经Sac Ⅰ线性化后转化宿主菌GS115,通过基因组PCR鉴定重组子及其表型。在此基础上通过正交实验优化甲醇诱导条件,经SDS-PAGE及Western blot分析鉴定,筛选高效表达菌株。重组酵母在pH值为6.0的BMGY中增殖培养,甲醇终浓度为1.0%的BMMY(pH 6.5)中诱导72h,重组蛋白可达总蛋白量的15%左右。 发酵上清液利用镍琼脂糖凝胶FF亲和层析分离纯化,纯度达90%以上。活性分析表明,重组α-MMC对Hela有明显的生长抑制效应,且呈剂量和时间依赖性。重组α-MMC抑制肿瘤生长的作用机理还有待进一步研究。
韩晓红[10]2011年在《重组蛋白MAP30诱导EC-1.71和BGC-823细胞凋亡及其机制的初步研究》文中研究说明目的：江苏省是食管癌和胃癌高发区,目前治疗方法主要有手术切除、化疗和放疗,这些方法不仅副作用大,价格昂贵,而且易产生耐药,加之其作用的非特异性,在杀伤肿瘤细胞的同时也影响正常组织细胞的代谢,降低机体的免疫力,下调免疫监视功能。有鉴于我国传统中医中药扶正祛邪的理论,在上述常规或减量治疗的基础上辅以中医中药,既协助对肿瘤的杀伤作用,又从整体水平调节机体的免疫平衡状态,发挥祛邪扶正之功效。可见,开发一种治疗效果好,副作用小的抗瘤中药,挖掘我国传统医药宝库有着十分重要的意义。苦瓜不仅是民间喜爱的食物,而且资源丰富,价廉,毒性低,具有清热解毒、降低血糖、抗突变、抗病毒、抗HIV、抗肿瘤、抗菌及免疫调节等作用,若将苦瓜开发成安全有效的天然药物,其意义非常重大。从苦瓜中分离的生物活性物质中最引人注目的是一组核糖体失活蛋白(ribosome inhibiting protein, RIP),根据其肽链数目的不同分为Ⅰ型和Ⅱ型两种。Ⅰ型RIP具有抗肿瘤和抗病毒等生物学活性,其抗肿瘤功能的重要机制之一是诱导细胞凋亡。MAP30 (momordica anti-HIV protein of 30kDa)是一种Ⅰ型核糖体失活蛋白,由于MAP30不能进入正常细胞,故对正常细胞没有毒性作用。最近研究表明MAP30具有抗肿瘤活性,能够诱导多种肿瘤细胞凋亡,但其凋亡机制尚未十分清楚。本文通过分子克隆技术克隆表达并纯化了苦瓜重组MAP30融合蛋白,探讨了其诱导人食管癌细胞EC-1.71和人胃癌细胞BGC-823的凋亡作用及其凋亡机制。方法：(1)应用PCR技术从苦瓜基因组中扩增出MAP30基因片段,将其TA克隆和测序,并构建重组表达载体pET-28a-MAP30,转化到表达菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,用NTA-Ni2+树脂分离纯化所表达的MAP30融合蛋白,纯化后蛋白经SDS-PAGE电泳鉴定。(2)重组MAP30融合蛋白分别与人食管癌细胞EC-1.71和人胃癌细胞BGC-823共培养,通过细胞计数法、MTT实验、集落形成试验、裸鼠致瘤实验和小鼠转移瘤实验检测重组KAP30融合蛋白对人食管癌细胞EC-1.71增殖的抑制作用,通过细胞计数法、MTT实验和裸鼠致瘤实验检测重组MAP30融合蛋白对人胃癌细胞BGC-823增殖的抑制作用；运用光学显微镜、电子显微镜和荧光染色观察重组MAP30融合蛋白对人食管癌细胞EC-1.71和人胃癌细胞BGC-823形态的影响；通过DNA琼脂糖凝胶电泳(DNA Ladder)和流式细胞术来分析重组MAP30融合蛋白诱导人食管癌细胞EC-1.71的凋亡作用,通过流式细胞术来分析重组MAP30融合蛋白诱导人胃癌细胞BGC-823的凋亡作用。(3)通过JC-1荧光探针检测重组MAP30融合蛋白作用后人食管癌细胞EC-1.71和人胃癌细胞BGC-823线粒体膜电位(△Ψm)的变化；通过ELISA法检测重组MAP30融合蛋白作用后人食管癌细胞EC-1.71培养上清液中Cytc和TNF-α的变化以及人胃癌细胞BGC-823培养上清液中Cytc的变化；通过免疫细胞化学法检测重组MAP30融合蛋白作用后人食管癌细胞EC-1.71中ERK1、PERK1, AKT/PAKT,NF-κB和c-jun的表达以及人胃癌细胞BGC-823中NF-κB的表达；通过荧光酶标仪检测重组MAP30融合蛋白作用后人食管癌细胞EC-1.71和人胃癌细胞BGC-823的Caspase-12活性变化；通过RT-PCR检测重组MAP30融合蛋白作用后人胃癌细胞BGC-823 caspase-9和Apaf-1 mRNA的表达；通过分光光度法检测人胃癌细胞BGC-823的Caspase-3活性,初步探讨了重组MAP30融合蛋白诱导人食管癌细胞EC-1.71和人胃癌细胞BGC-823凋亡的机制。结果：(1)成功扩增出MAP30基因,长度为861bp,与GenBank中公布的DQ643967序列相比同源性为100%,与DQ643968和S79450序列相比同源性为99%；成功构建pET-28a-MAP30原核表达重组质粒,并获得了重组MAP30融合蛋白,大小约为30KDa,与预测一致。(2)重组MAP30融合蛋白体内外均可以抑制人食管癌细胞EC-1.71增殖,其作用呈剂量-效应依赖关系,IC50为82.86μg/mL；重组MAP30融合蛋白作用于人食管癌细胞EC-1.7148小时和72小时后,光学显微镜下可见细胞变圆,固缩,体积缩小,细胞膜发泡,可见凋亡小体,细胞分散并有少量细胞浮起；电子显微镜下可见细胞固缩,体积缩小,细胞核片段化,核染色质聚集成块并靠近核膜,核膜扭曲,内质网高度膨胀、扩张；荧光染色结果显示重组MAP30融合蛋白在体外可诱导人食管癌细胞EC-1.71凋亡,但是不具有剂量-效应关系；流式细胞仪检测结果显示随着重组MAP30融合蛋白剂量的增加,G0/G1期细胞百分数增加,而S期细胞百分数减少；但DNA片段检测在琼脂糖凝胶电泳中未观察到典型的“阶梯状”图谱。(3)重组MAP30融合蛋白体内外均可以抑制人胃癌细胞BGC-823增殖,其作用呈剂量-效应依赖关系,IC50为51.67μg/mL；重组MAP30融合蛋白作用于人胃癌细胞BGC-823后,光学显微镜下可见细胞变圆,固缩,体积缩小,细胞膜发泡,可见凋亡小体；电子显微镜下可见细胞表面微绒毛消失,细胞缩小,细胞核浓缩,染色质凝集,核膜褶皱,细胞质浓缩；荧光染色结果显示重组MAP30融合蛋白在体外可诱导人胃癌细胞BGC-823凋亡；流式细胞仪检测结果显示随着重组MAP30融合蛋白剂量的增加,细胞的亚二倍体核峰逐渐升高。(4)重组MAP30融合蛋白作用于人食管癌细胞EC-1.71后,细胞的△Ψm水平下降,细胞培养上清液中Cytc和TNF-α含量增加,胞质中ERK1、AKT表达增强而胞核中PERK1、PAKT表达降低(ERKl、AKT磷酸化减少),NF-κB活性降低,Caspase-12活性增强,但细胞核内原癌基因蛋白c-Jun表达未见明显变化。(5)重组MAP30融合蛋白作用于人胃癌细胞BGC-823后,细胞的△Ψm水平下降,细胞培养上清液中Cytc含量增加,细胞的caspase-9和Apaf-1的mRNA表达增强,caspase-3活性增强,但细胞的caspase-12含量无明显变化,并且重组MAP30融合蛋白能活化人胃癌细胞BGC-823的核转录因子NF-κB.结论：(1)本研究成功构建了pET-28a-MAP30表达载体,并获得了重组MAP30融合蛋白。(2)重组MAP30融合蛋白体内外均具有抑制人食管癌细胞EC-1.71和人胃癌细胞BGC-823增殖的作用,其作用呈剂量-效应依赖关系。(3)重组MAP30融合蛋白可以诱导人食管癌细胞EC-1.71和人胃癌细胞BGC-823凋亡。(4)重组MAP30融合蛋白诱导人食管癌细胞EC-1.71凋亡可能与内质网通路和NF-κB通路有关,但其具体机制尚有待进一步研究。(5)重组MAP30融合蛋白可以活化人胃癌细胞BGC-823的核转录因子NF-κB,其诱导人胃癌细胞BGC-823凋亡的作用可能与线粒体途径有关,但其具体机制尚有待进一步研究。
参考文献：
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[9]. α-苦瓜素在毕赤酵母中表达及生物活性分析[D]. 蔡秀清. 华南热带农业大学. 2005
[10]. 重组蛋白MAP30诱导EC-1.71和BGC-823细胞凋亡及其机制的初步研究[D]. 韩晓红. 江苏大学. 2011