魏国[1]2004年在《紫花苜蓿中植物生长抗逆活性成分的研究》文中研究指明为了进一步鉴定紫花苜蓿(Medicago sativa L.)中的植物生长抗逆活性物质，为开发新型的植物生长调节剂做准备，我们对该植物的化学成分及其生物活性进行了详细研究。从紫花苜蓿的地上部分共分离得到16个化合物，其结构经光谱学方法分别被鉴定为苯甲酸、邻羟基苯甲酸、香草酸、β—谷甾醇、尿嘧啶、环(L—亮—L—异亮)、环(L—脯—L—丙)、环(L—脯—L—亮)、环(D—脯—L—缬)、柯厄醇、芹菜苷元、苜蓿素、7，4′—二羟基黄酮、考迈斯托醇、苜蓿酚和D-蒎立醇。其中化合物环(L—亮—L—异亮)、环(L—脯—L—丙)、环(L—脯—L—亮)和环(D—脯—L—缬)均为首次从该属植物分离得到。 植物生长活性实验表明，酚酸和黄酮类化合物在低浓度下可以轻微促进小麦(Triticum aestivum L.)根和芽的生长，浓度较高时转为抑制活性，且以抑制为主。环(L—亮—L—异亮)显着促进小麦根的生长，对芽没有作用。环(L—脯—L—亮)和环(D—脯—L—缬)都可以促进小麦根和芽的生长，但对芽的活性更为明显。环(L—脯—L—丙)对根和芽都为抑制作用。本文对环二肽化合物的构效关系也进行了简要讨论。两个香豆素类化合物的植物生长活性完全相反，苜蓿酚可以明显促进小麦根的生长，对芽的作用较弱；考迈斯托醇却对根和芽都呈现抑制作用。
张咏梅[2]2008年在《苜蓿总黄酮的提取方法、药效以及多种豆科牧草次生代谢产物的研究》文中研究表明苜蓿、小冠花、百脉根、红豆草、鹰嘴紫云英、白叁叶、黄花草木樨等优质豆科牧草含有丰富的次生代谢产物。本文以这几种豆科牧草为试验材料,对其总黄酮和总皂苷的积累规律进行了研究。同时为充分利用苜蓿中的黄酮类物质,提高苜蓿的经济附加值,分别采用微波和超声波辅助技术提取苜蓿总黄酮,对影响提取量的乙醇浓度、固液比、作用时间、微波功率、超声波温度、提取次数等进行了单因素试验,并在此基础上对各因素的互作效应进行了4因素3水平的正交试验。从而确定了最佳提取工艺,用于生产中提取苜蓿总黄酮。采用柱层析等多种分离手段对苜蓿活性成分进行了分离。并对苜蓿粗提液的药效进行了研究。为建立科学合理的牧刈制度,高效提取天然活性成分,为综合利用优质牧草提供指导依据。研究结果表明:微波辅助技术提取苜蓿总黄酮优选条件为:40%乙醇、1:30固液比,在500W功率下作用60s。这个工艺提取条件温和,温度不超过50℃;节能,耗电量只有0.008千瓦时;省时,提取时间只有超声波法的1/9,冷浸法的1/540;节约有机溶剂,同时无噪音污染。小冠花、百脉根、红豆草、紫云英、草木樨、白叁叶6种豆科牧草的总黄酮含量普遍高于甘农3号、新疆大叶、低纤维苜蓿和白花苜蓿;而总皂苷含量整个生育时期均低于苜蓿4个品种。且这几种豆科牧草茎、叶、花、全株中总黄酮和总皂苷含量有极显着差异(P<0.01),在整个生育时期,均为叶片中含量多于茎秆。小冠花、百脉根、红豆草、紫云英、草木樨、白叁叶6种豆科牧草可作为提取总黄酮的优质材料;由于其总皂苷含量较低,不会造成家畜臌胀病,可在地上部生物量最高时刈割,用于青饲或调制干草。苜蓿总皂苷含量丰富,是提取皂苷产品的优质材料。对苜蓿中的天然活性物质进行分离,乙酸乙酯层主要含有2-甲叉-3-胆甾烷醇和3,5-二烯豆甾烷两种活性物质。氯仿层主要含有维生素D3活性物质。正丁醇层所含有活性物质种类较多,有6种天然活性成分,分别为芳樟醇、香芹醇、苦杏仁苷、氧化石竹烯、乙酸维生素A和邻苯二甲酸二丁酯。苜蓿提取液具有增强小鼠机体非特异性免疫功能和特异性免疫(体液免疫)功能的作用;体外具有抗菌作用,对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有直接的抑制作用;对血脂具有双向调节作用,低剂量时具有降脂作用,减少了机体产生冠心病的危险,而高剂量时增加了冠心病发生的机率;苜蓿提取液具有抗氧化作用,显着升高机体肝和肾组织的SOD活性,降低MDA的含量。
高微微[3]2004年在《苜蓿生物活性及影响其黄酮和皂苷成分因素的研究》文中认为紫花苜蓿(Medicago sativa L．)为豆科多年生牧草植物，在民间作为传统草药用于治疗消化不良、肺热咳嗽、黄疸、膀胱结石等症。目前，我国苜蓿种植面积2000多万亩，年干草产量达到2000多万吨，对苜蓿的开发利用研究，主要集中在饲料价值和干革加工技术方面，对其生物活性方面研究很少，因此，目前绝大部分苜蓿是以干草或草粉的形式饲喂畜禽，少部分经过加工的苜蓿叶蛋白也是作为动物营养补充剂，产品的经济附加值较低。丰富的苜蓿资源可能蕴藏着许多潜在的生物活性成分有待开发，因此，本论文对苜蓿的生物活性及影响其黄酮和皂苷成分的因素进行了系统研究，旨在弥补我国在苜蓿资源药用价值研究方面的不足，为指导苜蓿育种、栽培以及合理利用苜蓿资源提供理论依据。 一、紫花苜蓿提取物的生物活性研究 以肉仔鸡为实验动物，在饲料中分别添加300mg／kg、600mg／kg、900mg／kg 3个剂量的苜蓿提取物，实验发现添加600mg／kg、900mg／kg苜蓿提取物能够显着提高(p＜0.05)21～42日龄肉仔鸡体重及日增重；3个剂量组在1～7日龄时，可降低料肉比9.3％～19.6％，从而提高饲料转化率；3个剂量组肉鸡腹脂率降低14.7～28.7％，胸肌率提高9.7％～26.4％。研究发现苜蓿提取物体外对鸡大肠杆菌无抑菌作用，但在体内显着降低鸡肠道内大肠杆菌数量(p＜0.05)，肉仔鸡早期腹泻率比对照降低27.2～55.8％，存活率有所提高；添加300mg／kg、600mg／kg苜蓿提取物对肉仔鸡免疫器官及细胞免疫也有一定的促进作用。 二、苜蓿黄酮、皂苷类成分的影响因素及化学成分研究 建立了苜蓿总黄酮及总皂苷的测定方法，两种方法的精确性、重复性、稳定性及加样回收率等各项指标的RSD值均小于0.05％。在此基础上，从品种、生态型、生育期、采收季节、生长年限、虫害、病害等7个方面，根据231多个样品的测定结果，对影响苜蓿黄酮及皂苷的因素进行了系统的研究，并通过HPLC-MS技术对染病叶片中化合物的变化进行了分析，结果如下： (1)北京地区栽培的45个紫花苜蓿品种中(包括育成品种、地方品种以及栽培面积较大的引进品种)，73.3％的品种总黄酮含量在0.6％～0.9％之间，皂苷含量在0.7％～1.2％之间分布相对较为平均。秋眠级从2～9的6个品种总黄酮、总皂苷含量没有规律性变化，品种的抗寒性与其
彭宝安[4]2010年在《紫花苜蓿鲜草对母猪生产性能的影响及其机理研究》文中进行了进一步梳理本试验在妊娠期母猪饲粮中用不同水平的苜蓿鲜草替代精料,研究了苜蓿鲜草对母猪日粮消化率、母猪体况、母猪泌乳期采食量、生产性能、血清指标、性激素及母猪初乳乳品质的影响,具体试验结果如下所述:试验一:试验选用配种时间、胎次、上胎产仔数、体况等基本一致的大长二元母猪30头,采用单因素完全随机设计,共分为6个组,每组5头猪,每头猪一个重复。对照组饲喂基础日粮,试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组分别用紫花苜蓿鲜草代替10%、20%、30%、40%的基础日粮(按干物质折算),试验Ⅴ组用紫花苜蓿草粉代替20%的基础日粮。结果表明:⑴和对照组相比,在妊娠母猪饲粮中无论是用不同比例的紫花苜蓿鲜草还是用20%的苜蓿草粉代替精料,均提高了粗蛋白质、粗灰分、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、钙和总磷的表观消化率。其中试验Ⅲ组的提高幅度最大,极显着高于对照组(P﹤0.01);随着紫花苜蓿鲜草替代量的增加,粗脂肪的表观消化率依次下降,但苜蓿草粉组的粗脂肪表观消化率和对照组几乎无差别。⑵随着紫花苜蓿鲜草替代量的增加,繁殖期母猪体增重和背膘增加量均呈先升后降的趋势,而妊娠期母猪背膘增加量和泌乳期母猪背膘减少量依次下降。和对照组相比,在妊娠期母猪饲粮中以紫花苜蓿鲜草和草粉替代等干物质量的精料,均提高了母猪的采食量,其中试验Ⅲ组的采食量最大,极显着高于对照组(P﹤0.01)。紫花苜蓿鲜草和草粉替代精料后,断奶至发情时间间隔有所缩短,但各组之间差异不显着(P﹥0.05)。⑶随着紫花苜蓿鲜草替代精料量的增加,增加了初生窝产仔猪总数、初生窝产活仔数、断奶仔猪数、断奶窝重、断奶窝平均日增重;鲜草试验组(试验Ⅲ组除外)的断奶仔猪个体重和对照组相似,试验Ⅴ组显着(P﹤0.05)高于对照组和其余各试验组,试验Ⅴ组的断奶仔猪日增重也极显着(P﹤0.01)高于对照组和其它试验组。综合分析认为,母猪妊娠期饲粮中用30%的紫花苜蓿鲜草代替精料取得了最好的经济效益。实验二:试验设计同上,结果表明:⑴用紫花苜蓿鲜草替代精料,提高了母猪血清中总蛋白、高密度脂蛋白胆固醇、血糖、碱性磷酸酶、免疫球蛋白G和免疫球蛋白M的含量,降低了总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇和甘油叁酯的含量,改善了母猪的血清脂质代谢。⑵苜蓿鲜草和草粉对母猪妊娠期的性激素有积极的调节作用,对母猪的产仔数有很大改善。⑶随着紫花苜蓿鲜草替代量的增加,母猪初乳的乳脂肪、乳蛋白、乳糖和干物质都呈先升后降的趋势,都是以试验Ⅲ组最高。其中,乳脂肪和乳糖试验Ⅲ组显着(P﹤0.05)高于对照组,干物质试验Ⅲ组极显着(P﹤0.01)高于对照组,乳蛋白各组之间差异不显着(P﹥0.05)。⑷苜蓿鲜草和草粉提高了母猪初乳乳清和仔猪血清中免疫球蛋白的含量,其中添加30%苜蓿鲜草的提高幅度最大,极显着(P﹤0.01)或显着(P﹤0.05)高于对照组。
田鹏[5]2009年在《蚓激酶转基因苜蓿（Medicago sativa）及丹参（Salvia miltiorrhizae）的构建及检测》文中研究指明蚯蚓纤溶酶(Earthworm Fibrinolytic Enzymes,EFE),又称蚓激酶,属于多组分的蛋白水解酶类,它们广泛分布于多种蚯蚓的消化道内腔及体液中,可能与摄取食物的吸收和利用有关。蚓激酶可以直接水解纤维蛋白,因此,它们既具有溶解现有血栓、也同时具有阻止血栓继续形成的功效;此外,有部分种类的蚓激酶还可以将纤溶酶原激活并转化为纤溶酶、或刺激人血管内皮细胞释放组织纤溶酶原激活剂(t-PA),从而能够间接溶解血栓。与其它溶栓剂所不同的是,蚓激酶的毒副作用比较小,而且还可以口服给药,因此,作为一种新型的溶栓药剂,无疑具有十分广阔的应用前景。目前,在临床上应用的蚓激酶均源自人工饲喂的蚯蚓,然而,依靠人工从蚯蚓中提取蚓激酶仍然存在很多问题,比如蚯蚓饲养和繁殖周期长,生产工艺复杂和生产质量不稳定等,这些不利因素都在很大程度上制约了蚓激酶的规模化生产、利用及普及。在转基因植物中表达蚓激酶单一组分,开辟了利用植物生物反应器生产蚓激酶的新领域,可为今后蚓激酶药物降低生产成本和在临床上的更广泛应用奠定坚实基础。本研究选用苜蓿和丹参这两种常见的植物作为表达蚓激酶单一组分的宿主植物,这是因为:1)苜蓿是世界上最重要的豆科牧草之一,具有品质优、产量高、适应性强、易于贮存以及加工等许多的优点,此外,其作为生物反应器生产的重组类蛋白药物可直接口服,而且无毒无害,便于今后的规模化生产和推广;2)丹参作为一味历史悠久的中药,其本身具有扩张冠状动脉、降低胆固醇和血脂、抑制凝血和激活纤溶系统等多种作用,在临床治疗心脑血管疾病方面应用广泛且疗效十分显着。若实现蚓激酶在丹参中的表达,可通过二者的协同作用,进一步增强丹参在防治心血管疾病方面的疗效,改善丹参的药用品质。在苜蓿生物反应器构建过程中,利用本课题组先前建立的比较成熟的苜蓿组织培养再生体系,通过农杆菌介导方法,成功地将蚓激酶CST1和CST2-1基因分别导入到保定苜蓿中,先后获得转CST1基因的卡那霉素抗性再生苗130株和转CST2-1基因的卡那霉素抗性再生苗92株。对这些转基因植株进行PCR和PCR Southern检测,结果证实多数卡那霉素抗性植株分别含有上述蚓激酶编码组分。从PCR检测为阳性的转CST2-1基因再生植株中,任意选取两株进行基因组DNA Southern Blot检测,结果证实目的基因CST2-1确实已整合到苜蓿基因组中。通过ELISA,对外源蛋白表达情况进行了检测与分析,结果发现多数卡那霉素抗性植株在405nm处的吸光值都大于非转基因苗(阴性对照),但与蚓激酶肠溶胶囊溶剂相比,其数值偏低,这表明蚓激酶基因在转基因苜蓿细胞中是有表达的,但表达效率非常低。外源转基因遗传稳定检测结果发现,经多3～5次无性继代培养后的转基因苜蓿叶片在含有卡那霉素的培养基上仍能正常分化出健康的愈伤组织,这表明外源的蚓激酶基因在转基因苜蓿中通过无性繁殖可以稳定遗传给后代。在丹参生物反应器构建过程中,首先通过对丹参的转化和培养条件进行了优化,使丹参再生幼苗的褐化和玻璃化现象大大减轻,更加完善了丹参的组织培养遗传转化再生体系。通过农杆菌介导方法,同样成功地将蚓激酶CST1和CST2-1基因分别导入到丹参中,分别获得卡那霉素抗性再生苗25株和33株。对这些再生植株进行PCR和PCR Southern检测和分析,结果证实多数卡那霉素抗性植株分别含有上述蚓激酶编码组分。从PCR检测为阳性的转CST2-1基因再生植株中,任意选取两株进行基因组DNA Southern Blot检测,结果证实目的基因CST2-1确实已整合到丹参基因组中。同样利用ELISA法对蚓激酶外源蛋白表达情况进行了检测与分析,结果发现外源蛋白表达普遍微弱,在一定程度上稍微高于转基因苜蓿的结果类似。外源转基因遗传稳定检测结果发现,经多3～5次无性继代培养后的转基因丹参叶片在含有卡那霉素的培养基上仍能正常分化出健康的愈伤组织,这表明外源的蚓激酶基因在转基因丹参中通过无性繁殖可以稳定遗传给后代。
阿布都卡地尔·阿布力孜[6]2012年在《骆驼刺（Alhagi pseudalhagi Desv）拮抗内生菌活性单体分析及其相关基因初步研究》文中认为本研究从新疆传统药用植物骆驼刺(Alhagi pseudalhagi Desv)内生菌中筛选出一株对玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)和玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)具有较强抑制活性的拮抗内生细菌XJAS-AB-13,根据生理生化特征、16SrDNA序列将XJAS-AB-13鉴定为Bacillus.subtilis (GeneBank注册号：JF826131)。对病原真菌宿主植物活体(SC-704号玉米)检测新筛选出的骆驼刺拮抗内生细菌XJAS-AB-13和本实验室已筛选的拮抗内生细菌XJAS-AB-11发酵液对玉米大小斑点病菌的抑制活性,研究表明,其中XJAS-AB-13发酵液对玉米大斑和小斑病菌防病效率分别为63.33%和45%,分别达0.1%多菌灵防病率的80.85%和64.28%。XJAS-AB-11发酵液对玉米大斑和小斑病菌防病效率分别为23.33%和58.34%,分别达0.1%多菌灵防病率的29.78%和83.34%。防御酶活性测定结果表明,拮抗菌发酵液能减轻玉米斑点病菌侵染玉米叶片时的毒素含量,有效地防治病情发生。通过硅胶柱层析对拮抗内生细菌XJAS-AB-11发酵液活性部位乙酸乙酯萃取物进行分离纯化,最终得到两种单体,其命名为XJAS-B和XJAS-G。根据1HNMR和13CNMR波谱数据以及ESI-MS分子量将XJAS-B和XJAS-G分别鉴定为环[D-亮氨酰-4-羟基-L-脯氨酸]二肽和4H-1-苯并吡喃4,2-(3,4-二羟基苯基)-3,5,7-叁羟基黄酮(槲皮素)。按照Bacillus subtilis BSn5假定柚皮查尔酮合酶基因序列设计的Bsn引物和文献查到的Bacillus subtilis bcsA-ypbQ操纵子查尔酮合酶基因BpsA引物分别对XJAS-AB-11查尔酮合酶基因(黄酮类化合物合成途径的关键酶)进行PCR扩增,对BpsA扩增的PCR产物进行TA克隆,测序比对分别获得823bp(Bsn)和1014bp(BpsA)的查尔酮基因部分序列。对BpsA引物扩增TA克隆测序后的XJAS-AB-11查尔酮合酶氨基酸序列进行分析,XJAS-AB-11查尔酮合酶氨基酸序列与已实验验证的放线菌Streptomyces griseus查尔酮合酶、紫花苜蓿Medicago sativa查尔酮合酶malonyl-CoA结合亚基(ExPDB:1cm1A)、花生Arachis hypogaea苯乙烯合成酶(ExPDB:1z1eA)以及非洲菊Gerbera hybrida的查尔酮合酶蛋白序列具有较高的同源性。不同物种查尔酮合酶活性部位氨基酸序列(实验验证的)与XJAS-AB-11CHS氨基酸序列ClustalW2比对显示XJAS-AB-11CHS氨基酸序列含有与放线菌Streptomyces griseus查尔酮合酶活性部位氨基酸相似的氨基酸序列。据文献报道,XJAS-B及其结构类似物具有较强的抗菌和癌细胞增殖抑制活性,且XJAS-G具有较强的抗菌活性。本研究结果对于新型天然药物资源的开发利用以及取代对药用植物的采伐或对其进行资源保护有一定的现实意义。此外,在阐明内生菌代谢物活性成分的合成机制、分析和揭示植物内生菌与宿主间的基因水平转移或其它寄生关系等方面具有一定的参考价值。
刘俊艳[7]2010年在《紫花苜蓿夏季抗热性研究》文中研究指明为满足生产需要,鉴定筛选出一批抗热性较强的苜蓿品种,以适合不同地区种植。(1)在高温胁迫条件下对不同品种紫花苜蓿叶片中POD, SOD进行测定。结果表明:敖汉苜蓿,农宝,阿儿冈金(白),佛纳尔的POD活性较高,而阿儿冈金(白)的POD活性是最高的;8920MF的POD活性最低不同紫花苜蓿品种的POD活性对高温胁迫的敏感性不同。在高温条件下,敖汉苜蓿、亮苜400、皇后、牧歌401的POD含量较高,其中POD含量最高的敖汉苜蓿与乐歌、THG-1、WL-525HQ、8920MF、赛特、盛世、丰宝7个苜蓿品种的POD含量存在显着性差异(P<0.05);亮苜400、皇后、牧歌401与赛特、盛世、丰宝3个苜蓿品种的POD含量存在显着性差异(P<0.05),其余品种间POD含量差异不显着(P>0.05)。丰宝的POD含量最低,与敖汉苜蓿、亮苜400、皇后、牧歌401、胖多的POD含量存在极显着差异(P<0.01)。航海2号,阿儿冈金(白),阿儿冈金蓝牌的SOD活性均较高,其中航海2号的SOD活性活性最高,阿儿冈金(白)其次;在所有品种中,巨人201的SOD活性是最低的。总之,不同品种紫花苜蓿POD,SOD活性在高温胁迫后均表现出较大差异,POD活性与SOD活性大小之间没有必然联系。阿儿冈金(白)表现最好,综合评价最高,可在温度较高的热带,亚热带种植推广。苜蓿王,金皇后,四季旺叁个品种,只要合理应用可在温带广泛应用,奔马的脯氨酸含量最高极显着高于WL-525HQ、亮苜400(P<0.01),且显着高于乐歌、维多利亚、大富豪(P<0.05);航海4号、赛特、航海2号、丰宝、驯鹿、盛世、8925MF、德宝、WL-324、胖多的脯氨酸含量显着高于大富豪、WL-525HQ、亮苜400 (P<0.05),其中航海4号、赛特、航海2号、丰宝、驯鹿、盛世、8925MF、德宝、极显着高于亮苜400(P<0.01);其余品种之间差异不显着且含量中等。(2)通过应用相应的分光光度法测量出各品种的有机渗透调节物质——脯氨酸和膜脂过氧化作用产物——丙二醛的含量,并对相应数据进行统计分析。结果:在高温胁迫下,40个苜蓿品种的SOD活性各不相同,差异较大。其中维多利亚的SOD活性最高,极显着高于兼用苜蓿、赛特、THG-1、敖汉苜蓿、金皇后、8920MF、皇后、四季旺、盛世、WL-324、皇后2000、8925MF、飞马、驯鹿、射手2号、皇冠、丰宝、WL-323ML、顶点、大富豪、亮苜400、WL-525HQ、奔马、航海4号、航海2号、WL-323、农宝、猎人河等28个苜蓿品种(P<0.01),且显着高于德宝、胖多、WL-323HQ(P<0.05),丙二醛含量最高的WL323与丙二醛含量后26位的苜蓿王,赛特,WL323HL,普通苜蓿,顶点,猎人河,WL-414,WL-323HQ,WL324,射手2号,WL2323HQ,驯鹿,8925MF,兼用苜蓿,THG-1,丰宝,乐歌,8920MF,维多利亚,农宝,牧歌401,奔马,皇后,亮苜400,航海4号,爱菲尼特有显着性差异(P<0.05)。丙二醛含量第二的飞马与从普通苜蓿开始的后23个品种的苜蓿有显着性差异(P<0.05)。丙二醛含量3、4位的德宝与金皇后2000之间的差异不显着,它们与从乐歌开始的后10个品种的苜蓿差异显着。从编号为5的金皇后到编号为31的乐歌之间的27个品种没有显着的差异。苜蓿王在高温胁迫后脯氨酸含量最高,相应的抗性表现最强,而农宝的丙二醛含量最低,膜脂过氧化作用最少,抗性表现也较好。综合试验结果表明在夏季高温环境条件下,苜蓿王及WL-232HQ的综合抗性最好、夏季耐高温能力最强,更适宜在南方及夏季高温地区栽种,并可用于提高耐高温能力的育种研究.
李静[8]2012年在《玉米ABP9基因转化紫花苜蓿及其抗旱性分析》文中指出紫花苜蓿(Medicago sativa L.)蛋白质含量高,具有较高的饲用价值,被誉为“牧草之王”。多年来国内外一直致力于通过组织培养及遗传转化技术对苜蓿进行改良,培育品质优良、抗逆、抗除草剂、抗病虫害的新品种。随着分子生物学和植物遗传转化技术的日渐成熟,对苜蓿的抗旱性研究已经从抗旱性的鉴定方面转移到苜蓿的转基因抗旱性育种方面。ABP9编码一个bZIP家族的转录因子,在酵母细胞中,通过特异性的与ABRE2结合来转录激活下游报告基因的表达。已有报道证实过量表达ABP9的拟南芥转基因植株表现出更强的抗非生物胁迫能力,包括干旱、高盐、低温各个方面。这些报道证实转录因子ABP9在调控ABA响应和调节细胞内ROS水平等方面发挥重要作用。本文通过农杆菌介导法将玉米ABP9基因转入紫花苜蓿品种保定苜蓿基因组中,然后对转化植株TO代进行抗旱性鉴定,得到主要结果：1.玉米ABP9基因转化紫花苜蓿以紫花苜蓿品种保定苜蓿的子叶和下胚轴作为受体,采用农杆菌介导法进行转化,诱导抗性愈伤组织。所用的农杆菌菌株为EHA105,其表达载体为pCRI20-35S-ABP9,壮观霉素(spec)用于菌株筛选,Bar基因用于植株筛选,组织培养过程中抗性愈伤的筛选采用Bialaphos。得到120株组培苗,共18个独立的转基因苜蓿TO代株系2. ABP9转基因植株T0代的分子鉴定由于载体中以Bar基因作为选择标记,本试验采用喷施0.5%的Basta溶液进行初步筛选,共16个株系具有除草剂抗性,对这16个株系进行DNA水平和RNA水平的鉴定,结果表明ABP9基因已经整合到保定苜蓿基因组中,并正常表达。3.ABP9转基因植株T0代的耐旱性分析对转基因苜蓿T0代植株进行扦插扩繁,进行耐旱性鉴定试验,干旱20天时,植株表型明显,野生型植株叶片枯黄,ABP9转基因苜蓿植株TO代仍正常生长,只有少量叶片变黄,表明ABP9基因的导入增强了保定苜蓿的耐旱能力。4.测定耐旱生理生化指标对干旱处理20天的植株,进一步测量与耐旱相关的生理生化指标,在干旱胁迫时,ABP9转基因苜蓿TO代植株的叶片相对含水量、叶绿素含量和脯氨酸含量都明显高于野生型植株,丙二醛含量和过氧化氢含量均比野生型植株低。综上所述,转ABP9基因保定苜蓿植株的耐旱能力明显增强,可以作为苜蓿抗逆育种的一个方向。
王文斌[9]2009年在《紫花苜蓿耐逆性及AtNDPK2、codA基因的遗传转化研究》文中指出紫花苜蓿(Medicago sativa L)是世界范围内种植面积最广、经济效益最高的豆科牧草之一。盐渍、干旱、低温等多种逆境严重限制了苜蓿的生长和产量,导致植被、生态系统的进一步退化。因此,阐明苜蓿对逆境的适应机制及通过基因工程手段对苜蓿的耐逆性进行遗传改良具有重要的理论和实践意义。鉴于此,本研究以6种在西北地区种植的紫花苜蓿为材料,通过盐渍、干旱、低温及甲基紫精(MV)介导的氧化胁迫处理,综合比较了萌发期及苗期苜蓿对各种逆境的忍耐性。以筛选出的忍耐及敏感品种为材料,分析了各种逆境条件下,苜蓿幼苗芽、根器官生长、活性氧伤害及抗氧化酶系统协同响应的生理机制。为了培育耐逆性更强的苜蓿新品种,以新疆大叶、新牧一号两种忍耐品种为材料,对影响下胚轴和子叶离体再生及根癌农杆菌遗传转化的若干因素进行了研究,并进行了抗逆相关的核苷二磷酸激酶基因AtNDPK2和胆碱氧化酶基因codA对两种苜蓿的基因转化及耐逆性分析。主要的研究结果如下:1.盐渍、干旱及低温均导致苜蓿最大日萌发率推迟1~3 d,最终发芽率分别下降3.06~43.01 %、1.75~24.21 %和0~14.73 %。萌发期3种类型逆境条件下,新牧一号和新疆大叶均表现较强的忍耐性,而北极星最弱。苗期盐渍、干旱胁迫导致叶绿素含量降低,光合能力分别减弱3.07~8.93 %和8.41~22.07 %;10μmol·L~(-1) MV介导的氧化胁迫条件下,细胞质膜的完整性遭到破坏。新牧一号和新疆大叶对苗期各种逆境的忍耐性较强,而北极星最弱。综合比较,6种紫花苜蓿对多种逆境的忍耐性由强到弱的顺序为:新牧一号、新疆大叶>阿尔冈金、成功者、金皇后>北极星。2.盐渍、干旱及低温胁迫均抑制了新牧一号(忍耐品种)和北极星(敏感品种)幼苗鲜重的积累;干旱刺激了根的伸长,而盐渍及低温显着抑制了芽、根伸长;各种胁迫均导致H_2O_2、MDA含量及相对质膜透性增大,且新牧一号的各指标值均小于北极星,表明幼苗受到明显的氧化胁迫及膜伤害,忍耐品种受伤害程度低于敏感品种。各种逆境条件中抗氧化酶系统表现出相似的协同响应机制,其中,SOD活性升高,加强了对O_2~- .的清除能力;芽中APX活性增强,根中APX变化模式不同,但无论芽还是根中,新牧一号的APX活性均高于北极星;CAT和POD活性具有明显的器官差异性,芽中CAT活性远高于根,POD则相反,而且新牧一号芽中CAT活性及根中POD活性也明显高于北极星(低温除外)。此外,芽、根中各类抗氧化酶对活性氧清除的相互协调模式不同,芽中主要表现为SOD、APX、CAT之间的协调作用,而根中SOD、APX、POD的协调相对更为重要。表明,在盐渍、干旱及低温条件下,抗氧化酶系统在苜蓿成苗过程中起着重要的保护作用。3.对SOD、APX、POD等抗氧化酶同功酶的研究表明,3种胁迫条件下,SOD-2(Rf=0.48)同功酶的活性最强,可能在SOD的催化过程中起有更为重要的作用;APX同功酶中,APX-1(Rf=0.64)活性最强,而且胁迫前后的变化基本与APX总活性一致,表明APX-1不仅对APX总活性的贡献最大,而且还与盐渍、干旱及低温等逆境密切相关;根中POD同功酶中,POD-1、POD-3、POD-4(Rf分别为0.07、0.13、0.26)的活性较强,其活性变化与POD的总活性变化也基本一致,表明3种同功酶对POD总活性的贡献最大,对各种胁迫的响应也相对较为敏感。4.对苜蓿遗传转化受体系统中基因型、外植体、培养基及激素配比等影响因素的综合研究表明,同种培养条件下,基因型对苜蓿愈伤组织诱导的影响差异不显着。下胚轴是一种较好的外植体材料,其愈伤启动时间短,再生能力也高于子叶,最高再生率为54.96 %。0.2 mg·L~(-1) KT能辅助2,4-D对愈伤组织的诱导发挥更好的作用。SH培养基相对于MS培养基对愈伤组织的诱导更有效,而MS培养基则有利于愈伤组织的分化。适用于新疆大叶和新牧一号愈伤组织诱导、分化及生根培养的培养基分别为SH(附加2 mg·L~(-1) 2,4-D和0.2 mg·L~(-1) KT)、MS(附加1.0 mg·L~(-1) BAP和0.3 mg·L~(-1) NAA)、不含激素的1/2 MS(扩繁时附加1 mg·L~(-1) IBA)。5.对遗传转化体系中卡那霉素(Kan)筛选压力、头孢霉素(Cef)的使用浓度、农杆菌侵染方式及共培养时间等影响因素的研究表明,苜蓿下胚轴对Kan较为敏感,50 mg·L~(-1) Kan为下胚轴选择培养的适宜浓度。250 mg·L~(-1) Cef能够有效抑制农杆菌EHA105的生长,而对苜蓿愈伤组织诱导和分化的影响不显着。适宜于新疆大叶和新牧一号的转化体系为:农杆菌培养至菌液浓度A600=0.6~0.8,用4倍体积的SHO液体培养基悬浮,在悬浮液中直接切除5 d苗龄的苜蓿幼苗下胚轴并摇动侵染20 min,然后转移至B5h固体培养基上暗培养3 d,经过250 mg·L~(-1) Cef的液体脱菌后,再转至附加50 mg·L~(-1) Kan和250 mg·L~(-1) Cef的愈伤诱导、分化及生根培养基上进行选择培养。6.进行了AtNDPK2、codA基因分别对新疆大叶和新牧一号的遗传转化及氧化胁迫耐性分析。12个AtNDPK2转基因株系和10个codA转基因株系被成功再生。PCR及RT-PCR初步证实,所有再生株系中,目的基因不仅整合进苜蓿基因组,而且受氧化胁迫的诱导,能够在SWPA2启动子驱动下发生转录。在MV介导的氧化胁迫条件下,AtNDPK2和codA转基因株系的相对质膜透性与目的基因的转录水平密切相关,筛选的转基因株系相对质膜透性显着低于未转基因植株。表明,AtNDPK2和codA基因的遗传转化加强了苜蓿对氧化胁迫的忍耐性。
赵洪芝[10]2012年在《拟南芥植物代谢组学及金银花代谢产物抗炎活性研究》文中进行了进一步梳理植物次级代谢产物是植物所产生的一大类小分子化合物，与生物体的生命现象密切相关。由于植物体的复杂性，植物中的次级代谢产物及其活性还不够清晰明确，需要对植物次级代谢产物进行系统、深入的研究。植物代谢组学是以植物为研究对象对其提取物进行高通量分析的技术，代谢指纹谱是植物代谢组学中的重要研究内容。本课题运用植物代谢组学策略，运用超高效液相色谱四级杆/飞行时间质谱(UPLC-Q/TOF)建立代谢指纹谱，以此来分析模式植物拟南芥的次级代谢产物，根据精确质量数和二级质谱裂解途径，结合文献报道，对拟南芥中的次级代谢产物进行鉴定，并分别比较了不同部位（莲座叶、茎、花和茎生叶）、不同生长时期（幼苗期、抽苔期、盛花期和长角果成熟期）、盐胁迫条件下与未胁迫的拟南芥代谢指纹谱的差异，并运用主成分分析和最小二乘法判别分析等化学计量学方法分别找出潜在的生物标记物，并利用高效液相叁重四级杆质谱(HPLC-QQQ MS)分别测定了盐处理和未进行盐处理的对照组的植物激素茉莉酸含量。此外，还运用Q/TOF研究了4类植物激素（生长素、细胞分裂素、赤霉素和脱落酸）的质谱裂解途径，通过高分辨率质谱所给出的质荷比，准分子离子和碎片离子均推测出了其元素组成，以总结植物激素的质谱裂解途径信息。建立了一种快速高效的使用UPLC-Q/TOF结合萤光素酶报告基因检测系统筛选抑制核转录因子κB(NF-κB)活性的方法，以筛选植物中具有生物活性的次级代谢产物，并以金银花为例对其所具有抗炎活性的次级代谢产物进行了筛选。研究表明，不同部位代谢指纹谱5种潜在的生物标记物为山柰苷、刺槐苷、山柰酚-3-O-葡萄糖苷-7-O-鼠李糖苷、山柰素鼠李糖苷和叁甲花翠苷等；不同生长发育阶段的代谢谱的潜在的生物标记物为芥子酰基苹果酸、 arabidopside A、 arabidopside E、arabidopside G和arabidopside D；与盐胁迫有关的潜在的生物标记物为亚麻酸、OPDA、脱落酸和arabidopside D等，并发现野生型拟南芥在经过盐处理后茉莉酸含量明显高于其他组，其中亚麻酸和OPDA为十八碳烷酸途径的茉莉酸合成的前体，表明拟南芥的耐盐作用可以影响植物激素茉莉酸合成的十八碳烷酸途径。研究了13种常见植物激素的ESI-Q/TOF MS/MS裂解途径，确定了一类的植物激素为特定子离子或中性丢失特征观察。运用所建立筛选体系筛选出金银花中6个具有NF-κB抑制活性的物质，分别为secoxyloganin、绿原酸、马钱苷酸、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷和aldosecologanin，并通过体外炎症模型实验验证了其抗炎活性，绿原酸和獐牙菜苦苷为金银花中主要的抗炎物质。本课题研究了植物次级代谢产物在不同部位、不同生长阶段的分布规律，为研究次级代谢产物合成和运输提供信息，探讨植物对盐胁迫的反应机制和耐盐机理，为基因工程方法或其他措施改造植物提高其耐盐能力提供信息，为农作物和中药材提高产量等研究提供信息。对金银花中抗炎活性次级代谢产物进行筛选可有助于了解植物的抗炎机制，明确药物的物质基础和作用靶点，找出新的抗炎活性成分，促进抗炎药物的研发。
参考文献：
[1]. 紫花苜蓿中植物生长抗逆活性成分的研究[D]. 魏国. 沈阳药科大学. 2004
[2]. 苜蓿总黄酮的提取方法、药效以及多种豆科牧草次生代谢产物的研究[D]. 张咏梅. 甘肃农业大学. 2008
[3]. 苜蓿生物活性及影响其黄酮和皂苷成分因素的研究[D]. 高微微. 中国协和医科大学. 2004
[4]. 紫花苜蓿鲜草对母猪生产性能的影响及其机理研究[D]. 彭宝安. 河南农业大学. 2010
[5]. 蚓激酶转基因苜蓿（Medicago sativa）及丹参（Salvia miltiorrhizae）的构建及检测[D]. 田鹏. 中国农业科学院. 2009
[6]. 骆驼刺（Alhagi pseudalhagi Desv）拮抗内生菌活性单体分析及其相关基因初步研究[D]. 阿布都卡地尔·阿布力孜. 新疆大学. 2012
[7]. 紫花苜蓿夏季抗热性研究[D]. 刘俊艳. 河南农业大学. 2010
[8]. 玉米ABP9基因转化紫花苜蓿及其抗旱性分析[D]. 李静. 兰州大学. 2012
[9]. 紫花苜蓿耐逆性及AtNDPK2、codA基因的遗传转化研究[D]. 王文斌. 西北农林科技大学. 2009
[10]. 拟南芥植物代谢组学及金银花代谢产物抗炎活性研究[D]. 赵洪芝. 南开大学. 2012