潍坊医学院外科学教研室 山东潍坊 261041
摘要：目的 体外培养脑膜瘤细胞，应用siHuR抑制培养的脑膜瘤细胞HuR基因的表达，研究HuR与脑膜瘤细胞损伤后修复的关系。方法 从手术所取得的脑膜瘤组织中提取细胞并传代，以Lipofectamine? 2000 Reagent作为转染试剂，同时设立Untreated，Control和siHuR组，将siRNA导入培养的脑膜瘤细胞，2d后用Western Blot检验蛋白质的表达，然后分别用紫外线处理细胞，6d后计算存活率。结果 经Western Blot检测，相比起Untreated组和Control组，siHuR组中HuR明显减少。在紫外线处理后，siHuR组细胞的存活率明显低于Untreated组合Control组。结论 siHuR可以在脑膜瘤细胞中有效抑制HuR，在脑膜瘤细胞受到损伤后的存活率明显下降，证实HuR对脑膜瘤细胞损伤后修复起重要作用，提示通过RNAi技术有望成为脑膜瘤基因治疗的新思路。
关键词：脑膜瘤；细胞培养；HuR蛋白；siRNA
脑膜瘤是神经外科医师在临床中最常见的肿瘤之一，在颅内肿瘤中的发病率次于胶质瘤位居第二，大约占13%-26%[1]。绝大多数病例的脑膜瘤呈良性生长，发病率女性高于男性，在男性颅内肿瘤病例中约占20%，在女性颅内肿瘤中约占38%[2-3]，但男性往往恶性程度更高[4]。脑膜瘤的发病原因目前尚不完全清楚，随着年龄的增加，发病率也随之增加[5-6]。近年来国内外学者通过一系列研究表明，遗传因素可能是形成脑膜瘤的重要因素之一。世界卫生组织于2007年按照病理学分类法将脑膜瘤分为3级，脑膜瘤Ⅰ级，Ⅱ级，Ⅲ级的五年术后对应的复发率分别为5%，40%，80%[7-8]。其中Ⅰ级常被认为是良性，Ⅱ级，Ⅲ级常被认为是恶性。绝大多数良性肿瘤通过合适的外科手术方法和放射治疗可以痊愈，但恶性肿瘤容易发生转移，容易术后复发。由于分子生物学尚不具备确切判断脑膜瘤侵袭性强弱的能力，目前很难评估脑膜瘤的侵袭性[9]。RNA干扰技术是近年来常用的一项分子生物学技术，通过Dicer核酸酶降解外源性双链RNA成小干扰RNA片段，即siRNA。siRNA能够特异性裂解序列同源互补的mRNA，从而相应基因的蛋白质或多肽抑制，进而引起基因沉默。RNAi技术具有具有普遍性[10，11]、高效性和特异性[12]，因此此项技术广泛应用在恶性肿瘤等疾病的基因治疗领域。HuR基因，又被称为ELAVL1基因，最初是在果蝇的体内发现其同源基因，并于1996年首次被克隆[13]。该基因在神经发育和细胞分化中，都有重要作用。HuR蛋白，是一种mRNA结合蛋白，能够连接多种调控因子，如COX-2，VHL，IGF1R，TNF，VEGF和p53等，在转录后具有调控作用。其可以参与各种细胞应答及炎症肿瘤形成，现已经证实在前列腺癌，胃癌，乳腺癌等发生，转移等各方面，都有HuR的参与。但目前国内外相关HuR蛋白在脑膜瘤方面的研究极少，因此我们通过本实验观察HuR蛋白对脑膜瘤细胞生长的影响，研究HuR蛋白对脑膜瘤细胞受损后修复的关系。
1 材料与方法
1.1 收集材料 收集潍坊医学院附属医院神经外一科2013年1月-2015年2月依据MRI诊断为脑膜瘤手术切除标本，且术后经病理检验证实，期间未采用放射治疗的病例，应用胰酶消化法提取出脑膜瘤细胞进行原代培养和传代。
1.2 实验试剂 DMEM培养基购自美国Hyclone公司，FBS购自美国Hyclone公司，0.25%胰蛋白酶-EDTA购自美国Simga公司，Lipofectamine? 2000 Reagent购自美国 Invitrogen公司。PBS，PBST，Lysis Buffer，Lower Buffer，Upper Buffer，Running Buffer，Transfer Buffer等其他试剂均为自行配置。
1.3 实验方法 取由手术中所得样本，采用胰酶消化法，得到脑膜瘤细胞，并进行原代及传代培养。培养基使用DMEM+10%FBS。每24h用显微镜观察培养的脑膜瘤细胞。需要对脑膜瘤细胞进行鉴定，首先进行细胞爬片，然后进行免疫组化鉴定。实验选用恶性程度相对较高的WHOⅢ级的脑膜瘤细胞，因其容易生长。选对数生长期的脑膜瘤细胞，将其分为三组，第一组为Untreated组，第二组为Control组，第三组为siHuR组。Utreated组不进行处理，Control组用Control siRNA，siHuR组用HuR siRNA，通过使用Lipofectamine? 2000 Reagent，分别进行转染处理，整个过程不加入抗生素，6h后更换培养基。24h后用胰酶消化细胞并进行细胞计数。加入培养基稀释细胞后，以300细胞/孔的浓度分别放入6个6孔板中进行细胞培养，6孔板每孔分别编号。6个6孔板，分别命名为Untreated 0组，Untreated 6组，Control 0组，Control 6组，siHuR 0组，siHuR 6组。其余细胞用枪移入10cm培养皿中继续培养。48h后，进行Western Blot，证实siHuR组HuR含量已明显低于其余两组。转染48h后取Untreated 6组，吸掉培养基，用PBS清洗2次，弃掉PBS，将其放在紫外线灯下，揭开盖子，使细胞暴露在紫外线下6s，迅速取出合上盖子。立即加入培养基继续培养。Control 6组及siHuR 6组处理同上。关闭紫外线灯，将Untreated 0组，Control 0组和siHuR 0组用同样的步骤处理。继续培养6d，中间由于细胞较少，不需要换液。6d后，取出6孔板，弃掉培养基，用PBS清洗，进行细胞染色1h。染色后用水和70%酒精清洗，计数每孔细胞群个数，再进一步计算死亡率。
1.4 统计学分析 统计软件使用SPSS13.0，多组数据均数比较实用方差分析，组间比较用LSD法，P＜0.05认为差异具有统计学意义。
2 结果
三组细胞相比较，通过Western Blot所得的胶片中三组的内参的含量基本相同，Untreated组和Control组的HuR蛋白基本相同，但siHuR组的HuR比Untreated组和Control组的HuR含量明显降低（图1）。Untreated细胞存活率用每孔Untreated 6组细胞数与Untreated 0组细胞数计算存活率，分别为55.45%，53.30%，53.19%，53.97%，52.91%，57.21%。Control组细胞存活率用每孔Control 6组细胞数与Control 0组细胞数计算存活率，分别为存活率分别为53.40%，53.48%，57.65%，52.72%，54.08%，55.56%。siHuR组细胞存活率用每孔siHuR 6组细胞数与siHuR 0组细胞数计算存活率，分别为存活率分别为32.28%，33.13%，38.62%，40.60%，24.22%，33.81%。详细情况见表1。脑膜瘤细胞在受到紫外线照射损伤后，Untreated组与Control组相比，存活率无明显下降，无统计学意义（P>0.05）；siHuR组的相比Control组相比，其存活率明显下降，具有统计学意义（P<0.05）。
3 讨论
脑膜瘤是神经外科医师在临床中常见的一种中枢神经系统肿瘤，大多数为良性，这些病例通过外科手术和适当的放射疗法可以得到治愈。脑膜瘤男女患者的比例大约为1：2，提示脑膜瘤的发生可能与激素存在关系，但高级别脑膜瘤往往常见于男性患者中。虽然绝大多数脑膜瘤可以通过外科手术治愈，但仍有部分脑膜瘤呈侵袭性生长，拥有侵犯临近的颅骨和脑组织的能力，这种脑膜瘤易发生颅外转移，即使通过手术治疗，术后仍然容易复发；另有部分脑膜瘤位于颅底，在其周围有敏感的神经中枢或重要的血管，全部切除基本难以完成。通过原代培养和纯化脑膜瘤细胞，可以为脑膜瘤治疗提供实验基础。原代培养的细胞同体内肿瘤细胞在形态和生物学功能等方面接近，但也存在培养的细胞由于在体外培养，因此抗损伤能力较弱。脑膜瘤是神经外科常见的肿瘤之一，因此目前急需对脑膜瘤的分子生物学特性和治疗进一步深入研究。
HuR有同原癌基因相类似的功能，对肿瘤相关的RNA的稳定性起到重要的作用，并能够抑制RNA的降解，影响肿瘤的形成、发展、转移和血管生成等各个方面，与肿瘤生物学行为有密切关系。近年来国内外科研工作者发现HuR蛋白作为唯一可以增加RNA稳定性的ELAV家族蛋白，能够在转录后水平调控真核细胞的基因表达。
本实验通过研究发现，脑膜瘤细胞可以通过体外培养，从而得到实验所用的细胞，这种细胞更加贴近临床，且价格具有优势。体外培养的脑膜瘤细胞，细胞的活性好，纯度高，但是可以观察到细胞的老化现象，因此应当注意试验时间的选择，如果错过实验时间将会影响实验的进行。对脑膜瘤细胞进行试验，在使用前应正确设计对应的siRNA以确保实验成功。相比基因敲除和转基因等需求技术高、周期长、步骤繁琐、费用高昂等缺点，RNA干扰技术的应用更加广泛，使用RNAi可以使用相同来源的细胞，而且更加方便迅速地沉默HuR基因，针对性更强。siRNA使用简单，但是应注意节约使用以节省经济开支。在体外培养的脑膜瘤细胞中，用siHuR处理的细胞，相比起未处理的细胞和用Control siRNA处理的细胞，在紫外线照射后的存活率明显降低，这同之前国内外学者对HuR进行研究所得的结果相符，HuR蛋白在脑膜瘤细胞同样具有保护作用，在脑膜瘤细胞损伤修复中起到重要角色。目前国内外尚未对HuR与脑膜瘤之间的关系进行大量研究，此方法对脑膜瘤的探索提供了新的思路。现在已经证实，HuR可以通过泛素化，改变部分功能，下一步将进一步验证HuR的泛素化对脑膜瘤细胞的影响。
表1 三组细胞的存活率
参考文献：
[1]Hart AJ，Allibone J，Casey AT，et al.Maligant meningioma of theocular nerve withoutdural attachment.Case report and review of the literature.J Neurosurg，1998，88（6）：1104-1106.
[2]Claus EB，Bondy ML，Schildkraut JM，Wiemels JL，et al.Epidemiology of intracranial meningioma.Neurosurgery.2005 Dec；57（6）：1088-95；discussion 1088-95.
[3]Longstreth WT Jr，Dennis LK，McGuire VM，Drangsholt MT，Koepsell TD.Epidemiology of intracranial meningioma.Cancer.1993 Aug 1；72（3）：639-48.
[4]Louis DN，Ohgaki H，Wiestler OD，et al.The 2007 WHO classification of tumours of the central nervous system[J].Acta Neuropathol，2007，114（2）：97-109．
[5]Wiemels J，Wrensch M，Claus EB.Epidemiology and etiology of meningioma[J].J Neurooncol，2010，99（3）：307-314.
[6]Campbell BA，Jhamb A，Maguire JA，et al.Meningiomas in 2009：controversies and future challeges[J].Am J Clin Oncol，2009，32（1）：73-85.
[7]McCarthy BJ，Davis FG，Freels S，et al.Factors associated with survival in patients with meningioma.[J]Neurosurg，1998；88：831–839.
[8]杨学军.解读《世界卫生组织中枢神经系统肿瘤分类（2007 年）》[J].中国神经精神疾病杂志，2007，33（9）：513-517.
[9]Monleón D，Morales JM，Gonzalez-Segura A，Gonzalez-Darder JM，et al.Metabolic aggressiveness in benign meningiomas with chromosomal instabilities[J].Cancer Res.2010；70（21）：8426-8434.
[10]Meister G，Tuschl T.Mechanisms of gene silencing by double-stranded RNA[J].Nature，2004；431（7006）：343–349.
[11]Hammond SM，Bernstein E，Beach D，Hannon GJ.An RNA-directed nuclease mediates post-transcriptional gene silencing in Drosophila cells.Nature.2000；404（6775）：293–296.
[12]Hamilton AJ，Baulcombe DC.A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants[J].Science.1999；286（5441）：950-2.
[13]Ma WJ，Cheng S，Wright A，et al.Cloning and characterization of HuR，a ubiquitously expressed Elav - Like protein[J].Biol Chem，1996，271（14）：8144 - 8151.
作者简介：刘辰（1988-），男（汉族），山东省潍坊市人，在读硕士研究生。主要研究方向：神经外科。
论文作者:刘辰
论文发表刊物:《健康世界》2015年10期供稿
论文发表时间:2016/1/19
标签：细胞论文; 脑膜瘤论文; 存活率论文; 肿瘤论文; 培养基论文; 基因论文; 蛋白论文; 《健康世界》2015年10期供稿论文;