常平安[1]2001年在《野桑蚕、蓖麻蚕的细胞遗传学分析及蚕的染色体FISH研究》文中研究说明染色体是遗传物质的载体，染色体的结构和功能研究是细胞遗传学中最重要的内 容。随着分子生物学技术的发展和完善，分子生物学技术日益渗透到染色体的研究中， 尤其是FISH技术成为了联系细胞遗传学与分子遗传学的桥梁，越来越多的研究从分子 水平上阐明染色体结构和功能。绢丝昆虫的染色体研究由于其自身的特殊性，如染色体 之间的形态差异不明显、中期呈短杆状乃至颗粒状、又无固定着丝粒、无臂比等参数可 依、分带不易等，严重地阻碍着其细胞遗传学的发展。因此，迫切需要借鉴新兴的分子 细胞遗传学技术，加快绢丝昆虫的细胞遗传学发展。 本研究在前人研究的基础上，一方面通过野桑蚕和蓖麻蚕的染色体研究，丰富完善 绢丝昆虫的细胞遗传学；另一方面，结合分子细胞遗传学的研究方法，积极探索新方法 在绢丝昆虫中的应用，以期能取得新的进展。现将研究结果总结如下： （1）野桑蚕的染色体研究 详细观察了中国野桑蚕卵母细胞的减数分裂过程，比较了中国野桑蚕卵母细胞和精 母细胞减数分裂前期Ⅰ染色体的形态行为，初步从细胞学角度认为野桑蚕雌染色体完全 连锁，而雄蚕染色体发生重组互换；在中国野桑蚕与日本野桑蚕卵母细胞粗线期均观察 到了“ Y”状二价体，推测野桑蚕染色体性型为：ZZ－ZW并预测 Z、W染色体在联会配 对时可能经历了某种等长化的形式；调查了重庆、陕西、湖北叁个地域的野桑蚕染色体 数目都为2n=56，且均发现了与家蚕相似的Giemsa淡染性染色体，并对其进行了染色 体组型排列，进一步支持了中国野桑蚕和家蚕染色体之间存在着高度的同源性的观点。 （2）蓖麻蚕的细胞遗传学研究 比较详细地观察并描述了蓖麻蚕有丝分裂各个时期的染色体形态特征；全面比较了 雌雄蓖麻蚕减数分裂前期Ⅰ染色体的差异，从染色体角度证实了雌蓖麻蚕染色体是完全 连锁的，雄蚕染色体却是连锁交换的；并对雌蚕性染色体在减数分裂前期Ⅰ的动态变化 进行了详尽的描述；将不同时期的染色体组型进行比较，提出在进行绢丝昆虫核型分析 时，有必要将不同时期的组型相互参照。 （3）野桑蚕和蓖麻蚕基因组的RFLP分析 通过Southern杂交，在野桑蚕和蓖麻蚕基因组中都检测到了家蚕丝素重链基因 （Fib－H）、丝胶基因1（Ser1）及胰凝乳蛋白酶抑制剂13基因（CI-13）的同源序列， 并比较了中国野桑蚕和日本野桑蚕之间、蓖麻蚕品种间以及家蚕、野桑蚕、蓖麻蚕叁者 间的酶切位点差异，从分子水平上说明了家蚕和中国野桑蚕基因组的同源性，并推测家 蚕在驯养过程中获得的丝蛋白生物合成效率的提高并不是丝蛋白自身基因结构的改变 1所致，而。工能是通过丝腺细胞核数目成倍的上升，或者是由于与转录或转录后机制相关基因的突变所致。 G）寡蚕和中因回柔蚕染色体的F’ISH研究 通过家蚕的染色体 FISH研究，并结合实验遗传学的研究结论，对丝胶基因 1（Serf）及胰凝乳蛋白酶抑制剂门基因（CIj刀进行了染色体定位，发现 Serf位于第 11连锁群染色体的近端部位冒，在粗线期染色体上的相对位胃为8．Ztl．2；Cll3位于第2江锁群染色体的近端部，在粗线期染色体上的相对位置为！2．stl．4，并比较了两个基冈介染色体上位置与实验近传图谱上的差异。另外，进一步光善了绢丝昆虫染色体FISHx术，并将其应用于中国野桑蚕基因的染色体定位，初步确认丝素重链基因（Fib－H）八染色体的木端，Serf位胃在染色体上的近端部位置，其结果与家蚕染色体FISH的结火高度 －致．从分f细胞遗传学角度证实了家蚕和中国野桑蚕染色体的高度同源性，；Wt探H了r田H在家蚕和野桑蚕染色体同源性比较的可行性。
付雍[2]2008年在《家蚕微卫星序列（SSR）在染色体上的定位分析》文中研究表明染色体是细胞内的遗传物质基础,是遗传物质的载体。染色体的结构、形态、功能是细胞遗传学中的核心内容。染色体核型分析,是认识生物遗传、变异和进化的重要方法,已成为研究生物遗传多态性的重要工具之一。这种方法通过比较细胞染色体的形态参数,如相对长度、着丝粒指数、长短臂之比等将每条染色体按各自的特征区分开,得到一定的染色体组型。家蚕染色体存在一定的特殊性;数目多、中期形态差异甚微、无长短臂之比等可辨特征。早期,家蚕染色体识别和基因定位研究主要利用性腺减数分裂粗线期的染色体、早期胚胎和滞育卵有丝分裂早中期的染色体作为材料,按照相对长度和部分限性易位系统或缺失等来进行核型分析。现代科技的发展与完善,使分子生物学技术已经日益渗透到染色体研究中。荧光原何杂交技术(FISH)已成为连接细胞遗传学与分子遗传学的桥梁,使得我们可以存分子水平更加洋细地研究染色体。本研究在前人的基础上,通过对家蚕染色体核型模式的分析,近而利用FISH技术,对家蚕微卫星序列SSR在家蚕染色体进行了定位。现将研究结果总结如下:1.家蚕染色体的核型模式选取家蚕品种大造卵母细胞粗线期染色体,筛选了10个形态清晰、分散良好、背景干净、染色体数目完整的细胞。用Image J对其绝对长度和相对长度进行了测算。并对最好的一个细胞进行了核型排列。结果表明:不同细胞的染色体总长度差异较大,10个细胞染色体平均总长为311.903μm,最长为388.869μm,最短为267.884μm,两者相差120.985μm;其次,同一细胞内各染色体绝对长度也互不相同,最长染色体的长度与最短染色体的比值最大为3.881,平均为3.007,而且不同细胞相同序号染色体之间的长度差异也很大。如2号染色体最短的为12.924μm,最长的为19.928μm,相差达7.004μm。因此,绝对长度作为家蚕染色体核型分析的依据较小。但10个细胞相同序号染色体的相对长度比较接近,最高标准差为0.889,最低仅为0.095,相对绝对长度而言,差异更小。另外,本文就染色体的绝对长度与相对长度与前人所分析的数据进行了比较,28条染色体中绝对长度平均值相差最大为2.163um,最小为0.957um:而相对长度的差异就更小,最大为0.494%,最小仅有0.003%。并对28条染色体的相对长度的实验数据与前人数据进行了方差分析,结果显示:同一序号染色体测量值没有显着差异,这表明相对长度是一个比较稳定的参数,它代表了某一条染色体在整个染色体群中所占的比例,能相对避免因不同时期染色体收缩程度不同而造成绝对长度的差异。由此说明在材料相同的情况下,减数分裂粗线期染色体长度变化并无明显着异,可以用作核型分析.粗线期染色体的相对长度是一个比较稳定的数据,适合作为建立模式的参数。最后,综合以上的各种参数,建立了一个家蚕减数分裂染色体的核型模式图,初步反映每条染色体各自的特征。用Image J染色体分析软件来测量家蚕粗线期染色体相对长度和绝对长度与传统的细铜丝测量相比,减少了步骤,降低了主观误差,大大提高了准确性和工作效率。2.SSR的FISH研究以DIG标记SSR作为探针,对家蚕不同时期染色体细胞进行原位杂交,染色体用DAPI复染。结果发现:在雄蚕、雌蚕减数分裂间期、粗线期和中期,SSR(2301)和SSR(2310)都发现有杂交信号。但是相对于哺乳动物而言,信号检出率偏低。其中,间期杂交率最高(平均为20.85%和18.84%):粗线期次之,为10.26%和11.36%:中期最低,为5.66%和2.13%。另外将两探针混合后杂交,仅在间期和粗线期发现信号,而且检出率非常低,为5.10%和3.17%。每个探针分别挑选10个信号位置相对一致的染色体群进行核型分析。发现SSR(2301)和SSR(2310)以及混合探针杂交信号均位于染色体核型模式图中的第16号染色体。其中含有SSR(2301)探针信号的染色体相对长度是3.475%,含有SSR(2310)探针信号的染色体相对长度是3.350%,含有两探针混合后的杂交信号的染色体相对长度是3.465%。这一结果与前喵建立的卵母细胞减数分裂粗线期染色体核型模式图的第16号染色体的相对长度比较一致。同时我们还对位于第16号染色体的各探针信号位置利用Image J进行了测算,结果表明:SSR(2301)在该条染色体上的相对位置为17.476±0.872%(信号位点与近端长度/该染色体长度):SSR(2310)在该条染色体上的相对位置为44.911±0.029%。中期上的杂交信号位置很难确定,因为染色体浓缩成颗粒状,差异甚微。
王强[3]2006年在《家蚕染色体的核型模式及Bmrbp1的FISH研究》文中研究指明染色体是生物遗传物质的载体。它的结构、形态、功能是细胞遗传学中的核心内容。染色体核型分析，是认识生物遗传、变异和进化的重要方法。现代科技的发展与完善。使分子生物学技术已经日益渗透到染色体研究中。荧光原位杂交技术(FISH)已成为连接细胞遗传学与分子遗传学的桥梁，使得我们可以在分子水平更加详细地研究染色体。 本研究在前人的基础上，一方面通过建立家蚕染色体核型模式以丰富家蚕细胞遗传学；另一方面利用FISH技术，对果蝇性别决定基因rbp1的同源体Bmrbp1在家蚕染色体进行了定位。现将研究结果总结如下： 1．家蚕染色体的核型模式 调查了家蚕品种大造卵母细胞粗线期染色体，筛选了14个形态清晰、染色体数目完整的细胞。用Lucia染色体分析软件和Image J对其绝对长对和相对长对进行了测算。并用Lucia染色体分析软件软件对最好的一个细胞进行了自动核型排列。结果表明：不同细胞的染色体总长度差异较大，14个细胞染色体平均总长为360.015μm，最长为433.469μm，最短为273.183μm，两者相差160.286μm；其次，同一细胞内各染色体绝对长度也互不相同，最长染色体的长度与最短染色体的比值最大为2.984，平均为2.603。而且不同细胞相同序号染色体之间的长度差异也很大。如8号染色体最短的为11.088μm。最长的为18.345μm，相差达7.257μm。因此，绝对长度作为家蚕染色体核型分析的依据较小。但14个细胞相同序号染色体的相对长度比较接近，最高标准差为0.435，最低仅为0.136，相对绝对长度而言，差异更小。表明粗线期染色体的相对长度是一个比较稳定的数据，更加适合作为建立模式的参数。 另外，本研究还对粗线期染色粒进行了分析。每一条染色体都有其自身的粒数、面积大小、粒色浓淡、排列方式等特征可以互相区分开来。因此染色粒与染色体长度相结合，成为区分染色体的另外一个指标。通过对染色粒含量的计算，我们发现其在整个染色体群的各条染色体含量均较高。除了7条稍低(50％以下)，50％以上的达到21条，占了整个群的75％，其中50-70％之间有13条，并出现有达到80％以上的染色体。证明了家蚕染色线的反复缠绕程度很高。通过对染色粒相对长度的统计，发现染色粒相对长度在1-3％之间的染色体比例最大，共25条。占到89.3％；3％以上的只有3条，仅占10.7％。和染色粒含量相比，其相对长
于子舒[4]2010年在《家蚕染色体双色FISH技术体系的建立》文中研究表明家蚕以其品系广、突变多、繁殖量大等特色渐成为重要的模式生物,对于经典遗传及其他领域的研究具有重要的价值。随着科学技术的发展,尤其是家蚕基因组的成功绘制,使家蚕研究进入基因组及后基因组时代。由于家蚕染色体具有数目多、着丝粒弥散化,相互差异不明显、不易分带、无固定臂比等自身局限性,限制了家蚕染色体的研究,并阻碍了分子生物学与经典遗传学的有机结合。家蚕染色体的相关研究相对集中于染色体形态结构特征的观察、体染色体与性染色的确认等初级水平,而基因定位、分子遗传图谱构建及染色体与基因相互关系等热点研究受到很大的限制,需要一种将分子生物学与经典遗传相连接的技术,在这种情况下FISH技术异军突起。作为能够将DNA分子标记直观定位在染色体上的FISH技术,与传统方法相比具有更简单、更直观、更快速且准确的特点。其在家蚕遗传学、基因组及后基因组学研究中,尤其是物理图谱的研究中起到了重要作用。对家蚕染色体FISH技术及双色FISH技术体系的成功建立,有利于分子生物学研究方法向经典遗传研究领域的渗入,有助于家蚕基因定位、基因与染色体相互作用等前沿、热点问题的研究,使家蚕研究加速进入基因组及后基因组时代,对于家蚕研究具有重要意义。本研究通过双色FISH技术对家蚕泛素蛋白连接酶基因(BGIBMGA013548-TA)及丝氨酸蛋白水解酶基因(BGIBMGA010063-TA)进行定位,得到了以下研究结果。1家蚕双色FISH技术体系的建立通过对家蚕双色FISH条件的优化,构建出适合家蚕染色体的双色FISH技术体系。家蚕4龄2天的生殖腺染色体更适合FISH实验；PCR仪进行探针变性更为有效；蛋白酶K消化的最佳条件为1μg／ml,37℃孵育5～10 min；共变性对染色体形态影响十分重要,80℃下2min为宜；37℃下杂交24h即可满足长度为1000bp的探针的杂交需要；42℃下经50%甲酰胺／2×SSC洗涤3次,每次5min即可有效减少“噪音”造成的影；直接将Anti-Dig fluorescence与Cy-3同时孵育是获高品质双色FISH结果的重要步骤。通过对以上等方面的优化改进,使用探针DIG-3077、Bio-2983进行FISH实验,获得了清晰、明显且可信的双色信号。2对家蚕泛素蛋白连接酶和丝氨酸蛋白水解酶基因的染色体双色FISH定位通过家蚕基因组分析,分别在4号染色体的scaf3077、scaf2847及7号染色体的scaf2983、scaf2912上选择已报道的家蚕泛素蛋白连接酶基因(BGIBMGA013548-TA)、家蚕mRNA剪接因子(BGIBMGA006022-TA)和丝氨酸蛋白水解酶基因(BGIBMGA010063-TA)、家蚕钙神经连接蛋白基因(BGIBMGA008719-TA)进行FISH定位。结果表明：在生殖腺粗线期染色体上各基因都有单一的杂交信号,表明均为单拷贝基因。单色FISH结果表明家蚕泛素蛋白连接酶基因、丝氨酸蛋白水解酶基因分别位于不同染色体的端部与中部；通过双色FISH结合mRNA剪接因子、家蚕钙神经连接蛋白基因的定位结果,证明家蚕泛素蛋白连接酶基因、丝氨酸蛋白水解酶基因分别位于4号染色体及7号染色体。以上其结果与家蚕基因组分析相一致。通过对家蚕泛素蛋白连接酶基因、丝氨酸蛋白水解酶基因的有效定位,证明所构建的家蚕染色体双色FISH技术在实际研究中是可行并可靠的,较单色FISH相比基因定位更高效、更直接。
丁裕斌[5]2005年在《家蚕染色体研究及ISSR序列荧光原位杂交的定位》文中提出染色体的分类、形态曾是细胞遗传学的核心内容。染色体核型分析,即染色体多态性研究,已成为研究生物遗传多态性的重要工具之一,这种方法通过比较细胞染色体的形态参数,如相对长度、着丝粒指数、长短臂之比等将每条染色体按各自的特征区分开,得到一定的染色体组型。家蚕染色体存在一定的特殊性:数目多、中期形态差异甚微、无长短臂之比等可辨特征。早期,家蚕染色体识别和基因定位研究主要利用性腺减数分裂粗线期的染色体、早期胚胎和滞育卵有丝分裂早中期的染色体作为材料,按照相对长度和部分限性易位系统或缺失等来进行核型分析。作为基因定位的基础,以前进行的家蚕染色体核型分析,无论从材料还是从染色体相对长度的测量方法上来说,都有一定的局限性,因此需要更为准确的测定染色体相对长度的方法和发展新的研究材料。目前新开发的测量软件Image J和能够获得大量分裂相的新建细胞系为家蚕研究填补了部分不足。 荧光原位杂交技术依据碱基互补原理,能够准确获得特殊修饰的核苷酸分子探针在染色体或DNA纤维上的位置,这一技术在普通家蚕细胞遗传学基础上,为家蚕在分子水平对染色体结构、染色体识别和基因物理定位等研究开辟了新的途径、提供了快速有效的方法。 本研究在前人的基础上,通过利用5个品种家蚕减数分裂粗线期的染色体建立家蚕模式核型,初步研究了培养细胞有丝分裂染色体特性,丰富了家蚕细胞遗传学,并以此作为基因定位的基础;利用荧光原位杂交技术确定了一微卫星序列在染色体上的位置。研究结果如下: 1)家蚕粗线期染色体模式核型研究 首先在调查的5个品种的家蚕卵母细胞中,各筛选了5形态清晰、分散适度、染色体数目完整、位于减数分裂粗线期的细胞,用新开发的软件Image J对其染色体的绝对长度进行了测算,获得这5个品种家蚕的染色体的平均长度,然后用这5个值来建立家蚕的模式核型,结果表明:粗线期染色体同一序号的不同品种之间染色体绝对长度差异大,绝对长度总和相近,同一序号的染色体绝对长度标准差多条染色体超过了1,在每个细胞中,最长染色体是最短的染色体的2.5倍左右。相对长度是染色体绝对长度与染色体总长的比值,用相对长度能够避免因不同时期染色体螺旋化程度不同而造成绝对长度的较大差异。本实验中,同一序号的染色体相对长度相对差异很小,最高标准差为0.144,最小的为0.032,与绝对长度相比,差异更小。而相对长度在同一细胞中的变化与绝对长度的变化基本一致,最长的约为最短的2.5倍。结果表明,对于核型分析和染色体鉴别,各品种家蚕卵母细胞在减数分裂晚粗线期染色体均一性较好,品种间差异不大,用于基因定位具有普遍意义;对于核型分析来说,晚粗线期染色体优于早粗线期;用软件测量的家蚕粗线期染色体绝对长度和相对长度值与传统的细铜丝测量相比,减少了操作步骤,降低了主观误差,提高了工作效率。 2)培养细胞的有丝分裂染色体研究
参考文献：
[1]. 野桑蚕、蓖麻蚕的细胞遗传学分析及蚕的染色体FISH研究[D]. 常平安. 西南农业大学. 2001
[2]. 家蚕微卫星序列（SSR）在染色体上的定位分析[D]. 付雍. 西南大学. 2008
[3]. 家蚕染色体的核型模式及Bmrbp1的FISH研究[D]. 王强. 西南大学. 2006
[4]. 家蚕染色体双色FISH技术体系的建立[D]. 于子舒. 西南大学. 2010
[5]. 家蚕染色体研究及ISSR序列荧光原位杂交的定位[D]. 丁裕斌. 西南农业大学. 2005
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