（1.泸州市公安局刑事科学技术研究所 四川泸州 646000；2.西南医科大学附属中医院 四川泸州 646000）
摘要：目的 建立生物检材中戊丙酸类药物的气相色谱-质谱（GC/MS）检验方法。方法 戊丙酸钠、戊丙酸镁在酸性条件下形成戊丙酸，利用戊丙酸易溶于有机溶剂的原理，液液提取然后供气质联用仪检验。结果 在生物检材中戊丙酸4ug-500ug/ml范围内与峰面积呈良好线性关系，最低检出限4ug/ml，方法回收率大于70%。结论 经过实验验证该方法真实可靠，且灵敏度高，易于操作，能用于生物检材中戊丙酸类药物的检验。
关键词：戊丙酸 戊丙酸钠 戊丙酸镁 生物检材 气相色谱-质谱法
Determination of valproic acid in biological samples by GC-MS
Caiyugang1 Lijian2
（1.Institute of Criminal Science and Technology Research of LuZhou Municipal Public Security Bureau，LuZhou，646000 China；
2. Traditional Chinese Medicine Hospital Affiliated of Southwest Medical University，luzhou 64600 China）
Abstract：Objective To delelop a GC-MS method for the determination of valproic acid in biological samples . Methods the valproic acid was formed under the acidic condition by sodium valproate and magnesium valproate. The method was used to determine the solubility of valproic acid in organic solvents. Results there was a good linear relationship between the range of 4ug-500ug/ml and peak area in biological samples，and the lowest detection limit was 4ug/ml. Conclusion the method is reliable，sensitive and easy to operate. It can be used for the determination of valproic acid in biological samples
Key words：valproic acid sodium valproate magnesium valproate biological samples GC-MS
戊丙酸类药物包括[5]：戊丙酸钠和戊丙酸镁等，是不含氮的广谱抗癫痫药。对各型癫痫如对各型小发作、肌阵挛性癫痫、局限性发作、大发作和混合型癫痫均有效。口服吸收快而完全，主要分布在细胞外液，在血中大部分与血浆蛋白结合。多用于其它抗癫痫药无效的各型癫痫病人，尤以小发作为最佳。为原发性大发作和失神小发作的首选药。用于抗癫痫外，还可用于治疗热性惊厥、运动障碍、舞蹈症、卟啉症、精神分裂症、带状疱疹引发的疼痛、肾上腺功能紊乱，以及预防酒精戒断综合征。
戊丙酸类药物系镇定类药物，中毒案例在媒体上鲜有报道。该类药物服用过量，表现为恶心、呕吐、腹泻、畏食等消化道症状，继而出现肌无力，四肢震颤，共济失调，嗜睡，意识模糊或昏迷，肝功能异常，血小板减少，胰腺炎。急性中毒者早期多因呼吸中枢麻痹致窒息性死亡，晚期多因呼吸衰竭，脑水肿或合并肺部感染致死。
戊丙酸类药物口服后在肠内转化为丙戊酸[5]，而延迟吸收。体内的蛋白结合率为80%～94%，分布容积0.13～0.22L/kg，血浆半衰期为5～20h。过量时可延长到30h，因蛋白结合部位饱和，可引起较多的循环游离部分。治疗的血清水平是50～100μg/ml。血清中丙戊酸> 500μg/ml在临床上出现嗜睡、反应迟钝；>1000μg/ml出现昏迷和代谢紊乱等急性中毒反应。
目前，国内文献上可查的检验戊丙酸类药物的方法有[5]荧光光度法、化学显色法、电位滴定法、红外吸收法和气相色谱法等。戊丙酸类药物在酸性条件下迅速形成戊丙酸（图1），所以检测检材中的戊丙酸具有可操作性，由于此类药物是不含氮的镇定药物且电负性较低，利用气相色谱-氮磷检测器（GC-NPD）和气相色谱-电子捕获检测器（GC-ECD）灵敏度较低，可能会造成漏检。气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）方法检测具有灵敏度高，检测限低等特点，适用于各种生物检材中戊丙酸的检测。本方法汲取了气相色谱分离效率高，质谱灵敏度高的特点，为戊丙酸类药物中毒案件中戊丙酸检验鉴定提供有效的方法。
图1.戊丙酸结构式
Fig1 valproic acid structure
1仪器与试剂
1.1试剂及标准物质
标准品：戊丙酸，标准品由公安部物证鉴定中心提供。
试剂：乙醇、三氯甲烷、无水硫酸钠、硝酸（以上试剂均为分析纯）。
1.2仪器和设备
安捷伦7890A-5975C气相色谱质谱联用仪（GC/MS）；ThermoTDZ5高速离心机；超声波型号：济南巴克BKA-120B；涡旋振荡仪型号：德国IKA；恒温水浴锅型号：北京永光明医疗仪器有限公司XMTD—4000。
2操作及实验条件[1-4]
2.1操作步骤
2.1.1 溶液配制
2.1.1.1配制浓度均为0.1mg/mL的戊丙酸标准溶液乙醇工作液，低温保存，有效期6个月；
2.1.1.2配制4ug/ml戊丙酸标准乙醇醇溶液做为质控，室温保存，有效期3个月；
2.1.1.3配制4ug/ml、10ug/ml、60ug/ml、100ug/ml、300ug/ml、500ug/ml戊丙酸乙醇标准溶液，作为标准曲线工作液；
2.1.1.4配制1mol/L的硝酸溶液，供检材调PH值使用。
2.1.2检材处理
平行取胃内容两份各2克（2ml），分别加入1mol/L的硝酸溶液适量调PH=4，震荡5分钟，然后加入三氯甲烷5毫升，超声波萃取10 min，涡旋振荡10min，加入无水硫酸钠适量（去乳化），在10000r/min高速离心条件下离心10min，重复提取两次，合并有机相在35℃ 水浴锅上浓缩挥至近干，用100ul乙醇定容，供GC/MS检验。
同时取等量空白相似检材2份，1份添加2ug/ml戊丙酸乙醇标准液对照品作质量控制检材，另一份作空白比对检材，与检材平行操作。
2.2试验条件
色谱柱：HP-5MS石英毛细管柱（30m×0.32mm×0.25um）（弱极性或者极性柱）；柱温：100℃（1min） 30℃/min 280℃（6min）；进样口温度：280℃；接口温度：250℃；载气：高纯氦，流速1 mL/min，分流比10：1
检测器：EI，70eV，传输线温度250℃，离子源温度：230℃，四级杆温度200℃，倍增器电压自动调谐，扫描方式：SCAN（线性测试扫描方式为：SIM）扫描范围40-500amu，扫描起始时间（溶剂延迟）3min
3检验
分别取0.1mg/ml戊丙酸标准、2.1.2的检材提取液、空白添加提取液及空白液供气质联用仪（GC/MS）检验，每次进样1ul，各进2次。
4结果
4.1线性关系考察
精密配制戊丙酸标准储备液浓度分别为：4ug/ml、10ug/ml、60ug/ml、100ug/ml、300ug/ml、500ug/ml，分别进行测定。以峰面积（y）为纵坐标，以浓度（x，ug/ml）为横坐标做线性回归，回归方程为：y=3.578x-3.280；r2=0.99991.结果表明，戊丙酸在浓度4-500ug/ml范围内峰面积与浓度呈线性相关，最低检测浓度为4ug/ml，信噪比为4：1。
4.2回收率和精密度实验
取空白人血2ml，加入一定量的戊丙酸，制备成戊丙酸浓度为300ug/ml和500ug/ml的样品，采用2.1.2方法处理后供气质联用检验，结果两种浓度下戊丙酸的回收率分别为74.38%和76.59%。
4.3结果评价
检材提取液均检出与0.1mg/ml戊丙酸标准液保留时间一致的色谱峰（检材提取液保留时间为3.711min，戊丙酸标准液保留时间为3.731min，图2），且质谱特征离子碎片及相对丰度比与戊丙酸标准液一致（戊丙酸的特征离子：m/z73、m/z41、m/z102图3），空白对照样品无干扰。阳性结果可靠。
5 讨论
5.1色谱柱的选择：戊丙酸结构中含有-COOH是一类极性较大的物质，选用弱极性柱或者中性柱分离比较好。本文考察了DP-1MS、HP-5MS、HP-INNOWAX和XO-17MS四种色谱柱，试验表明HP-5MS和HP-INNOWAX两种柱子峰形较好，无拖尾现象、分离效果较好。
5.2去乳化剂的选择：在生物检材处理中，液液提取的乳化现象比较普遍，特别是血液提取，有效消除乳化现象是提高回收率的一个重要手段。本文选择无水硫酸钠作为去乳剂效果比较好，既能达到去乳化效果又没有引入污染。
6案例应用
2016年11月20日，XX市XX县公安局接群众报案称：一男子在外出务工的路上出现身体不适，在送医院抢救的过程中死亡。经法医解剖和病理结论，该男子系呼吸衰竭死亡，排除机械性窒息和疾病引起窒息死亡。笔者对常规的农药进行筛查均为阴性，对常见镇定剂进行筛查的过程中检出戊丙酸成分。经查，该男子无癫痫史，侦查人员对死者关系人进行调查，最终锁定一个与其有经济纠纷、有癫痫史的嫌疑人，其为了教训死者，在死者吃的饭菜里加了大量戊丙酸钠。笔者在死者胃内容和心血中均检出戊丙酸成分，为案件侦破提供了证据支持。
参考文献：
[1]. GA/T 188-1998《中毒检材中安定、利眠宁的定性及定量分析方法》
[2]. GA/T 189-1998《中毒检材中氯丙嗪、异丙嗪、奋乃静的定性及定量分析方法》
[3]. GA/T 102-1995《中毒检材中巴比妥类药物的定性定量分析方法》
[4].《中国刑事科学技术大全.毒品和毒物检验》，2003年1月第1版
[5].国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版二部附录III。
论文作者:蔡玉刚1,李建2
论文发表刊物:《健康世界》2017年第5期
论文发表时间:2017/5/8
标签：丙酸论文; 色谱论文; 标准论文; 类药物论文; 浓度论文; 方法论文; 癫痫论文; 《健康世界》2017年第5期论文;