新疆医科大学第五附属医院肿瘤中心 新疆乌鲁木齐 830011
【摘 要】目的 探讨MZF-2转录因子与甲基化后的DNA结合基序结合活性。方法 常规培养CNE-2细胞株，提取核蛋白；合成、标记和纯化MZF-2探针，其中一组用M.SssI甲基化酶处理，进行凝胶迁移分析（EMSA）。结果 EMSA图中单独加入甲基化探针组无结合条带，单独加入原样未甲基化探针组有结合条带，同时加入标记和未标记原样未甲基化探针组结合条带强度减弱。结论 甲基化可以抑制MZF-2转录因子与其DNA结合基序的结合活性。
【关键词】MZF-2；甲基化；EMSA
The detection of binding between MZF-2 and its methylated DNA binding motif
Wang Peiliang. Center of Oncology，the Fifth Affiliated Hospital of Xing JiangMedical University，Urumqi 830011，China
Abstract：Objective：To detect the binding between MZF-2 and its methylated DNA binding motif. Metheods：CNE-2 cell lines was cultured conventionally. Nuclear extracts from cells were prepared. The MZF-2 probe was synthysized，Purified，radiolabelled with the γ-32P-labeled oligonucleotide. One of groups was treated by SssI methylase. EMSA was performed. Results：No specific band was observed in group using methylated MZF-2 probe. The specific band was observed using unmethylated MZF-2 probe. In competition experiment，unlabeled oligonucleotide DNA probe interfered with the binding between MZF-2 protein and its DNA binding motif，which make the band weak. Conclusion：Methylation may inhibit the binding between MZF-2 and its binding motif.
Key words：MZF-2；Methylation；EMSA
【中图分类号】Q783.1【文献标识码】A【文章编号】2096-0867（2016）-07-010-02
大量研究显示基因组特定序列的高甲基化与肿瘤形成密切相关，这种高甲基化会使基因表达发生变化，但引起这种变化的具体机制尚不完全清楚。有学者推测DNA甲基化后空间结构发生变化，导致转录因子不能结合，引起一系列后续变化，从而发挥调控作用[1]。本研究采用含MZF-2（myeloid-specific zinc finger protein 2）结合基序的探针和凝胶迁移分析（EMSA）方法，对上述推测予以证实。
1 材料和方法
1.1 试剂
细胞培养板（美国Corning公司），胎牛血清、DMEM/F12干粉培养基（Gibco），SssI甲基化酶试剂盒（New England Biolabs公司），葡聚糖凝胶G-25（美国Pharmacia公司），?-32P ATP（北京福瑞生物工程公司核酸研究室），Poly dI-dC、苯甲基磺酰氟化物、抑酞酶(Aprotinin)、亮肽酶素(Leupeptin)购于美国Sigma公司。
1.2 细胞培养
采用鼻咽低分化鳞癌细胞株CNE-2，常规培养。
1.3 核蛋白提取
胰酶消化细胞，PBS清洗后离心，冰浴后离心，加入配制的裂解缓冲液，吹打后4℃11000×g离心20min，取下层核蛋白，用配制的核蛋白抽提液重悬后20000×g离心5min，取上清即为核抽提物，分装，-70℃保存，避免反复冻融。
1.4 MZF-2探针的合成、标记与纯化
参照文献[2]由上海生工合成探针，探针序列如下：5'-GTTTGCTCATGGTGGGGACCCCTCGCCG-3'，内含MZF-2结合基序。探针分成3份：一份做同位素标记的原样；一份不做同位素标记的原样，用于竞争性探针；一份用M.SssI甲基化酶处理，按NEB公司的M.SssI甲基化酶试剂盒说明书操作，甲基化后的探针也做同位素标记。制备葡聚糖凝胶G-25离心层析柱，加入TE缓冲液封口后垂直放于4℃待用；γ-32P ATP同位素标记；离心层析柱纯化探针，离心后加入TE缓冲液，置于铅罐内-20℃贮存。
1.5 EMSA法检测
制备5%非变性聚丙烯酰胺凝胶，预电泳后检测提取核蛋白中MZF-2转录因子与探针的结合：共3组，分别加入γ-32P ATP标记的原样探针和甲基化探针，另外一组同时加入γ-32P ATP标记和未作标记的MZF-2原样探针，混匀后，于室温中反应20min。电泳后暗室中放射自显影，-70 ℃ 24小时曝光。暗室内洗片，风干。
2 结果
EMSA是一种研究DNA结合蛋白和其相关DNA结合序列相互作用的技术，结合了蛋白质的DNA和未结合蛋白质的DNA电泳速率不同，前者要慢于后者，这样，从电泳结果就可以判断该序列是否和蛋白结合。本实验结果显示，单独加入标记的甲基化探针组无结合条带，单独加入标记的原样探针组有结合条带，同时加入标记和未标记原样探针组结合条带强度减弱。见下图。
1.甲基化探针组；2.原样探针组；3.加入未标记竞争性探针组
3讨论
DNA甲基化是人类基因组常见的基因表达调控方式，在基因启动子区，甲基化多发生于CpG岛。正常生理条件下绝大部分CpG岛处于非甲基化状态，在肿瘤组织中则常处于过甲基化状态。通常来说基因启动子甲基化大多数与基因沉默有关，甲基化程度高，基因表达则降低，反之则基因表达越高。
基因启动子甲基化的作用不仅与甲基化程度有关，还与甲基化发生位点有关，这些发生位点多是转录因子的结合位点。转录因子的结合位点较复杂，在对hTERT基因的研究中，发现其有两个典型的E盒，一个新鉴定的MT盒，还有个数不等的Sp1、c-Myc、AP-2、AP-4、MAZ、c-Ets-2、WT1、MZF-2、p53、Mad1等转录因子结合基序，这提示hTERT的表达由不同的调节因子所调节[3、4、5]。Guilleret等[6]检测到hTERT启动子区-500~+450序列处于高甲基化状态，特别是-500~+1片段，在此区间肿瘤组织和细胞株全部甲基化而正常组织全部没有发生甲基化。这一基因启动子区段含有多个反式作用因子结合域，因此Guilleret等认为hTERT基因启动子区高甲基化引起的基因表达变化与甲基化后DNA和反式作用因子的结合活性发生变化有关。我国学者也有类似推测。已知hTERT基因转录启动子区-634bp至-403bp片段含26个CpG和2个MZF-2锌指基序，仅结合MZF-2一种转录调节因子[1]。MZF-2是一种锌指蛋白，本身具有三维结构，与DNA结合有很强的特异性，因此本研究采用MZF-2转录调节因子，检测其与甲基化后的DNA结合基序结合活性。结果提示MZF-2与甲基化后的DNA结合基序没有结合活性，而与没有甲基化的DNA结合基序则有结合活性，竞争性实验相对地验证了这种结合的特异性。因此本研究结果支持以往的推测：MZF-2转录因子结合基序或其邻近序列发生甲基化后，DNA空间结构发生变化，导致MZF-2转录因子不能与之结合，从而引起基因表达的变化，发挥基因的调控作用。
参考文献：
[1]程永波，房殿春，杨海捷，罗元辉. 胃癌细胞株hTERT基因启动子区甲基化分析. 解放军医学杂志，2008，33（2）：187－189.
[2]Fujimoto K，Kyo S，Takakura M，et al. Identification and characterization of negative regulatory elements of the human telomerase catalytic subunit(hTERT) gene promoter：possible role of MZF-2 in transcriptional repression of hTERT. Nucleic Acids Res，2000，28(13)：2557-2562.
[3]Braunstein I，Cohen-Barak O，Shachaf C，et al. Human telomerase reverse transcriptase promoter regulation in normal and malignant human ovarian epithelial cells. Cancer Res，2001，61：5529–5536.
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[6]Guilleret I，Benhattar J. Unusual distribution of DNA methylation within the hTERT CpG island in tissues and cell lines. Biochem Biophys Res Commun，2004，325：1037–1043.
论文作者:王沛靓
论文发表刊物:《临床医学教育》2016年7月
论文发表时间:2016/10/26
标签：探针论文; 甲基化论文; 转录论文; 因子论文; 基因论文; 标记论文; 子区论文; 《临床医学教育》2016年7月论文;