尹志伟[1]2002年在《野生型P53抑制肺癌细胞生长及其修饰DC诱导特异性抗肿瘤免疫应答的实验研究》文中研究说明P53是一种重要的抑癌基因，其突变、缺失、重排等现象的发生与人体多种肿瘤密切相关。P53基因在DNA的损伤、修复，细胞生长、分化，细胞凋亡等过程中发挥重要作用。目前，关于P53基因在免疫治疗中的作用也越来越受到关注。 目的：本研究筛选P53突变型肺癌细胞系Calu-6，以野生型P53质粒pC53-SN3和空质粒pCMV-neo转染该细胞，观察外源性野生型P53对有P53基因突变的肺癌细胞系的生长抑制作用，研究P53调控细胞生长分化的作用。并以该质粒修饰诱导扩增的DC，激发特异性免疫反应，进行P53应用于免疫治疗的研究。方法：以PCR、免疫组化、SSCP方法筛选P53突变型细胞系，在脂质体介导下以转染野生型P53质粒pC53-SN3，并以空质粒pCMV-neo做对照。用G418筛选稳定表达的细胞克隆，以生长曲线和集落形成实验观察所转染的野生型P53质粒对细胞生长分化的影响。同时由12例肿瘤病人外周富集血中单个核细胞在IL-4、GM-CSF联合培养下诱导DC细胞，在脂质体介导下转染野生型P53质粒pC53-SN3，与未经纯化的T细胞联合培养诱导特异性CTL，并通过LDH释放实验观察其对肺癌细胞系Calu-6的杀伤效率。结果：经筛选发现Calu-6细胞系为P53第六外显子突变株，204处密码由谷氨酸突变为天冬氨酸，经野生型P53质粒pC53-SN3转染后，发现细胞生长明显减慢，而转染空质粒的Calu-6细胞与未转染的细胞生长无差异，同时发现pC53-SN3转染后集落形成抑制率达90.6％。说明野生型P53基因与细胞基因组整合后，补充了P53因突变而丧失的功能，对细胞周期进行负调控，使恶性肿瘤细胞生长受到抑制。进一步研究发现经脂质体介导野生型p53 天津医科大学硕士研究生论文 质粒pC53SN3转染DC后，成熟DC的表面标志CD83、CDla显着升高， 而CD86、CD40、HLA－DR等DC标志与转染前无明显改变。基因修饰后 DC可有效刺激混合淋巴细胞增殖反应，增殖百分数基本在20－30％左右。 质粒转染后DC与未经纯化的T细胞联合培养后作为效应细胞，以Calu－6 作为靶细胞进行杀伤实验，结果表明，当效靶比为10：l，sl，2．5：l 时 PC53－SN3质粒转染 DC诱导特异性杀伤细胞（T－DC巾C53－SN3）与＊＊－2 细胞非特异性杀伤的杀伤率有显着性差异。而pCMV－neo空质粒转染DC诱 导的杀伤细胞（T－DC卞CMV呗eo）的杀伤率与T－IL－2细胞非特异杀伤的 杀伤率无显着性差异。同时由细胞表面标记检测结果亦可见， T－DC个C53－SN3细胞的CDS、CD69、CD45RO／CDS显着升高，而CD3、 CD4、CD25、CD86、HLA－DR、CD16／CD56与T－DC－pCMV－neo十卜则 无显着性差异。结论：研究表明野生型P53基因可对肿瘤细胞细胞周期进 行负调控，抑制细胞生长。野生型P53基因修饰的DC，可有效诱导特异 性CTL，激发特异性兔疫应答，Wt－P53基因作为一种肿瘤免疫治疗措施必 将有广阔的应用前景。
佚名[2]2010年在《肿瘤免疫》文中研究表明免疫系统对肿瘤化疗的系列反应现象刘辉吴晓鑫大连医科大学临床免疫学教研室,大连116044肿瘤的发生发展及其转归与特定的机体免疫状态及免疫应答能力密切相关,而且肿瘤的免疫疗法亦是当前治疗恶性肿瘤最有希望的方法之一。但目前治疗肿瘤化疗方法仍占主要地位,由于各种化疗药物多是细胞毒性物质,因而大多数人推测化疗药物对机体免疫系统一定有不同程度的抑制作用,而对肿瘤患者化疗时机体免疫功能状态的检测并没有系统的实验评估,对化疗病人各阶段的免疫状况亦缺乏较全面的认识。
佚名[3]2004年在《肿瘤生物治疗》文中认为14-3-3σ负性调控Akt及抑制肿瘤生长的作用杨惠玲,李孟鸿中山大学病理生理学教研室,广东,广州,510080 德州大学M.D.Anderson癌症中心目的:14-3-3σ蛋白属14-3-3蛋白家族,主要在上皮细胞表达,虽然已有实验提示14-3-3σ蛋白参与细胞周期、凋亡和成瘤性的调控,是目前已知唯一具有抗癌活性的亚型,但与其相互作用的蛋白质尚未阐明。蛋白激酶B(PKB,又称Akt)属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,它与调控的信号转导通路牵涉到肿瘤的发生、发展、疗效和预后的各个环节,目前研究发现在某些类型癌症中常出现14-3-3σ低表达和或Akt过表达,本
齐桓[4]2007年在《Ad介导G250基因转染DC激活免疫效应细胞治疗肾癌的实验研究》文中进行了进一步梳理据统计2006年美国约40000例肾肿瘤的新发病例被确诊，大约13000例患者(包括成人和儿童)死于肾肿瘤。肾细胞癌是肾肿瘤中最常见的类型，占肾脏恶性肿瘤的90％以上，晚期的转移性肾癌对放疗与化疗均不敏感，一小部分患者对IL-2和IFN-α治疗有效，但药物的毒副作用十分明显。研究表明，肿瘤的发生及发展与患者体内的T淋巴细胞功能缺陷有关，进一步的研究发现，导致此缺陷的原因在于机体对成熟树突状细胞(Dendritic cell，DC)的功能下调。在体外，很多实验证实即使是晚期肿瘤患者外周血分离出的淋巴细胞对多种外界刺激仍然保持着很好的反应能力。因此，通过体外培养DC，诱导特异高效的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，回输免疫患者，有望成为治疗肿瘤的绝佳疗法。而目前最需解决的问题是：如何在已知靶抗原的前提下，获得良好活性、足够数量的特异性CTL?DC是人体内功能最强大的抗原递呈细胞。如能将肿瘤抗原成功加载DC，可诱导抗原特异的CTL。目前，采用粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)和白介素-(Interleukin-4，IL-4)已能成功从外周血单个核细胞培养出DC。但是，如何能够有效地将抗原导入DC?又如何有效利用DC诱导T淋巴细胞产生CTL?研究表明：不同的抗原加载方式，对DC的活化效率不同，产生CTL的活性也不一致。目前抗原加载存在着多种手段，常用的策略有：抗原肽致敏DC及病毒载体携带抗原基因转染DC两种方式。采用肿瘤抗原肽致敏DC虽有抗原比较特异，可多次免疫等优点，但存在的主要问题是：这类抗原肽往往半衰期较短，因此需要多次免疫方可获得良好活性的CTL，而且转导效率低下。病素载体携带抗原肽基因转染DC，可使基因在DC体内稳定表达，从而使DC获得持续而大量的抗原肽刺激，有望解决单纯抗原肽转导存在的问题。目前转染DC常用的病毒载体有：逆转录病毒，腺病毒和慢病毒等。腺病毒载体(Ad)是常用的病毒载体之一。腺病毒载体是5型腺病毒基因重组而成的，由于其E1区的缺失，致使病毒的复制缺陷，不会引起宿主细胞的损伤或病毒扩散。展望与其它病毒载体的不同，腺病毒载体具有许多独特的优点：①宿主范围广，对人致病性低；②在增殖和非增殖细胞中感染和表达基因；③能有效进行增殖，滴度高；④不整合到染色体，无插入突变性；⑤能同时表达多个基因。由于腺病毒载体具有诸多优点，因此在研究中越来越多地被采用。在前期研究的基础上，设计了以下叁部分研究：(1)以肾肿瘤相关抗原G250蛋白冲击DC诱导特异的CTL，研究其对肾癌细胞株的杀伤情况。(2)以Ad为载体，将G250基因转染DC诱导CTL，研究其对肾癌细胞株的杀伤情况，并与G250蛋白诱导组作比较分析。(3)转染Ad／G250的人树突状细胞诱导CTL抑制人肾癌细胞系786—0裸鼠移植瘤发生与生长。通过以上叁部分研究，探讨以Ad为载体，将肾癌抗原基因转染DC并诱导CTL，用于治疗肾癌的可行性，在此基础之上，优化制备工艺，为临床试用于抗原明确的肿瘤治疗奠定实验室基础。第一部分G250蛋白致敏的DC瘤苗体外诱导特异性抗肾癌免疫1研究方法：1．1人外周血树突状细胞的分离培养及致敏取健康者外周血50ml，肝素抗凝，用淋巴细胞分离液(1.077 Ficoll)分离获得单个核细胞(PBMC)，用AIM-V培养基制成细胞悬液，加入6孔培养板(1ml／L)中，在37℃，5％CO_2条件下培养4～6h，收集悬浮细胞(冻存备用)。在培养板中加入AIM-V+GM-CSF(终浓度为800U／ml)，每孔3ml，隔日半量换液，加入IL-4(终1000U／ml)，于第5d将DC分为2组，一组加入G250蛋白(浓度为750ug／L)，每孔100ul，另一组加PBS，两组同时加入TNF-α(终200U／ml)，37℃，5％CO_2继续培养3d。1．2 DC表面标志的表达检测将培养第8d的两组DC收集，计数。取两组DC，5×10~5／组，FITC-CD1a、PE=CD83、FITC-CD40、FITC-CD80、PE-CD86、PE-HLA-DR两两组合放入一管中标记DC，细胞用PBS洗涤2次，然后加入单抗10ul，4℃冰箱中避光反应30min，加入PBS 0.5ml，震荡悬浮细胞后上流式细胞仪分析。1．3混合淋巴细胞反应的检测取培养第8d的两组DC(一组为DC-G250；一组为DC-N)行混合淋巴细胞反应实验。将DC用30ug／ml的丝裂霉素，37℃作用30min，用PBS洗3次。冻存的自体T淋巴细胞用含IL-2(100U／L)和10％的人AB血清的RPMI-1640稀释成1×10~6／ml，加入96孔培养板(100ul／孔)。按1：5、1：10、1：20效靶比分别加入上述两组DC，同时设对照组(加入RPMI-1640培养液)，每组3个复孔，37℃，5％CO_2培养箱中孵育5d；然后加入5mg／ml的MTT 20ul／孔继续培养4h，加入二甲基亚砜(DMSO)100ul／孔。在酶标仪上测570nm波上的OD值。1．4细胞毒性T淋巴细胞杀伤活性试验取培养第8d的两组DC：一组为G250蛋白致敏组(DC-G250)，另一组为未致敏组(DC-N)。两组DC分加与自体淋巴细胞按1：20比例混合，以含人IL-2(终10U／ml)、GM-CSF(终800U／ml)、IL-4(终1000U／ml)、IL-7(终20ng／ml)的RPMI-1640培养液培养，5d后即获得两组CTL。收集共培养5d的两组CTL(第一组为T+DC-G250，第二组为T+DC-N)作为效应细胞，取两组的部分T(5×10~6／组)与FITC、PE、CY标记的单抗染色，流式细胞仪行细胞表型分析；分别以786-0(人肾透明细胞癌细胞系)和A549(肺癌细胞系)为阳性和阴性靶细胞，加入效应细胞，组内设定不同的效靶比观察孔，效靶比为5：1、10：1、20：1、40：1；每种效靶比设3个复孔，继续在37℃，5％CO_2培养箱中孵育44h，然后加入5mg／ml的MTT 20ul／孔，混匀，继续培养4h，每孔加入二甲基亚砜100ul，在酶标仪上测570hm处OD值。通过所测OD值，以及单纯效应细胞和单纯靶细胞为阴性对照所测OD值，利用公式算得CTL的杀伤活性。CTL杀伤活性=靶细胞对照组OD值-(实验组OD值-效应细胞对照组OD值)／靶细胞对照组OD值。1．5统计学处理采用SPSS13.0软件进行分析，统计方法采用析因设计资料方差分析，LSD法进行多重比较，数据以均数±标准差表示，P≤0.05被认为具有统计学意义。2研究结果(1)．G250蛋白致敏组与未致敏(对照)组均高表达CD80、CD83、CD86、CD40、HLA-DR，较低表达CD1a。(2)．两组DC均能刺激T淋巴细胞的增殖，DC-G250组和DC-N组之间差异有统计学意义(F=83.545，P=0.000)；DC-G250组刺激T淋巴细胞增殖能力强于DC-N组；不同浓度效靶比之间有显着性差异，效靶比1：5时刺激增殖能力最强。(3)．DC-G250组和DC-N组所诱导的CTL表面标志CD3+和CD8+／CD3+差异有统计学意义(t=9.589 P=0.01；t=11.806 P=0.000)，DC-G250组高于DC-N组。(4)．DC-G250组所诱导的CTL对786-0杀伤率高于DC-N组所诱导的CTL，两组间差异有显着性意义(F=29.483，P=0.000)；两组效应细胞对A549的杀伤率无显着性差异。3研究结论肾癌相关抗原6250蛋白致敏的DC瘤苗体外可有效的诱导出具有良好抗肿瘤活性的CTL，说明了以G250蛋白冲击DC所获瘤苗具有较好的可行性和临床应用前景。为进一步以腺病毒为载体的G250基因转染DC诱导CTL治疗肾癌的研究打下了基础。第二部分Ad／G250转染Dc诱导CTL治疗肾癌的研究1研究方法：1．1 Ad／G250转染DC并诱导CTL取健康人外周血，采用密度梯度离心的方法分离外周血单个核细胞(DC前体细胞)，培养于6孔板，贴壁4～6h，轻轻洗去悬浮细胞。将贴壁细胞分为叁组：基因转染组、蛋白致敏组及对照组。基因转染组感染携带G250基因的重组腺病毒Ad／G250，感染5h后更换为新鲜AIM-V培养基和GM-CSF(终浓度为800U／ml)，其余两组用AIM-V培养基和GM-CSF培养。隔日半量换液，加入IL-4，终浓度为1000U／ml。第5d除加GM-CSF和IL-4外，蛋白致敏组加入G250蛋白(浓度为750ug／L)，每孔100ul，对照组加PBS溶液100ul／孔，叁组同时加入TNF-α(终200U／ml)，37℃，5％CO_2继续培养3d。第8d，收集细胞，计数。取新分离的自体T淋巴细胞与培养所得的DC按DC：T=1：20比例混合，以AIM-V为培养基，同时加入GM-CSF(800U／ml)、IL-4(1000U／ml)、IL-2(10U／ml)及IL-7(20ng／ml)，共育5d，诱导获得叁组细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。1．2 Ad／G250基因表达及DC表面标志检测DC培养第8d，收集悬浮细胞(成熟DC)，显微镜观察细胞形态。基因转染组DC以RT-PCR扩增G250 mRNA产物，以对照组DC做对照。流式细胞仪分析DC表面标志，表面标志选择了代表DC特征的：CD1a、CD80、CD83、CD86、HLA-DR等。1．3 DC激发活的G250抗原特异性CTL抗肿瘤活性检测激活的CTL细胞表面标志分析：在培养第13d，以带荧光标记的PE-anti-CD4、FITC-anti-CD8和PE-anti-CD56标记叁组CTL，以流式细胞仪检测，从而得出叁组CTL中CD8／CD4和CD8／CD56的比值。MTT法检测CTL杀伤靶细胞的抗原特异性：以G250阳性及HLA-A2阳性的人肾癌细胞系786-0做为靶细胞，所有供血者的HLA-A2均与786-0是相匹配的；取G250阴性的人肺癌细胞株A549为靶细胞做阴性对照，采用MTT法检测所诱导的CTL对各类靶细胞的杀伤效率，分析CTL杀伤的抗原特异性。2研究结果：Ad／G250高效转染DC，G250蛋白在DC内成功表达：采用RT-PCR成功在基因转染组DC中扩增出G250产物；Ad／G250转染的DC表面标志CD40、CD80、CD83、CD86、HLA-DR与其它两组相比有显着性差异，Ad／G250组明显高表达，表明Ad／G250基因转染组可上调DC表面标志表达；Ad／G250组诱导的CTL CD8／CD4、CD8／CD56的比值高于G250蛋白刺激组及对照组；Ad／G250组诱导的CTL对G250阳性的786-0靶细胞有很好的细胞毒杀伤效应，此杀伤明显优于G250蛋白致敏组及对照组。3研究结论：以Ad为载体介导抗原基因转染DC，并诱导特异的CTL，从技术上是可行的，而且所诱导的CTL杀伤活性好于采用G250蛋白冲击致敏DC所诱导的CTL，有望成为一种肿瘤免疫治疗的理想方法。此研究方法也说明了以G250为靶点的免疫治疗可能是。肾透明细胞癌一种理想治疗模式。第叁部分Ad／G250转染DC抑制786—0裸鼠移植瘤发生与生长1、研究方法1．1人外周血树突状细胞的分离培养及致敏取健康者外周血50ml，肝素抗凝，用淋巴细胞分离液(1.077 Ficoll)分离获得单个核细胞(PBMC)，用AIM-V培养基制成细胞悬液，加入6孔培养板(1ml／L)中，在37℃，5％CO2条件下培养4～6h，轻轻洗去悬浮细胞。将贴壁细胞分为两组(基因转染组、蛋白致敏组)，基因转染组每孔加入Ad／G250病毒液100ul(病毒活性单位5.6×10~9 IU／ml)，感染5h后更换为新鲜AIM-V培养基和GM-CSF(终浓度为800U／ml)，蛋白致敏组用AIM-V+GM-CSF培养。分别于第1d和第3d，加入GM-CSF(终浓度为800U／ml)和IL-4(终1000U／ml)，隔日半量换液，第5d，两组中除加入GM-CSF和IL-4外，蛋白致敏组加入G250蛋白(浓度为750ug／L)，每孔100ul，两组同时加入TNF-α(终200U／ml)，37℃，5％CO_2继续培养3d。1．2诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)第8d，收集两组DC细胞，计数。以AIM-V为培养基，将两组DC与自体T细胞按DC：T=1：20的比例混合，除应用GM-CSF(终浓度800u／L)、IL-4(1000U／ml)，还加入IL-2(10U／ml)及IL-7(20ng／ml)，共育5d，获得两组细胞毒性T淋巴细胞(CTL)：一组为基因转染组(CTL-DC-Ad／G250)；另一组为G250蛋白冲击致敏组(CTL-DC-Pro／G250)。1．3荷瘤裸鼠模型的建立取裸鼠15只，收集对数生长期的786-0细胞，接种于裸鼠一侧肩颈部皮下，2×10~6／只，观察肿瘤发生时间及生长情况。肿瘤大小由肿瘤最大径与最小径的乖积(mm~2)来表示。1．4 DC激活的CTL预防裸鼠人肾癌细胞系786—0移植瘤发生：另外取15只裸鼠，随机分成叁组，每组5只：第一组裸鼠一侧颈背部皮下注射基因转染DC诱导的CTL(2×10~6／只)；第二组裸鼠一侧颈背部皮下注射蛋白致敏DC诱导的CTL(2×10~6／只)，第叁组裸鼠颈背部皮下注射生理盐水(200ul／只)作对照。3d后取对数生长期786—0细胞(2×10~6／只)接种于上述15只裸鼠另一侧颈背部皮下；每3d观察一次裸鼠移植瘤发生情况，直到接种后的第30d。1．5 DC激活的CTL抑制裸鼠人肾癌细胞系786—0移植瘤生长：1．3中接种786-0的裸鼠，接种后第16d，12只长出移植瘤，3只无移植瘤生长。接种后第21d，将成瘤裸鼠中肿瘤较大的两只和未成瘤的3只剔除本实验之外，入选的10只成瘤裸鼠移植瘤大小为8.6±1.2mm~2。将上述10只成瘤裸鼠随机分成两组：治疗组和对照组，每组5只。在治疗组，每只裸鼠另一侧背部皮下注射Ad／G250转染DC所诱导的CTL(2×10~6)作治疗；对照组注射生理盐水200ul。每3d观察一次移植瘤生长情况，肿瘤大小由肿瘤最大径与最小径的乖积(mm~2)来表示，直至接种后45d。2结果2．1 DC激活的CTL预防肿瘤发生基因转染DC诱导的CTL和蛋白致敏DC诱导的CTL预防裸鼠移植瘤发生实验中，在接种786-0肿瘤细胞后30d内两组裸鼠中均无移植瘤发生；而对照组于接种后第15d即可见移植瘤发生，观察至30d，5只中4只有移植瘤发生。2．2 DC激活的CTL抑制移植瘤的生长以Ad／G250转染DC诱导的CTL治疗成瘤裸鼠，因经费及时间所限，至接种后的第45d结束实验。接种后的第45d对照组、治疗组移植瘤大小分别为143.37±11.6 mm~2、42.55±5.62mm~2。结果显示Ad／G250转染DC所诱导的CTL对已生长的786-0移植瘤确有治疗作用，与对照组相比，治疗组移植瘤生长受到明显抑制(t=2.355，P=0.047＜0.05)。3研究结论：DC诱导的抗肿瘤免疫不仅能预防裸鼠人肾癌细胞系786-0移植瘤的发生，而且能抑制移植瘤生长。提示经G250基因转染制备的DC和G250蛋白冲击致敏的DC作为一新概念上抗肿瘤疫苗可能在肾肿瘤的预防及治疗中发挥重要作用。
胡义杰[5]2007年在《DNp73α基因修饰的树突状细胞抗肺癌的免疫学效应研究》文中进行了进一步梳理研究背景：肺癌是当前世界上对人类健康与生命危害最大的恶性肿瘤之一，发病率呈不断上升趋势，并已成为目前人类因癌症死亡的主要原因。虽然近年来化学治疗、放射治疗和外科治疗手段不断进步，但肺癌患者总体生存率仍然没有明显的改善，5年生存率不到15％。目前受人瞩目的生物治疗被认为是除手术、放疗、化疗之外的“第四模式”，其原理主要是通过导入外源性相关反义基因、生物小分子干扰甚至抑制肿瘤的生长，或调动机体的自然防卫机能或促进自身产生的某些物质来取得诱导肿瘤细胞自身生长的停滞或凋亡，从而达到治疗肿瘤的目的。免疫治疗是目前生物治疗肿瘤极有前景的治疗手段之一。研究表明，机体对肿瘤的免疫主要通过T细胞特异性杀伤来实现；而有效激活特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)，是实现肿瘤主动免疫治疗的关键。树突状细胞(dendritic cell，DC)是目前发现的体内功能最强、也是唯一能激活初始T淋巴细胞的抗原提呈细胞，它能高水平的表达与抗原提呈有关的MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ类分子，并可高水平的表达多种共刺激分子及某些粘附分子。DC细胞可摄取肿瘤特异性相关抗原，吞噬处理凋亡或坏死肿瘤细胞等颗粒性抗原，具有“交叉提呈(cross-presentation)”外源性抗原的能力。通过DC对肿瘤抗原的高效提呈作用，激发机体的特异性抗肿瘤免疫反应成为肿瘤免疫治疗的一个热门课题；而为DC疫苗寻找特异性的肿瘤抗原、探索最佳的加载途径成为目前研究的一大方向。目前肿瘤特异性抗原加载修饰DC的方法有很多。最常见的途径包括：肿瘤细胞裂解产物刺激、肿瘤来源的MHCⅠ类限制性多肽加载等。但采用整个肿瘤细胞作为抗原相对较为困难，因为标准的不统一，而且部分情况下肿瘤细胞的获得较为不易；而采用多肽需要明确特异的HLA表型。近来的研究结果表明肿瘤相关抗原cDNA修饰DC可以有效诱导肿瘤相关抗原特异性的免疫反应，并且具有其独特的优点，诸如：能提呈多种已知和未知的肿瘤相关抗原表型，内源性肿瘤相关抗原的处理提呈可能比外源性合成多肽的加载更有效。而基因修饰DC目前最常采用和最有效的方法为腺病毒载体。DNp73α由p53家族的成员p73基因经位于第3内含子的启动子启动，经过不同于P73的方式剪切，所生成N’端缺失的蛋白。DNp73α在正常组织细胞不表达，但在肺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌以及成神经细胞瘤等肿瘤细胞中高表达。并对野生型P53和P73产生竞争性抑制其作用。多个研究表明，DNp73a的高表达，是肿瘤较差预后的重要独立因素，是肿瘤生物治疗重要的分子靶点。但目前鲜有针对DNp73α靶点生物治疗的研究报道。在本研究中我们通过设计含有DNp73α全长cDNA的重组腺病毒，并将其转染修饰DC，来诱导针对高表达DNp73α的肿瘤细胞的特异CTL反应，为后续的动物及临床实验研究提供依据。研究方法：1．采用AdEasy系统构建携带HA标记含人全长DNp73αcDNA的复制缺陷型重组腺病毒Adv-DNp73α，即：从pcDNA3.0-DNp73α-HA中酶切出DNp73α基因，并定向克隆插入pAdTrack-CMV中构建成腺病毒穿梭质粒；pAdTrack-CMV-DNp73α经PmeI线性化后电穿孔法转化到含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的E．coli BJ5183菌株内同源重组。筛选正确的重组质粒，PacI线性化后脂质体法转染293T细胞包装成重组病毒颗粒；并在293T细胞中反复扩增。携带绿色荧光标记的Adv-EGFP作为实验对照。2．人脐带血经梯度离心法和细胞因子IL-4、GM-CSF诱导培养的树突状细胞。通过增强离心法使DNP73α重组腺病毒有效转染DC，并通过追踪绿色荧光蛋白的表达，检测不同感染复数(M．O．I．)的转染效率以及腺病毒转染对细胞的毒性，来确定合适的感染复数；3．用RT-PCR和Western Blot检测受Adv-DNp73α转染48小时后DC胞内DNp73α的mRNA和蛋白表达；4．流式细胞仪检测Adv-DNp73α腺病毒转染后48小时DC表面分化成熟、活化标志物表达的变化。正常DC和Adv-EGFP转染组作为对照。5．Annexin V-PE染色分别检测Adv-DNp73α腺病毒转染后4天、8天和12天DC凋亡的水平。正常DC和Adv-EGFP转染组作为对照。6．采用尼龙毛柱法分离纯化同源T细胞。纯化的T细胞在96孔板中与经丝裂霉素C预处理的各种DC共培养5天。结束培养前8小时加入1μCi／孔的~3H胸腺嘧啶脱氧核苷。收获细胞后，放射性荧光闪烁计数仪检测每分钟放射性荧光闪烁计数值。7．Real Time PCR对比分析A549／DNp73α肺腺癌细胞株、人慢性髓细胞白血病细胞K-562细胞株和人乳腺癌细胞株MCF-7细胞中DNp73αmRNA的表达水平；CytoTox 96 non-radioactive cytotoxicity assay检测不同效应细胞(细胞毒性T淋巴细胞CTL、普通T细胞以及淋巴因子活化的杀伤细胞LAK)针对不同DNp73α靶细胞(A549／DNp73α、K-562、MCF-7)的杀伤效应。8．统计分析：数据采用(?)±SD表示；对于正态分布数据，组间比较采用t检验。非正态分布数据采用秩和检验分析。p＜0.05认为有显着统计学差异，p＜0.01认为差异非常显着。所有数据采用统计学软件SPSS10.0分析。结果：1．采用定向克隆以及同源重组在293T细胞内产生了具有转染能力的腺病毒颗粒；通过反复感染，获得较高滴度腺病毒液(约2.5×10~(11)pfu／L)；2．从人脐静脉血中培养出DC。光镜以及扫描电镜观察到所诱导DC具有不规则形状和典型的多个树突样突起；流式细胞仪证实典型表面分子表达CD1a~+，CD83~+，and HLA-DR~+；3．采用M．O．I 200的病毒液转染48小时后，DC的转染效率达到80％以上，并且细胞具有较高活力。携带DNp73αcDNA的重组腺病毒转染DC，使DNp73αmRNA和蛋白的表达显着增加；并可以促进DC的分化成熟，即上调CD83和HLA-DR的表达。4．在重组腺病毒转染DC后4天、8天，叁组细胞(即DNp73α、Adv-EGFP和正常DC组)生存率之间无显着差异；但转染后12天，DNp73α转染组生存率为71±2.83％，非常显着高于Adv-EGFP和正常DC组(分别为45.50±3.54％and53.52±0.71％，p＜0.01)。5．Adv-DNp73α、Adv-EGFP重组腺病毒转染DC后4天和8天，其刺激T淋巴细胞增殖能力均非常显着高于正常DC(p＜0.01)，但Adv-DNp73α、Adv-EGFP两组间无差异；在转染后12天，DNp73α修饰的DC刺激T淋巴细胞的增殖能力高于Adv-EGFP组(p＜0.01)。6．DNp73α特异性CTL能有效裂解A549／DNp73α细胞(DNp73a++)、K-562细胞(DNp73α+)；而MCF-7细胞(DNp73α—)仅少部分裂解。同时这种特异性CTL杀伤A549／DNp73α细胞的水平高于K-562细胞。而对比研究DNp73α特异的CTL、LAK和正常T细胞分别针对A549／DNp73α细胞、K-562细胞和MCF-7细胞的杀伤作用，发现DNp73α特异性的CTL针对A549／DNp73α细胞、K-562细胞的杀伤效应接近LAK的能力；LAK同样可以有效的杀伤MCF-7细胞，而DNp73α特异性的CTL仅少量裂解MCF-7。结论：DNp73αcDNA修饰的DC疫苗，能诱导针对DNp73α特异性的CTL，证实了DNp73α基因修饰DC疫苗治疗肺癌的可行性和有效性；同时携带DNp73αcDNA的重组腺病毒转染DC，可以抑制DC的细胞凋亡、延长DC的生存时间，提高刺激T细胞增殖的能力，该作用将有可能进一步提高针对DNp73α高表达肿瘤细胞的免疫杀伤作用。
王阳[6]2015年在《ΔNp73α基因转染树突状细胞抗乳腺癌细胞的免疫效应》文中指出目的研究ΔNp73α基因转染树突状细胞(DC)诱导的特异性抗乳腺癌免疫效应。方法取健康人脐带血细胞经细胞因子粒细胞集落刺激因子(rh GM-CSF)、白细胞介素-4(rh IL-4)、肿瘤坏死因子(rh TNF-α)诱导培养DC,流式细胞仪(FCM)检测DC成熟前后特异性抗原CD1a、CD83的表达变化情况。利用脂质体lipofectamine2000将ΔNp73α转染至DC,经Western blot检测转染后蛋白表达情况。将转染DC与自体T细胞共培养诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。FCM检测转染DC与T细胞共培养前后的淋巴细胞亚群变化情况;ELISA法检测活化T细胞分泌IFN-γ水平;乳酸脱氢酶法(LDH)检测T细胞对乳腺癌MDA-MB-231细胞的杀伤作用。使用SPSS17.0软件对实验数据进行统计学分析。结果1、脐带血来源的单核细胞(MNC)在细胞因子rh GM-CSF、rh IL-4、rh TNF-α诱导下,于第7天分化为成熟DC。2、成熟DC的特异性抗原CD1a表达约占58.78%,CD83约占76.61%,分别与未成熟DC的CD1a阳性率20.34%及CD83阳性率15.13%比较,差异有显着统计学意义(P<0.01)。3、Western blot检测到ΔNp73α转染组有一条特异性条带表达。4、T-DC组、T-DC-ΔNp73α组CD4+T淋巴细胞阳性率分别为(29.12±0.61)%、(31.52±0.97)%,CD8+T淋巴细胞的阳性率分别为(18.82±1.29)%、(45.71±0.74)%,都高于T淋巴细胞组CD4+T阳性率(18.31±1.81)%及CD8+T阳性率(18.59±2.18)%,并且T-DC组与T-DC-ΔNp73α组中CD4+占CD3+T细胞含量比较差异无统计学意义(P>0.05),而CD8+占CD3+T细胞含量比较差异显着(P<0.01)。5、转染ΔNp73α的DC与T细胞共培养诱导的特异性CTL对乳腺癌细胞MDA-MB-231杀伤作用高于DC组(P<0.05),分泌IFN-γ的水平升高,与pc DNA组及DC组比较均有显着统计学意义(P<0.01)。结论1、MNC经细胞因子诱导成功培养出成熟DC细胞。ΔNp73α转入DC细胞并获得表达,说明制备ΔNp73α-DC疫苗的可行性。2、以ΔNp73α转染DC制备的DC疫苗,具有显着诱导CTL杀伤乳腺癌细胞的作用,进一步说明制备ΔNp73α-DC疫苗的有效性。
蒋力[7]2009年在《DNp73α及恩度~(?)介导特异性杀伤肿瘤内皮细胞效应的研究》文中进行了进一步梳理背景和目的:肿瘤是极大危害人类健康的疾病之一,肿瘤的发生是多因素、多阶段、多步骤的复杂过程。分子生物学研究表明,肿瘤的发生与癌基因激活、抑癌基因失活密切相关,这些基因改变的结果最终导致肿瘤细胞生长的无限制性,所以单独针对某个基因的作用对于抑制肿瘤的发生和发展并无明显的治疗意义。肿瘤血管是肿瘤形成、生长及转移的基础,破坏少量的肿瘤血管即可导致大片区域的肿瘤细胞缺血坏死,因此特异性杀伤肿瘤血管内皮细胞已成为肿瘤治疗的重要策略之一【1】。目前,肿瘤血管内皮靶向性杀伤的主要方法有两种:1.通过特异性作用于肿瘤血管内皮细胞的化学药物抑制肿瘤血管形成及生长;2.通过T细胞特异性杀伤来实现,这也是机体对肿瘤免疫的主要途经。内皮抑素(Endostatin,ES)是1997年Reilly等【2】从小鼠血管内皮瘤( EOMA)细胞培养液中提取的一种内源性血管生成抑制剂,为胶原ⅩⅧC末端水解片段,在小鼠体内对肿瘤诱导的血管生成具有几乎完全的抑制作用,并显示很强的抗肿瘤活性。研究表明,内皮抑素能特异性抑制血管内皮细胞增殖【3】,抑制内皮细胞的迁移,诱导内皮细胞凋亡和细胞周期阻滞【4-5】。反复使用内皮抑素不会使癌细胞产生抗药性,并且没有明显的毒副作用。美国食品药品管理局(FDA)于1999年底批准了由毕赤酵母表达的重组人内皮抑素作为肿瘤治疗药物进行I期临床试验;2001年又进行II期临床试验。然而,人重组内皮抑素半衰期短、复性及大量生产较为困难的特点限制了内皮抑素的临床应用。2005年,中国科学家在ES的基础上改变了其氨基酸序列,在ES母体上创造性的添加了9个氨基酸(MGGSHHHHH)使该蛋白的药用性能和疗效得到显着提高,该药即为恩度(Endostar)。恩度是一种新型的抗血管生成药物,相对于ES,不仅使稳定性提高、纯度明显增加、半衰期延长,而且生物活性增加【6】。但恩度对于肿瘤血管内皮细胞的作用效果及具体机制尚不十分清楚,恩度对肿瘤血管内皮细胞是否具有特异性的抑制作用,这一作用是如何发挥,都需要进一步深入细致的工作来研究探讨。在人体的免疫反应过程中,外来的抗原物质需经过处理并呈递给具有分泌细胞激素功能之辅助性T细胞,才能进一步活化以B细胞和T细胞为中心的体液免疫及细胞免疫反应。故有效激活特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL),是实现肿瘤主动免疫治疗的关键。人树突状细胞(Dendritic cell,DC)起源于造血干细胞(hemopoieticstemcell)。是机体功能最强的专职抗原呈递细胞(Antigen presenting cells, APC),它能高效地摄取、加工处理和递呈抗原,能高水平的表达与抗原提呈有关的MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ类分子,并可高水平的表达多种共刺激分子及某些粘附分子,所以,DC细胞可摄取肿瘤内皮特异性相关抗原,吞噬处理凋亡或坏死肿瘤细胞等颗粒性抗原,并具有“交叉提呈(cross-presentation)”外源性抗原的能力。通过DC对肿瘤内皮抗原的高效提呈作用,激发机体的特异性抗肿瘤免疫反应成为肿瘤免疫治疗的一个热门课题,而为DC疫苗寻找特异性的肿瘤抗原、探索最佳的加载途径成为目前研究的一大方向。DNp73α由p53家族的成员p73基因经位于第3内含子的启动子启动,经过不同于p73的方式剪切,所生成N’端缺失的蛋白。DNp73α在正常组织细胞及血管内皮中不表达,但在肺癌、乳腺癌、肾母细胞癌、宫颈癌以及成肝癌等肿瘤内皮细胞中高表达。并对野生型P53和P73产生竞争性抑制其作用,促进肿瘤血管内皮增生和毛细血管的形成。是肿瘤生物治疗潜在的分子靶点。但目前鲜有针对DNp73α靶点抗血管生物治疗的研究报道。在本研究中我们通过设计含有DNp73α全长cDNA的重组腺病毒,并将其转染修饰DC,进而诱导针对高表达DNp73α的肿瘤源性血管内皮细胞的特异CTL反应,同时探讨恩度对肿瘤血管内皮细胞是否具有特异性的抑制作用及相关的抗血管形成机制。为后续的动物及临床实验研究提供依据。研究方法:1.采用AdEasy系统构建携带HA标记含人全长DNp73αcDNA的复制缺陷型重组腺病毒Adv-DNp73α,即:从pcDNA3.0-DNp73α-HA中酶切出DNp73α基因,并定向克隆插入pDC315-EGFP Vector中构建成腺病毒穿梭质粒;pDC315-EGFP Vector-DNp73α经PmeI线性化后电穿孔法转化到含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的E. coli BJ5183菌株内同源重组。筛选正确的重组质粒,PacI线性化后脂质体法转染293T细胞包装成重组病毒颗粒;并在293T细胞中反复扩增。携带绿色荧光标记的Adv-EGFP作为实验对照。2.采用胰酶消化柱状离心法分离人脐静脉内皮获得HUVEC,并通过与A549上清共培养诱导生成TDEC细胞,通过MTT法、细胞迁徙实验、流式细胞仪等检测TDEC细胞生物学特性的改变。3.人脐带血经梯度离心法和细胞因子IL-4、GM-CSF诱导培养的树突状细胞。通过增强离心法使DNP73α重组腺病毒有效转染DC,并通过追踪绿色荧光蛋白的表达,检测不同感染复数(M.O.I.)的转染效率以及腺病毒转染对细胞的毒性,来确定合适的感染复数;3.用RT-PCR和Western Blot检测Adv-DNp73α转染48小时后DC胞内DNp73α的mRNA和蛋白表达;4.采用尼龙毛柱法分离纯化同源T细胞。纯化的T细胞在96孔板中与经丝裂霉素C预处理的各种DC共培养5天。结束培养前8小时加入1μCi/孔的3H胸腺嘧啶脱氧核苷。5.RT-PCR对比分析TDEC/DNp73α细胞、TDEC细胞和HUVEC细胞中DNp73αmRNA的表达水平;并检测不同效应细胞(细胞毒性T淋巴细胞CTL、普通T细胞以及淋巴因子活化的杀伤细胞LAK)针对不同DNp73α靶细胞(TDEC/DNp73α细胞、TDEC细胞和HUVEC细胞)的杀伤效应。6.采用人肺腺癌细胞A549培养上清作为条件培养基诱导培养人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVEC),并鉴定条件培养基诱导培养后的细胞(Tumor-derived Endothelial Cells,TDEC)是否具有肿瘤血管内皮细胞的特性。7.利用TDEC作为研究模型,检测恩度对HUVEC和TDEC细胞生物学特性影响的差异;建立裸鼠移植瘤模型,观察恩度的治疗效应并分析其机制。8.统计分析:数据采用x±SD表示;对于正态分布数据,组间比较采用t检验。非正态分布数据采用秩和检验分析。p<0.05认为有显着统计学差异,p<0.01认为差异非常显着。所有数据采用统计学软件SPSS10.0分析。结果:1.采用定向克隆以及同源重组在293T细胞内产生了具有转染能力的腺病毒颗粒;通过反复感染,获得较高滴度腺病毒液;2.分离人脐静脉内皮获得HUVEC,并通过与A549上清共培养诱导生成TDEC细胞,证实TdEC有较强的细胞迁徙能力,增殖活跃,S期、G2-M细胞比例远大于HUVEC细胞,并特异性的表达肿瘤内皮相关抗原TEM1/TEM8。3.人肺腺癌细胞A549培养上清作为条件培养基能诱导HUVEC衍生为具有肿瘤血管内皮细胞特性的TDEC。4.较低浓度的恩度对HUVEC没有明显的抑制作用,而对TDEC则具有显着的生长抑制作用,该抑制作用具有时间和浓度依赖性。同时,较低浓度的恩度能显着降低TDEC细胞迁徙活性,诱导细胞凋亡及阻滞TDEC细胞于G0/S期,但对于HUVEC的作用并不显着。在体研究中,瘤内注射一定浓度的恩度能抑制移植瘤生长,其机制可能是通过诱导肿瘤细胞凋亡,升高肿瘤内Ca2+浓度,抑制肿瘤内新生血管的形成。5.从人脐静脉血中培养出DC,采用M.O.I 200的病毒液转染48小时后,DC的转染效率达到80%以上,并且细胞具有较高活力。6.DNp73α特异性CTL能有效裂解TDEC/DNp73α细胞、少量裂解TDEC细胞;而HUVEC细胞几乎不裂解。同时这种特异性CTL杀伤TDEC/DNp73α细胞的水平高于TDEC及HUVEC细胞。而对比研究DNp73α特异的CTL、LAK和正常T细胞分别针对TDEC/DNp73α细胞、TDEC细胞和HUVEC细胞的杀伤作用,发现DNp73α特异性的CTL针对TDEC/DNp73α细胞杀伤效应接近高于LAK的能力;LAK同样可以有效的杀伤TDEC细胞。结论:HUVEC可以通过与A549细胞上清共培养诱导生成TDEC,生成的TDEC具有肿瘤源性血管内皮细胞相关特性,其迁徙增殖能力显着强于HUVEC,可以作为体外抗肿瘤血管内皮效应研究的模型。恩度可以抑制肿瘤血管内皮细胞的生长和肿瘤血管的形成而不损伤正常的血管内皮细胞,因此这种抑制作用是具有肿瘤特异性的,在肿瘤的临床治疗中具有疗效好、副作用小的特点,有着理想的临床应用前景。。DNp73α2.2修饰的DC,可以诱导生成DNp73α特异性CTL,有效裂解DNp73α高表达的TDEC/DNp73α细胞。
尤长宣[8]2006年在《AAV介导抗原基因转染DC激活免疫效应细胞治疗肿瘤的研究》文中研究说明研究表明，肿瘤的发生及发展与患者体内的T淋巴细胞功能缺陷有关，进一步的研究发现，导致此缺陷的原因在于机体对成熟树突状细胞(Dendritic cell，DC)的功能下调。在体外，很多实验证实即使由晚期肿瘤患者外周血分离出的淋巴细胞对多种外界刺激仍然保持着很好的反应能力。因此，通过体外培养DC，诱导特异高效的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，回输免疫患者，有望成为治疗肿瘤的绝佳疗法。而目前最需解决的问题是：如何在已知靶抗原的前提下，获得良好活性、足够数量的特异性CTL?DC是人体内功能最强大的抗原递呈细胞。如能将抗原成功加载DC，可诱导抗原特异的CTL。目前，采用粒-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)和白细胞介素-4(Interleukin-4，IL-4)已能成功在从外周血单个核细胞培养出DC。但是，在如何有效刺激DC产生CTL的体外操作技术路线上，主要的技术焦点是如何有效地将抗原导入DC?研究表明：不同的抗原加载方式，对DC的活化效率不同，产生CTL的活性也不一致。目前抗原加载存在着多种手段，常用的策略有：抗原肽导入DC及病毒载体携带抗原基因转染DC两种方式。采用肿瘤抗原肽导入DC虽有抗原比较特异，可多次免疫等优点，但存在的主要问题是：这类抗原肽往往半衰期较短，因此需要多次免疫方可获得良好活性的CTL，而且转导效率低下。病毒载体携带抗原肽基因转染DC，可使基因在DC体内稳定表达，从而使DC获得持续而大量的抗原肽刺激，有望解决单纯抗原肽转导存在的问题。目前转染DC常用的病毒载体有：逆转录病毒，腺病毒和腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV)。这叁种病毒载体中，AAV较前二种病毒更适用于DC转染。原因有：AAV没有致病性，它是依赖型病毒，如果没有辅助病毒如腺病毒存在，不能完成自主包装：AAV可将携带基因特异整合于人类的第19号染色体上，在保证基因能长期稳定表达的情况下，又不存在逆转录病毒载体的随机整合易诱发癌变的危险，因此具有很高的安全性(到目前为止，还没出现过安全方面的问题)；AAV全长仅为5kb左右，自身免疫原性低，不存在腺病毒具有较高的免疫原性的缺点；AAV转染谱广，既可转染分裂细胞，又可转染非分裂细胞，转染效率高，在我们的前期研究中发现，AAV对DC有很高的转染效率(约为90％)，且能上调DC表面标志CD80，CD83，CD86等的表达，从而上调DC的功能；采用AAV为载体，基因转染制备DC诱导CTL时，只需要一次刺激，2周内即可获得良好生物活性的CTL，快速高效(前期的研究成果)；AAV生命力强，运输及贮存均简单易行。在前期研究的基础上，以AAV为载体，设计了以下两部分研究：BA46基因转染DC并诱导CTL治疗乳腺癌：前列腺特异抗原(prostate special antigen, PSA)基因转染DC并诱导CTL治疗前列腺癌；通过这两部分研究，探讨以AAV为载体，将肿瘤抗原基因转染DC，诱导CTL，用于肿瘤治疗的可行性，并在此基础上，优化制备工艺，为临床试用于抗原明确的肿瘤治疗奠定实验室基础。第一部分AAV／BA46转染DC诱导CTL治疗乳腺癌的研究1研究方法：1．1 AAV／BA46病毒制备：从BA46阳性的乳腺癌细胞株Hs 578T抽提总RNA，分离出mRNA。设计引物：5’CCGCAGCATGCCGCGCCC 3’和5’CACTAACAGCCCAGCAGC 3’，RT-PCR扩增，切胶纯化获得BA46 cDNA，测序并比对鉴定后，克隆入腺相关病毒载体AAV(d16-95)，构建重组质粒AAV(d16-95)／BA46。无腺病毒参与的pSH3包装系统制备AAV／BA46病毒，纯化，Dot-blot测定病毒滴度。1．2 AAV／BA46转染DC并诱导CTL取健康人外周血，采用密度梯度离心的方法分离外周血单个核细胞(DC前体细胞)，培养于6孔板，贴壁5h，轻轻洗去悬浮细胞(T细胞，冻存备用)，取贴壁细胞，将细胞分为基因转染组及对照组，基因转染组感染携带BA46基因的重组腺相关病毒AAV／BA46，感染5h后更换为新鲜AIM-V培养基，对照组以293细胞冻融裂解液刺激，两组细胞均采用重组粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素4(IL-4)诱导DC成熟。第6天，取原先冻存的T细胞与培养所得的DC按DC：T=1：20比例混合，以AIM-V为培养基，同时加入GM-CSF(800 U／ml)、IL-2(10 U／ml)及IL-7(20 ng／ml)，共育7天，诱导获得细胞毒性T淋巴细(CTL)。1．3 AAV／BA46基因表达、整合及DC表面标志检测DC培养第6天，收集悬浮细胞(成熟DC)，显微镜观察细胞形态，基因转移组DC经RT-PCR获得BA46 mRNA扩增产物，以~(32)P-标记的BA46系列探针进行检测。PCR／Southern blot分析AAV／BA46染色体整合情况。流式细胞仪分析DC表面标志，表面标志选择了代表DC特征的：CD80、CD86、CD40等。1．4 DC激活的BA46抗原特异CTL抗肿瘤活性检测激活的CTL细胞表面标志分析：在培养第13天，以带荧光标记的PE-anti-CD4、FITC-anti-CD8和PE-anti-CD56标记CTL，以流式细胞仪检测，从而得出CTL群体中CD8／CD4和CD8／CD56的比值。激活的CTL细胞因子表达分析：在培养第13天，收集CTL，洗涤并以2％的多聚甲醛室温下处理20分钟，以PBS／1％BSA／0.5％皂甙室温下透膜处理10分钟，以带荧光标记的FITC-anti-IFN-r和PE-anti-IL-4标记CTL，以流式细胞仪检测，从而得出细胞内因子IFN-r和IL-4的表达情况。~(51)Cr释放法检测CTL的杀伤靶细胞的抗原特异性：靶细胞：1、BA46阳性及HLA-Al阳性的人乳腺癌细胞系Hs578T做为一种靶细胞，所有供血者的HLA-Al均与Hs578T是相匹配的。2、以EB病毒感染供血者的淋巴细胞，制备MHC完全相匹配的淋巴细胞系LCL(按说明书的标准方法)，并以AAV／BA46反复感染该LCL筛选获得完全同源的BA46阳性LCL(通过流式细胞仪鉴定)做为另一靶细胞。采用6小时~(51)Cr释放法检测所诱导CTL对各类靶细胞的杀伤效率。~(51)Cr释放法检测CTL杀伤靶细胞的MHCⅠ类限制性：将各类靶细胞与1／1000 anti-HLAⅠ类抗体预先共育7天，封闭靶细胞的MHCⅠ类抗原后，再以上述的6小时~(51)Cr释放法检测所诱导CTL对各类靶细胞的杀伤效率。2研究结果：成功构建了AAV／BA46质粒，制备了高滴度的AAV／BA46病毒，AAV／BA46病毒成功转染DC前体细胞(单核细胞)，AAV／BA46介导BA46 mRNA成功翻译，AAV／BA46基因成功整合入DC染色体内，DC培养良好，AAV／BA46转染的DC表面标志CD80、CD86明显高表达，仅用1周诱导的CTL中CD8／CD4和CDS／CD56的比值均明显增高，IFN-r表达明显增高，IL-4表达明显减低，而且对BA46阳性的靶细胞有很好的细胞毒杀伤效应，此杀伤具有BA46抗原特异性和MHCⅠ类限制性。3研究结论以AAV为载体介导抗原基因转染DC，并诱导特异的CTL，从技术上是可行的，获得的CTL有较高抗肿瘤活性，有望成为一种肿瘤免疫治疗的理想方法；而且，BA46可能是乳腺浸润性导管癌免疫治疗的理想靶点。第二部分AAV／PSA转染DC诱导CTL治疗前列腺癌的研究1研究方法：1．1 AAV／PSA病毒制备：从PSA阳性的前列腺癌细胞株LNCaP抽提总RNA，分离出mRNA。设计引物：5'-TCGCGCCGAGATGTGGAAT-3'和5'-TGTTCTTCTAGGTCTCCACC-3', RT-PCR扩增，切胶纯化获得PSA cDNA，测序鉴定与公开的PSA序列吻合后，克隆入腺相关病毒载体AAV(d16-95)，构建重组质粒AAV(d16-95)／PSA(简写为AAV／PSA)。无腺病毒参与的pSH3包装系统制备AAV／PSA病毒，纯化，Dot-blot测定病毒滴度。1．2 AAV／PSA转染DC并诱导CTL取健康人外周血，采用密度梯度离心的方法分离外周血单个核细胞(DC前体细胞)，培养于6孔板，贴壁5h，轻轻洗去悬浮细胞(T细胞，冻存备用)，取贴壁细胞，以叁种不同方法刺激DC前体细胞，包括AAV／PSA转染，PSA蛋白刺激及293细胞冻融裂解物刺激做为对照组，基因转染组感染携带PSA基因的重组腺相关病毒AAV／PSA，感染5h后更换为新鲜AIM-V培养基，PSA蛋白刺激组以脂质体包裹PSA蛋白进行转导，对照组以293细胞裂解物液刺激，各组细胞均采用重组粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素4(IL-4)诱导DC前体细胞成熟。第6天，取原先冻存的T细胞与培养所得的DC按DC：T为1：20比例混合，以AIM-V为培养基，同时加入GM-CSF(800 U／ml)、IL-2(10 U／ml)及IL-7(20 ng／ml)，共育7天，诱导获得细胞毒性T淋巴细(CTL)。1．3 AAV／PSA转染效率分析、基因表达、整合及DC表面标志检测DC培养第6天，收集悬浮细胞(成熟DC)，显微镜观察细胞形态，基因转移组DC经过固定及穿透处理后，与鼠anti-PSA单抗共育，然后以FITC标记的羊抗鼠单抗处理后，以流式细胞仪检测AAV／PSA转染效率。同时取标记过的DC细胞，离心后涂片，以荧光显微镜观察，明确PSA多肽在DC细胞内的表达。PCR／Southern blot分析AAV／PSA染色体整合情况。流式细胞仪分析DC表面标志，表面标志选择了代表DC特征的：HLA-DR、CD1a、CD14、CD83、CD80、CD86、CD40等。1．4 DC激活的PSA抗原特异CTL抗肿瘤活性检测激活的CTL细胞表面标志分析：在培养第13天，以带荧光标记的PE-anti-CD4、FITC-anti-CD8、PE-anti-CD56、FITC-anti-CD25、FITC-anti-CD69标记CTL，以流式细胞仪检测，从而得出CTL群体中CD8／CD4和CD8／CD56的比值以及CD25、CD69表达情况。激活的CTL细胞因子表达分析：在培养第13天，收集CTL，洗涤并以2％的多聚甲醛室温下处理20分钟，以PBS／1％BSA／0.5％皂甙室温下透膜处理10分钟，以FITC-anti-IFN-r和PE-anti-IL-4抗体标记CTL，以流式细胞仪检测，从而得出细胞内因子IFN-r和IL-4的表达情况。~(51)Cr释放法检测CTL的杀瘤活性：靶细胞：1、PSA阳性及HLA-A1阳性的人前列腺癌细胞系LNCaP做为一种靶细胞，所有供血者的HLA-A1均与LNCaP是相匹配的。2、以EB病毒感染供血者的淋巴细胞，制备MHC完全相匹配的淋巴细胞系LCL(按说明书的标准方法)，并以AAV／PSA反复感染该LCL筛选获得完全同源的PSA阳性的LCL(通过流式细胞仪鉴定)做为另一靶细胞。同时取多种PSA阴性的其他肿瘤细胞做为阴性对照，采用6小时~(51)Cr释放法检测所诱导CTL对各类靶细胞的杀伤效率，分析CTL杀伤的抗原特异性，在此基础上，设计不同病毒浓度感染DC诱导获得的CTL，用于对PSA阳性LCL的杀伤，探讨杀伤作用与病毒浓度的相关性。~(51)Cr释放法检测CTL杀瘤的MHCⅠ类限制性：将各类靶细胞与1／1000anti-HLAⅠ抗体预先共育7天，以MHCⅡ类抗体为阴性对照，分别封闭靶细胞的MHCⅠ类抗原和MHCⅡ类抗原后，再以上述的6小时~(51)Cr释放法检测所诱导CTL对各类靶细胞的杀伤效率，从而得出CTL杀伤的MHCⅠ类限制性。研究结果：成功构建了AAV／PSA质粒，制备了高滴度的AAV／PSA病毒，AAV／PSA高效转染DC，PSA蛋白在DC内成功表达：AAV／PSA基因成功整合入DC染色体内：AAV／PSA转染的DC表面标志HLA-DR、CD1a、CD83、CD80、CD86、CD40明显高表达；仅用1周即可诱导得到高活性的CTL；AAV／PSA转染所获得CTL的CD8／CD4、CD8／CD56的比值以及CD69、IFN-r的表达均明显高于PSA蛋白剌激组及对照组；而CD25和IL-4的表达低于PSA蛋白刺激组及对照组；而且AAV／PSA转染所获得的CTL对PSA阳性的靶细胞有很好的细胞毒杀伤效应，此杀伤明显优于PSA蛋白刺激组及对照组，而且，该杀伤具有PSA抗原特异性和MHCⅠ类限制性，且与加入的AAV／PSA病毒浓度呈正相关。研究结论本部分研究在第一部分研究的基础上，再一次证实了以AAV为载体介导抗原基因转染DC，并诱导特异的CTL，在技术上是可行的，而且所诱导的CTL活性好于采用抗原蛋白直接转导所得的CTL，有望成为一种肿瘤免疫治疗的理想方法。此研究也说明了以PSA为靶点的免疫治疗可能是前列腺癌一种理想治疗模式。
喻璟瑞[9]2004年在《突变K-ras基因修饰的肺癌树突状细胞疫苗体外活性检测和体内抗瘤作用的研究》文中认为肺癌是严重威胁人类健康和生命的恶性肿瘤,其发病率仍将在相当长时期内呈显着上升趋势,但其治疗效果在近十年来没有显着地提高,总的治愈率在10-15%左右。目前,治疗肺癌的主要手段是以外科手术为主的多学科综合治疗,但大部分患者在就诊时就已失去手术时机,而能手术的患者中,大多数将最终死于肺癌的局部复发或远处转移。放疗、化疗一方面能杀死肿瘤细胞,但另一方面却对机体的免疫功能造成了极大的损害,肿瘤疫苗作为一种生物治疗方法,主要是通过纠正肿瘤患者的免疫缺陷,启动患者自身特异性肿瘤免疫反应,在消灭肿瘤细胞的同时对正常细胞的危害较轻或无损害,故已成为当今肿瘤治疗研究的热点。本研究应用细菌内同源重组法构建了携带12位密码子点突变的K-ras基因全长cDNA的重组腺病毒和不含任何目的基因修饰的对照腺病毒,将重组腺病毒导入树突状细胞(DC)获得基因修饰的肺癌DC疫苗,同时通过脂质体转染的方法将相同的突变K-ras基因转入lewis肺癌细胞中,构建能表达相应基因的靶细胞,以研究该疫苗在体内外的抗肺癌作用和其机制。本研究观察到:
曲春枫[10]1999年在《中国人IL-12基因的克隆、鉴定及其转导人树突状细胞后的抗原提呈功能的研究》文中认为IL-12通过增强T细胞和NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性而在先天性免疫和获得性抗肿瘤免疫中均发挥着重要作用，树突状细胞(DC)是机体内一种有效的抗原提呈细胞。本研究利用已知的分别能被CD4~+T和CD8~+T淋巴细胞所识别的抗原多肽表位，观察IL-12基因转染入DC后，在DC呈递抗原局部较高水平的IL-12表达，对Th细胞发育分化和CTL功能的影响，以探讨IL-12基因转染DC在负载上相应肿瘤抗原后作为治疗性肿瘤疫苗的可能性。采用RT-PCR从脐血DC中克隆了人IL-12p40基因。序列分析显示第210位密码子具有独特的序列特征，是GCC(Ala)而非GTC(Val)。利用此基因与NKSFp35(购自ATCC)构建人了人IL-12基因的逆转录病毒双亚基共表达载体，在其转导细胞后表达出了具有生物学活性的IL-12，Western Blot分析显示有特异性蛋白条带。提示IL-12p40基因可能存在着多态性。采用脂质体转染技术，将这一表达载体转染经FIt-3L、SCF和GM-CSF刺激后进入到细胞增殖周期中的DC前体细胞，随后采用GM-CSF、IL-4和TNF-α进行定向扩增培养。在上述细胞因子作用下，IL-12基因转染的DC前体细胞能够发育成为具有典型形态学与表型特征的DC，采用流式细胞仪的分析结果显示：细胞表面具有丰富的MHC-Ⅰ、Ⅱ类分子及共刺激分子CD80、CD86的表达；并且50％以上的细胞中有IL-12p70蛋白表达，ELISA测定培养细胞上清中IL-12的产量最高可达到1.8ng/10~6个细胞／24小时。采用同种异体混合淋巴细胞培养，肽特异性淋巴细胞反应观察IL-12基因转导DC在其抗原提呈后对Th细胞分化发育、及特异性CTL功能的影响。结果表明IL-12基因转导DC与基因未转导DC相比，对同种异体淋巴细胞具有更高水平的刺激能力。在负载上CD4~+T淋巴细胞的抗原表位HBcAg_(50-69)多肽后，能够刺激Th细胞发生更高水平的增殖，并能够诱导这些细胞产生更多的IFN-γ，提示IL-12基因转导的DC可促进Th细胞对相应抗原应答后分化发育为IFN-γ产生型的Th1细胞。利用HLA-A201亚型DC的初步研究结果显示，在其同时负载HBcAg_(50-69)和CD8~+T淋巴细胞的抗原表位p53_(264-272)多肽后，IL-12基因转导DC所诱导产生的自身淋巴细胞，在与表达HLA-201分子并装载了p53_(264-272)多肽的T2靶细胞作用后，IFN-γ的产生量明显高于未转DC所诱导的效果，反映了CTL效应的增强。上述结果表明：IL-12基因转导的DC是一种有效的能够增强机体细胞免疫应答的生物佐剂，在装载上相应的抗原表位后，将可能发展成为一种有效的治疗性疫苗。
参考文献：
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[5]. DNp73α基因修饰的树突状细胞抗肺癌的免疫学效应研究[D]. 胡义杰. 第叁军医大学. 2007
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[7]. DNp73α及恩度~(?)介导特异性杀伤肿瘤内皮细胞效应的研究[D]. 蒋力. 第叁军医大学. 2009
[8]. AAV介导抗原基因转染DC激活免疫效应细胞治疗肿瘤的研究[D]. 尤长宣. 第一军医大学. 2006
[9]. 突变K-ras基因修饰的肺癌树突状细胞疫苗体外活性检测和体内抗瘤作用的研究[D]. 喻璟瑞. 四川大学. 2004
[10]. 中国人IL-12基因的克隆、鉴定及其转导人树突状细胞后的抗原提呈功能的研究[D]. 曲春枫. 中国协和医科大学. 1999
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