王健美[1]2002年在《烟草MARs序列的克隆、功能研究及其在杨树中的应用》文中研究说明在转基因植物的研究中，常常出现转基因沉默现象，又叫转基因失活，这种现象对于植物基因工程的应用与作物改良是一大障碍。过去，人们常常通过去甲基化或改变启动子等方式试图缓解这一现象的发生，但效果甚微。近年，MARs序列的发现及功能研究为克服转基因沉默、培育外源基因高效表达的转基因工程农作物提供了一条有效的途径。本试验通过PCR方法从烟草基因组中分离出叁段MARs序列，并对其序列特征及其功能进行了分析研究，从中筛选出具有明显降低转基因沉默功能的强MARS序列，并将其应用于杨树基因工程育种。具体试验结果如下： 1．根据MARs序列的特征设计了两对引物，以烟草基因组DNA为模板进行PCR，得到了叁段MARs序列，分别命名为TM1(1165bp)、TM2(1002bp)和TM3(475bp)。将这叁段MARS序列与GenBank中的所有MARs序列进行DNA同源性比较，发现TM1与Rb7同源性高达99％，故认为二者是同一段MARs序列。而在GenBank中未发现TM2和TM3的同源性序列，将其作为两个新MARs序列在GenBank中注册，注册号码分别为：AF373415和AF373413。 2．序列分析表明，TM1、TM2和TM3富含AT序列，并且具有几个MARS序列中常见的DNA结构域，如：A-box、T-box、TATAAA、拓扑异构酶Ⅱ识别切割序列、DNA解旋序列等。 3．将TM1、TM2和TM3分别以顺式重复方向插入到pBI121的T-DNA结构域中，使MARs序列位于CaMV35S启动子控制的GUS基因两翼，构建了植物表达载体pBITMIGUSTM1、pBITM2GUSTM2和pBITM3GUSTM3，两段MARs序列之间的距离为2.9kb。 4．将上述叁个表达载体与不包含MARs序列的pBI121表达载体经农杆菌介导转化烟草，分别获得了24株、28株、15株和22株转基因烟草，PCR结果显示，MARs序列已经整合到其基因组中。 5．对获得的转基因烟草叶片进行GUS活性定量测定，发现这叁段MARs序列均能不同程度地提高GUS基因的整体表达水平。与不包含MARs序列的转基因植株相比，TM1、TM2和TM3分别使GUS基因的平均表达水平提高了1.4倍、5.1倍和1.3倍；使转化群体中最高单株GUS基因表达水平分别提高了1.7倍、7.4倍和2.2倍。但是此叁段MARs序列均未能降低由位置效应引起的各转化体之间的转基因表达差异。将pBITM2GUSTM2高效表达载体申请了专利。 6．组织化学染色分析表明，MARs序列对外源GUS基因的瞬时表达无影响。 7．从大豆中克隆得到抗真菌病害的几丁质酶基因，将其构建到高效表达载体pBITM2GUSTM2中替代GUS基因得到表达载体pBITM2chiTM2，将其与对照表达载体pBIchi分别经农杆菌介导转化杨树，目前已建立了杨树再生体系并获得抗性芽。
黄慧珍[2]2005年在《烟草和杨树核基质附着区（MARs）的分离及其功能分析》文中进行了进一步梳理核基质附着区 (Matrix Attachment Regions, MARs) 是与核基质(或核骨架)特异结合的DNA 序列,属于非编码序列,富含AT。通过与核基质的结合,它能使染色质形成独立的环状结构,调控基因的转录,减少由于位置效应引起的转基因沉默。MARs在抑制转基因沉默、提高转基因表达水平、消除转基因个体间表达水平的差异等方面起着重要的作用。 本文采用两种不同的方法分别从烟草和欧洲黑杨中分离出MARs,并把它们构建到植物表达载体中,研究它们对转基因表达的调控作用。 以PCR 方法从烟草基因组中扩增到两个DNA 片段(M14 和M17)的序列分析表明,它们具有90%A-T box,A-box,T-box,拓扑异构酶Ⅱ识别位点,自主复制序列(ARS,autonomously replicating sequences),碱基非配对区(BUR,base unpairing region),MAR 识别序列(MRS,MAR recognition sequence),复制起始点(ORI,origin of replication),弯曲DNA 序列(curved DNA motifs)等典型的MAR 序列特征。将它们分别构建到植物表达载体pCAMBIA2301 GUS 基因(uidA)表达盒一侧及两侧,通过农杆菌介导转化烟草。组织化学染色法定性检测GUS 活性表明,带有M14 和M17 的uidA 基因在转基因烟草中稳定表达。GUS 活性的定量检测表明,表达载体uidA 基因一端或两端连接有MAR 的转化烟草中,GUS 的表达水平与对照相比都有了明显提高,而uidA 基因两侧连有MAR 的载体其提高表达水平的效果优于一端连有MAR 的载体,可使GUS 活性增强3.14 倍,但不同转化个体之间表达水平的差异仍然明显。上述结果表明,所得DNA 序列为两条新的MAR 片段,并且具有提高转基因表达水平的功能。 采用高盐方法从欧洲黑杨悬浮细胞中分离到两个DNA 片段,并对它们的序列进行了详细的分析。发现它们具有MARs 序列的部分特征基元如:90%A-T box,A-box,T-box,拓扑异构酶Ⅱ识别位点,自主复制序列,碱基非配对区,MAR 识别序列,复制起始点,弯曲DNA 序列等。将它们构建到植物表达载体pCAMBIA1305.1 中GUS 基因(uidA)表达
程强[3]2003年在《银白杨×新疆杨和新疆杨转抗盐基因工程研究》文中进行了进一步梳理新疆杨和银白杨×新疆杨是在西北地区广泛种植的杨树品种，利用基因工程技术开展抗盐转基因研究，培育抗盐杨树新品种对西北地区生态环境和经济建设有着重要的意义。 本研究利用农杆菌菌株AGL1介导AhBADH基因，通过叶盘法转化新疆杨和银白杨×新疆杨，共获得新疆杨Km~r植株转基因植株17株，银白杨×新疆杨Km~r转基因植株21株。本研究对银白杨×新疆杨的组培再生体系进行优化，结果表明试验采用1／2MS BA0.25mg／L+TDZ0.002或0.004mg／L+IAA0.5mg／L为分化培养基时叶盘的分化率较高，可达到90.3％和78.1％。同时本实验优化了生根培养基配方，得出采用卡拉胶为凝固剂，1／2MS，IBA0.2mg／L生根率可达到100％。在此基础上，基本建立了高频的植物组培再生体系。 本实验研究了Km对银白杨×新疆杨叶盘分化得影响，实验结果显示，当Km加至15mg／L时叶盘未分化出芽，所以采用Km15-20mg／L筛选叶盘；对于叶柄，当Km加至25mg／L时其不能分化出芽，以此作为最低浓度筛选叶柄。为进一步加强筛选强度，本实验研究了Km对生根的影响，结果显示当Km加至10mg／L时，植株无法生根，因此可采用Km10mg／L进行生根时期的筛选。 通过银白杨×新疆杨的遗传转化体系进行了摸索，结果显示在共培养时加入乙酰丁香酮100mg／L及侵染15-20min，使用较高的细胞分裂素TDZ0.004mg／L时银白杨×新疆杨的转化率最高。另且用菌液直接侵染时得效果不佳。本实验共筛选叶盘3341片，得到抗性芽15个，转化率可达0.5％。 对新疆杨的Km~r植株进行了PCR检测，结果显示在17株抗性植株中有两棵是阳性植株。用1，3引物对新疆杨Km~r植株进行PCR扩增时发现了特异的条带。在用2，3引物扩增BADH基因3′端部分序列时，发现了所有的植株包括CK-都扩增出了特异的条带，且扩增出来的片段在300-400bp之间，而且在200bp的地方有一条模糊的条带CK-则没有这条条带。用1，2引物对银白杨×新疆杨转CpTI基因的植株进行PCR检测发现了特异的条带。 转基因植株的抗盐性测定正在进行中。
参考文献：
[1]. 烟草MARs序列的克隆、功能研究及其在杨树中的应用[D]. 王健美. 山东农业大学. 2002
[2]. 烟草和杨树核基质附着区（MARs）的分离及其功能分析[D]. 黄慧珍. 西北农林科技大学. 2005
[3]. 银白杨×新疆杨和新疆杨转抗盐基因工程研究[D]. 程强. 南京林业大学. 2003